PLoS ONE: Ginsenoside 20 (S) -Rg3 Mål HIF-1α til Block Hypoxi-induceret epithelial-Mesenchymale Transition i kræft i æggestokkene Cells

Abstrakt

Prognosen for patienter med kræft i æggestokkene er forblevet fattige primært på grund af aggressiv cancer progression. Da epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er en vigtig mekanisme mediering invasion og metastase af cancerceller, målretning EMT proces med mere effektive og mindre toksiske forbindelser til at inhibere metastase er af stor terapeutisk værdi til behandling af ovariecancer. Vi har fundet for første gang, at ginsenoside 20 (S) -Rg3, en farmakologisk aktiv bestanddel af den traditionelle kinesiske urt

Panax ginseng

, potent blokerer hypoxi-induceret EMT af ovariecancerceller

in vitro

in vivo

. Mekanistiske undersøgelser bekræfter virkningsmåden af ​​20 (S) -Rg3, som reducerer ekspressionen af ​​hypoxi-inducerbar faktor 1α (HIF-1α) ved at aktivere ubiquitinproteasomvejen at fremme HIF-1α nedbrydning. Et fald i HIF-1α igen fører til opregulering via transkriptionel suppression af sneglen på den epitelcelle-specifik markør E-cadherin og nedregulering af mesenchymale cellespecifikke markør vimentin under hypoxiske betingelser. Vigtigere, -Rg3 20 (S) effektivt hæmmer EMT i nøgen mus xenograftmodeller af kræft i æggestokkene, lovende en roman terapeutisk middel til anticancer terapi

Henvisning:. Liu T, Zhao L, Zhang Y, Chen W, Liu D, Hou H, et al. (2014) Ginsenoside 20 (S) -Rg3 Mål HIF-1α til Block Hypoxi-induceret epithelial-Mesenchymale Transition i æggestokkene Cancer Cells. PLoS ONE 9 (9): e103887. doi: 10,1371 /journal.pone.0103887

Redaktør: Joseph Najbauer, University of Pécs Medical School, Ungarn

Modtaget 31. oktober, 2013; Accepteret: 4 jul 2014; Udgivet: 8 September, 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.973.429). Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ovariecancer, overvejende eksistere i form af epitelial ovariecancer (EOC), er det mest dødbringende gynækologiske malignitet [1], [2]. Den lave overlevelsesraten for patienter med ovariecancer er forbundet med dets onde karakter invasion og metastase. Blandt de kritiske bidragydere til invasive og metastatiske evne af ovariecancerceller er hypoxi af tumormikromiljøet [3], [4], som medierer tumorcelleinvasion og metastase ved stabilisering af hypoxi-inducerbar faktor-1 alfa (HIF-1α) [5], [6].

i normoksiske celler, er HIF-1α hydroxyleret af en familie af prolin hydroxylaser (PHD1-3) på Pro402 og Pro564, hvilket fører til en konformationsændring, der fremmer HIF-1α binding til von Hippel Lindau-protein (VHL) – en bestanddel af det store E3 ubiquitin ligase kompleks, der medierer proteasomalaktivitet nedbrydning af HIF-1α [7], [8]. Under hypoxiske betingelser, lavt iltindhold hinder prolin hydroxylering, hvilket fører til HIF-1α stabilisering og efterfølgende dannelse af en heterodimer med konstitutivt udtrykte HIF-1β. Det bioaktive HIF-1 dimer regulerer, som en transskriptionsfaktor, ekspressionen af ​​en bred vifte af gener involveret ikke alene i cellecyklus, apoptose [9], angiogenese [10], [11] og metabolisme [12] som svar på hypoksisk miljø, men også i en cellulær proces kaldet epitel-mesenkymale overgang (EMT) [13] – [15]

Identificerede først af fosterudviklingen, har EMT blevet fundet senere at være tæt involveret i processen med. cancer invasion og metastase [16], [17]. Under EMT processen celler undergår en overgang fra et polariseret epitel fænotype til en mesenchymal fænotype [18], en biologisk begivenhed karakteriseret ved cellemorfologi ændring fra en brolagte form til en dispergeret fibroblastoid form, tab af epiteliale cellespecifikke proteinmarkører og erhvervelse af mesenkymale cellespecifikke egenskaber og forbedret cellemotilitet og invasion. Mens en række faktorer, herunder vækstfaktorer og en hypoxisk mikromiljø demonstreres som inducere af EMT, er mange transkriptionsfaktorer, såsom snail bekræftet som vigtige mediatorer af EMT [19]. EMT undertrykker epitelcelle-specifik E-cadherin via indvirkning af forskellige mediatorer, der fører til tab af apikale-basal polaritet og celle-celle adhæsion junction, og opregulerer mesenkymale cellespecifik vimentin [20] resulterer i cytoskelettet omlejring og cellemotilitet ekstraudstyr. Disse begivenheder udgør de grundlæggende træk ved EMT på det molekylære niveau. Notatet er EMT også impliceret i anticancer lægemiddelresistens og hæmmer effektiv terapeutisk indgriben kræft i fremskredne stadier [21]. Selvfølgelig vil målrette EMT processen give en ny idé til kræftbehandling, især for ovariecancer-en tumor, der viser et stort potentiale til at metastaserer.

Ginsenosides er de farmakologisk aktive komponenter af

Panax ginseng

[22], der længe har været anvendt som en traditionel kinesisk medicin i officinelle eller helbredende formål [23], [24]. Til dato er der identificeret mere end 40 ginsenoside forbindelser [25]. Nogle af dem, RG1, Rg3, RH1 og Rh2 f.eks viser potent anticancer aktivitet [24], [26] – [28]. Ginsenoside Rg3, en bioaktive ekstrakter af

Panax ginseng

, har forskellige medicinske effekter, såsom anti-tumor [29] – [32], anti-oxidant, anti-inflammatoriske egenskaber [33], [34], hæmme ar hyperplasi af huden [35] og angiogenese [36]. Desuden stereoisomerer 20 (R) -Rg3 og 20 (S) -Rg3 er to optisk aktive chirale molekyler afviger i orienteringen af ​​hydroxyl (OH) -gruppe på carbon-20 [24]. Selv om begge er blevet rapporteret at inhibere tumormetastase [30], vises stereospecifity af Rg3 at være knyttet til deres bioaktiviteter. I denne undersøgelse har vi opdaget for første gang, at 20 (S) -Rg3 effektivt inhiberer hypoxi-induceret EMT af humane ovariecancerceller ikke kun

in vitro

men også i nøgne mus xenograftmodeller, lovende en hidtil ukendt naturligt middel for anti-kræft i æggestokkene terapi.

Materialer og metoder

Narkotika og antistoffer

20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 blev opnået fra tasly Pharmaceutical Company (Tianjin, Kina), og renheden var ≥99% som bestemt ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Rg3 stereoisomerer blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) i en 4 mg /ml stamopløsning og opbevaret ved -20 ° C. Portioner af stamopløsningen blev tilsat direkte til dyrkningsmediet

Følgende antistoffer blev anvendt:. Kanin antistof mod vimentin, VHL, museantistof til p-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), kanin antistof mod E-cadherin (Bioworld Technology, Louis Park, MN, USA), muse-antistof til HIF-1α (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), fåreantistof til PHD1 (R HIF-1α-revers, 5′-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3 ‘; PHD1-forward, 5’-AGGCTGTCGAAGCATTGGTG-3 ‘; PHD1- omvendt, 5’-GGGATTGTCAACGTGCCTTAC-3 ‘; PHD2-forward, 5’-AAGCCCAGTTTGCTGACATT-3 ‘; PHD2-reverse, 5’-TTACCGACCGAATCTGAAGG-3 ‘; PHD3-forward, 5’-AGCCCATTTTTGCCAGACTCC-3 ‘; PHD3-reverse, 5’-GATTTCAGAGCACGGTCAGTC-3 ‘; VHL-forward, 5’-GCAGGCGTCGAAGAGTACG-3 ‘; VHL- omvendt, 5’-CGGACTGCGATTGCAGAAGA-3 ‘; Snail-forward, 5’-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3 ‘; Snail- omvendt, 5’-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3 ‘; β-actin-fremadrettet, 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3 ‘; β-actin- omvendt, 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 ‘.

Western Blot

totalt celleprotein ekstrakter blev fremstillet ved at lysere celler i RIPA-buffer på is. Cellerne blev opsamlet ved skrabning og overført til mikrocentrifugerør. Prøverne blev kortvarigt lydbehandlet og centrifugeret ved 12.000 rpm i 30 minutter til fjernelse af uopløseligt debris. Supernatanten blev opsamlet og kvantificeret ved hjælp af Quick Start Bradford Protein Assay kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteiner blev kogt før de blev separeret ved elektroforese på natriumdodecylsulfat -polyacrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) geler og overført til nitrocellulosemembraner (Pall Life Science, NY, USA) under anvendelse af en våd transmembran indretning (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ , USA). Membranerne blev blokeret med 5% fedtfri mælk ved stuetemperatur i 1 time, probet natten over med primært antistof (E-cadherin 1:500, vimentin 1:2000, β-actin 1:1000, HIF-1α 1:500, PHD1 1:2000, VHL 1:1000) i TBST efterfulgt af inkubation med passende peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundært antistof (gede-anti-muse /kanin-IgG 1:2000, kanin anti-får IgG 1:1000) som angivet. ECL-reagens (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) blev anvendt til udvikling af blots. Alle værdier blev normaliseret for p-actin.

sårheling assay

Celler podedes på plader med 6 brønde 24 timer før behandling. Monolagene blev ridset med en 200 pi pipettespids og vasket med medier uden serum for at fjerne de løsnede celler. Celler blev holdt i medium uden serum under normoxi, hypoxi eller hypoxi i nærvær af 20 (S) -Rg3 i 24 timer. De sårede områder blev derefter filmede efter inkubation i en angivet periode.

cellemigrationsassay

Celler (1 x 10

5 /brønd) i 100 ul medier uden serum blev sat ind millicells med 8 um porestørrelse (Millipore Co., Bedford, MA, USA), indsat i brønde indeholdende RPMI 1640 med 20% føtalt bovint serum som kemotaktisk faktor. Efter 24 timers inkubation blev cellerne forbliver på den øvre overflade af filteret fjernes med en vatpind, og de migrerende celler blev fikseret med 5% glutardialdehyd efterfulgt af Giemsa farvning for kvantificering af celleantal. Antallet af migrerende celler i tre højeffekt områder af de nedre overflader af membranerne blev talt. Mindst tre brønde blev talt pr eksperiment.

Små interfererende RNA (siRNA) knockdown

Knockdown af PHD1 og VHL blev udført ved hjælp af specifikke siRNAs købt hos GenePharma Company (Shanghai, Kina). Sekvenser af siRNA’er er som følger: siPHD1-A, 5′-GCAUCACCUGUAUCUAUUATT-3 ‘; siPHD1-B, 5’-CCAACAUCGAGCCACUCUUTT-3 ‘; siPHD1-C, 5’-GCUAGCAUCAGGACAGAAATT-3 ‘; siVHL-A, 5’-CCACCCAAAUGUGCAGAAATT-3 ‘; siVHL-B, 5’-GUCUCAUUCUCAGAGUAAATT-3 ‘; siVHL-C, 5’-AACUGAAUUAUUUGUGCCAUCTT-3 ‘. En scrambled siRNA (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘) blev anvendt i parallelle forsøg som negativ kontrol. siRNA’er blev transficeret til SKOV3 og 3AO celler ved 40-50% konfluens med siRNA transfektionsreagens (Roche, Indianapolis, IN, USA) ifølge producentens anvisninger. Effektive siRNA’er blev screenet i henhold til resultaterne af real-time RT-PCR efter 48 timers inkubering og ved Western blot efter 72 t. Så de effektive siRNA’er blev transficeret ind i celler og inkuberet i 24 timer efterfulgt af hypoxi induktion med eller uden 20 (S) -Rg3 behandling i yderligere 24 timer. Effekten af ​​PHD1 og VHL tavshed om undertrykkelse af HIF-1α med 20 (S) -Rg3 blev vurderet på proteinniveau.

Luciferase reporter assay

Efter at være podet på plader med 24 brønde til 24 timer, celler blev transient transficeret med E-cadherin promotor luciferasereporterplasmid pGL2Basic-E-cadK1 (Addgene, Cambridge, MA, USA) og phRL-TK vektor (Promega, Madison, WI, USA). 24 timer senere blev cellerne behandlet med eller uden 20 (S) -Rg3 i hypoxiske indstillinger i 24 timer med normoxically dyrket transficeret celle som kontrol. Cellelysatet blev høstet 24 timer senere og luciferaseaktivitet blev målt ved et luminometer (Promega, Madison, WI, USA) ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). E-cadherin luciferaseaktivitet blev normaliseret med den for Renilla luciferase. Resultaterne blev opnået fra tre uafhængige forsøg og hver analyse indeholder tre brønde.

Dyreforsøg

Pasning og anvendelse af forsøgsdyr blev godkendt af den etiske komité af First Affiliated Sygehus, og var tilhænger til de institutionelle retningslinjer og etiske standarder. Alle seks uger gamle BALB /c nøgne hunmus blev huset i SPF barrier anlæg under en 12 timers lys /mørke-cyklus. Animal kropsvægte og subkutan tumor vinkelrette diametre blev registreret hver anden dag. Tumorvolumener blev beregnet efter formlen V = 0.5236 × (L × B

2) (V: tumor volumen, L: længde, W: bredde).

Til subkutan xenograft eksperiment, SKOV3 celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i PBS til en slutkoncentration på 2 x 10

7 celler /ml. 2 × 10

6-celler blev injiceret subkutant i flanken af ​​musene. 10 dage senere blev nøgne mus randomiseret til behandling (n = 4) og kontrolgruppen (n = 4). Mus i disse to gruppe blev behandlet ved intravenøse injektioner af enten 5 mg /kg af 20 (S) -Rg3 eller tilsvarende volumen PBS i halevenen hver anden dag derefter. Efter 30 dage på de eksperimentelle behandlinger, blev musene aflivet ved CO

2 asfyksi. Tumorprøver blev opsamlet og fikseret i 4% paraformaldehyd i 24 timer ved stuetemperatur, paraffinindlejret, og snittet til immunhistokemisk analyse.

I intraperitoneal xenograft model blev SKOV3-celler trypsiniseret og resuspenderet i PBS ved en koncentration på 1 × 10

8 /ml. Mus blev inokuleret med 1 x 10

7-celler i bughulen på dag 0. Fra dag 1, 5 mg /kg af 20 (S) -Rg3 (behandlingsgruppe, n = 7) eller tilsvarende volumen PBS (kontrol gruppe, n = 7) blev injiceret via hale-vene hver anden dag. Musene blev observeret dagligt og aflivet efter 30 dage. Obduktioner blev udført, formidlet tumorer blev resekteret fra mus, og ascitesvæske blev opsamlet. Total tumor vægt og volumen ascitesvæske i hver mus blev målt. Hele indholdet af dyreforsøg vi har rapporteret her, er i overensstemmelse med ANKOMMER retningslinjer.

Immunhistokemi

Histologiske objektglas blev fremstillet ud fra paraffinindlejrede ovariecancer vævsblokke. Prøver blev afvokset i xylen, rehydreret i en faldende alkoholserie efterfulgt af opvarmet i 0,01 M citratpuffer (pH 6,0) i en damper i 1,5 minutter for at hente antigene bindingssteder. Påvisning af antigener blev udført ved anvendelse inkubering med de primære antistoffer (E-cadherin 1:200, vimentin 1:400, HIF-1α 1:200), i 2 timer ved stuetemperatur efterfulgt af inkubering med HRP-mærket sekundært antistof ( MaxVision HRP-Polymer anti-Mouse /Rabbit IHC Kit, 1:200) ved stuetemperatur i 30 minutter og farveudvikling med DAB. Negative kontrolprøver blev inkuberet i PBS uden det primære antistof under de samme betingelser. Objektglas blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret i en stigende alkohol serie, og monteret til analyse. Digitale billeder blev erhvervet på et Olympus BH-2 mikroskop (Tokyo, Japan) installeret med DeltaPix Kamera og software (Maalov, Danmark).

Statistisk analyse

Statistiske forskelle blev bestemt ved to- tailed

t

-test eller Wilcoxon rank-sum test (kun for den mængde ascites). Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS-software (Chicago, IL, USA). Forskelle blev betragtet som signifikante (*) ved

P

0,05 og stærkt signifikant (**) ved

P

. 0,01 for alle sammenligning

Resultater

20 (S) -Rg3, men ikke 20 (R) -Rg3, blokerer hypoxi-induceret EMT i SKOV3 og 3AO ovariecancer celler

Vi først undersøgte effekten af ​​20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 på cellelevedygtigheden af ​​de to humane ovarie cancercellelinjer SKOV3 og 3AO i en serie af MTT-assays. Strukturerne af 20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 blev vist i fig S1-A. 20 (S) -Rg3 inhiberede cellevækst på en dosis-afhængig måde, hvilket giver anledning til IC

50 (inhiberende koncentration, hvor 50% cellelevedygtighed inhiberes) værdier på 146,8 og 242,6 ug /ml, henholdsvis for SKOV3 og 3AO celler 24 timer (eller 48 timer) efter behandling (fig S1-B.). Derimod 20 (R) -Rg3 viste ingen tilsyneladende inhibering af proliferation af begge celletyper ved koncentrationer op til 640 ug /ml (fig S1 AC).

Vi undersøgte dernæst evnen hos 20 (S) -Rg3 og 20 (R) -Rg3 at påvirke hypoxi-induceret EMT. Som vist i fig. 1A, når de udsættes for 1% O

2 i 24 timer både SKOV3 og 3AO celler undergik EMT karakteriseret ved en cellemorfologi ændring fra den stramme-junctioned brosten udseende til en dissocieret spindel-lignende form. Denne ændring var ledsaget af en signifikant nedregulering af epitel markør E-cadherin og en markant opregulering af den mesenchymale markør vimentin som afsløret ved Western blot-analyse (fig. 1B). Behandling af SKOV3 og 3AO celler med 20 (S) -Rg3 ved 80 ug /ml, 160 ug /ml, effektivt forhindret den morfologiske ændring der er associeret med hypoxi-induceret EMT (fig. 1A), i overensstemmelse med et forhøjet niveau af E -cadherin og et reduceret niveau af vimentin under hypoxiske betingelser (fig. 1B). I modsætning hertil behandling af SKOV3 med 20 (R) -Rg3 ved 80 ug /ml og 160 ug /ml til kroppen til at redde cellerne fra undergår EMT (fig. 1A), hvilket fremgår af uændrede niveauer af E-cadherin og vimentin under hypoxiske dyrkningsbetingelser (fig. 1C). For yderligere at bekræfte, at 20 (S) -Rg3 blokeret hypoxi-induceret EMT, celle mobilitet blev evalueret i sårheling og

in vitro

migration assays. Som vist i fig. 2A og B, mens hypoxi klart fremmet celle mobilitet og sårlukning, disse effekter blev stort set opvejet af behandlingen af ​​SKOV3 og 3AO celler med 20 (S) -Rg3.

(A) Celler blev først dyrket i fælles betingelse i 24 timer. For hypoxi induktion in vitro blev SKOV3 og 3AO celler inkuberet i en hypoxi kammer på 1% O

2, 5% CO

2 og 94% N

2 for en anden 24 timer uden (hypoxi) eller med Rg3 (hypoxi + Rg3) ved angivne koncentration i 24 timer. Kontroller blev dyrket under normoxiske betingelser (normoxi) i 24 timer. Cell billeder blev taget med et fasekontrast mikroskopi (100 ×). (B) Proteiner af celler eksponeret for normoxi, hypoxi og hypoxi plus 20 (S) -Rg3 blev høstet, og ekspression af E-cadherin og vimentin blev undersøgt ved Western blot under anvendelse af β-actin som et loading kontrol. Hypoxi fald E-cadherin-protein og øge vimentin protein, der blev vendt med 20 (S) -Rg3 co-behandling. (C) Effekten af ​​20 (R) -Rg3 på ekspressionen af ​​EMT markører i SKOV3 celler. blev ikke observeret nogen effekt af 20 (R) -Rg3 på ekspressionen af ​​hypoxi-induceret EMT markører. Alle behandlinger i denne figur blev udført tredobbelt.

(A) Cell mobilitet detekteres ved sårheling assay. Celler blev inkuberet under normoxiske betingelse i 24 timer efterfulgt af skrabe sammenflydende cellelag og udsættelse for normoxi, hypoxi eller hypoxi plus 20 (S) -Rg3 i yderligere 24 t. Lukningen af ​​bunden blev overvåget i 24 timer og fotografier blev vist ved 0 timer og 24 timer efter ridser. (B) Cell mobilitet undersøgt af

in vitro

migration assay. Normoxically dyrkede celler blev podet i millicells, efterfulgt af inkubation i 24 timer under normoxi, hypoxi eller hypoxi plus 20 (S) -Rg3 hhv. Antallet af celler, der passerede gennem membranen pr 20 × forstørret linse blev talt og anvendt til at repræsentere migrationen kapacitet af celler. Alle behandlinger i denne figur blev udført i tre eksemplarer og resultaterne vises som middelværdi ± SD. *

P

0,05, **

P

0,01,

t

-test

Tilsammen vores resultater kraftigt. viser, at 20 (S) -Rg3, men ikke 20 (R) -Rg3, er i stand til at vende hypoxi-induceret EMT ændringer i cellemorfologi, cellemarkører, og celle mobilitet, hvilket understreger dens potentielle funktion som en inhibitor af hypoxi-induceret EMT og EMT-medieret cancer metastaser.

20 (S) -Rg3 reducerer HIF-1α udtryk ved at fremme HIF-1α protein nedbrydning i en PHD1 /VHL /proteasom afhængig måde

for bedre at forstå den molekylære mekanismer, som 20 (S) -Rg3 blokke hypoxi-induceret EMT i æggestokkene kræftceller, vi analyserede udtryk for HIF-1α, en afgørende regulator af EMT, på både transkriptionelle og translationelle niveauer. Når de dyrkes i nærvær af 1% O

2 i 24 timer HIF-1α proteinniveau var forhøjet i SKOV3 og 3AO celler, mens HIF-1α mRNA niveau blev næsten ikke påvirkes. Behandling af cellerne med 20 (S) -Rg3 i øvrigt identiske hypoxiske indstillinger markant undertrykt HIF-1α ekspression på proteinniveauet med mRNA-niveauet uændret, hvilket viser, at HIF-1α var post-transkriptionelt reguleret med 20 (S) -Rg3 ( fig. 3A og B).

(A) Samlet RNA fra celler udsat for normoxi, hypoxi eller hypoxi plus 20 (S) -Rg3 henholdsvis i 24 timer blev ekstraheret. Real-time RT-PCR-analyser blev udført for at analysere effekten af ​​20 (S) -Rg3 på HIF-1α mRNA niveau, og der blev ikke konstateret ændringer. (B) Celler dyrket i 24 timer under normoxi, hypoxi eller hypoxi plus 20 (S) -Rg3 henholdsvis blev overvåget ved Western blot for deres ekspression af HIF-1α. 20 (S) -Rg3 forstyrret hypoxi-induceret HIF-1α augmentation. (C) MG132 blokeret inhiberingen effekt på 20 (S) -Rg3 på HIF-1α proteinniveau. HIF-1α proteinniveauer blev sammenlignet blandt hypoxiske celler, hypoxiske celler co-behandlet med 20 (S) -Rg3, og cellerne forbehandlet med 20 pM MG132 i 30 minutter efterfulgt af eksponering for hypoxi og 20 (S) -Rg3 i 24 timer. (D) Celler udsat for normoxi, hypoxi og hypoxi i nærvær af 20 (S) -Rg3 henholdsvis blev vurderet ved real-time PCR for transkription af PHD1, PHD2, PHD3 og VHL. Efter 20 (S) -Rg3 behandling, transkriptionen af ​​PHD1 og VHL-generne, der var nedsat under hypoksi, blev forøget i både SKOV3 og 3AO celler. (E) Protein ekstrakter fra behandlede celler blev undersøgt ved Western blot for ekspression af PHD1 og VHL, med protein fra normoxically dyrkede celler som kontrol og β-actin som lastning kontrol. PHD1 og VHL faldt i hypoxiske celler. 20 (S) -Rg3 genvundet deres udtryk under hypoxi tilstand. Alle behandlinger i denne figur blev udført i tre eksemplarer og resultaterne vises som middelværdi ± SD. *

P

0,05, **

P

. 0,01,

t

-test

Siden reduktion HIF-1α protein var tæt relateret med proteinnedbrydning via ubiquitinproteasomvejen, blev 26S proteasom-specifik protease inhibitor MG132 anvendt til at undersøge, om 20 (S) -Rg3 fremmet proteasomalaktivitet nedbrydning af HIF-1α. Som vist i fig. 3C, forbehandling af 20 uM MG132 i 30 minutter under hypoxiske betingelser restaureret HIF-1α protein i SKOV3 og 3AO celler behandlet med 20 (S) -Rg3, hvilket viser, at 20 (S) -Rg3 nedreguleret HIF-1α i proteasomet -afhængig måde. Som medlemmer af PHD familie og VHL protein er kendte faktorer der medierer ubiquitin /proteasom-afhængige HIF-1α nedbrydning, effekten af ​​20 (S) -Rg3 på mRNA-niveauer af PHD1, PHD2, PHD3 og VHL blev undersøgt yderligere. Real-time PCR-data viste, at hypoxi konsekvent nedreguleret PHD1, PHD3 og VHL (fig. 3D). Denne virkning af hypoxi, især på PHD1 og VHL blev imidlertid vendt med 20 (S) -Rg3 i både SKOV3 og 3AO celler. Som forventet blev PHD1 og VHL protein niveauer stort set genoprettet, som det var tilfældet for mRNA, efter behandlingen af ​​SKOV3 og 3AO celler med 20 (S) -Rg3 at modvirke hypoxi-medieret nedregulering af PHD1 og VHL proteiner (fig. 3E).

for yderligere at belyse roller PHD1 og VHL i mediere aktiviteten af ​​20 (S) -Rg3 med hensyn til HIF-1α nedbrydning blev SKOV3 og 3AO celler transduceret med siRNA-PHD1 (siPHD1) eller siRNA-VHL (siVHL). Afhængige af real-time PCR og western blot, valgte vi to mest effektive siRNA for silencing PHD1 (siPHD1-A og siPHD1-B) og VHL (siVHL-B og siVHL-C) (figur S2), efterfulgt af hypoxi stimulering og 20 (S) -Rg3 behandling. Som bestemt ved Western blot, knock-down af PHD1 eller VHL inhiberede pro-nedbrydning effekt 20 (S) -Rg3 på HIF-1α (fig. 4A og B), med den virkning, siPHD1 mere signifikant end siVHL på HIF -1α protein opsving. Kollektivt antyder disse resultater, at 20 (S) -Rg3 blokeret hypoxi-induceret EMT af ovariecancerceller ved at aktivere PHD1- VHL- ubiquitin /proteasom pathway at lette HIF-1α nedbrydning.

Virkning af PHD1 ( A) og VHL (B) stilhed den 20. (S) -Rg3 undertrykt HIF-1α. SKOV3 og 3AO celler blev transient transficeret i 24 timer med siPHD1 eller siVHL, efterfulgt af inkubation under hypoxiske betingelser i yderligere 24 timer. Proteinet niveau af PHD1, VHL og HIF-1α blev derefter detekteret under anvendelse af western blot. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

20 (S) -Rg3 afskaffer hypoxi-induceret transkriptionel repression af E-cadherin gennem undertrykke Snail

Under EMT-processen, E-cadherin almindeligvis undertrykt af sine transkriptionelle repressorer herunder snail som selv er transkriptionelt aktiveret af HIF-1. For bedre at forstå, hvordan 20 (S) -Rg3 forhindrede hypoxi-induceret nedregulering af E-cadherin, undersøgte vi effekten af ​​20 (S) -Rg3 på Snail. Reverse transcription PCR-resultater viste, at hypoxia fremkaldte en drastisk forøgelse af Snail mRNA, som tilsyneladende blev inhiberet af 20 (S) -Rg3 (fig. 5A). Derfor blev opregulering af Snail protein stimuleret af hypoxi alvorligt svækket med 20 (S) -Rg3 behandling (fig. 5B). Salg

(A) SKOV3-celler blev dyrket i normal tilstand i 24 timer, og derefter dyrket i 21% O

2 (normoxi) eller 1% O

2 (hypoxi) eller 1% O

2 og 80 ug /m 20 (S) -Rg3 (hypoxi + 20 (S) -Rg3) i yderligere 24 timer. Snegl mRNA blev bestemt ved RT-PCR med β-actin som en indre kontrol, og standardiseret over niveauet stede i normoxically dyrkede celler. Ekspressionen af ​​Snail blev øget på mRNA-niveauet i SKOV3-celler efter hypoxi stimulering i 24 timer. 20 (S) -Rg3 behandling ophævet Snail opregulering forårsaget af hypoxi. (B) Celleekstrakter blev underkastet immunoblotanalyse til påvisning Snail proteinniveau, og β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Lavt Snail protein blev påvist i normoxically dyrkede celler, medens sneglen protein blev forøget i hypoxiske celler. 20 (S) -Rg3 reducerede hypoxi-induceret Snail udtryk. (C) Luciferase assay i SKOV3 og 3AO celler. E-cadherin promotoraktivitet blev reduceret betydeligt i hypoxiske celler. Fald i E-cadherin promotoraktivitet blev vendt ved 20 (S) -Rg3 co-behandling. Aktivitet af E-cadherin promotor ildflueluciferase konstruktioner blev normaliseret til den af ​​en cotransficeret

Renilla

luciferase konstruktion. Alle behandlinger i denne figur blev udført i tre eksemplarer, og værdierne er vist som middelværdier ± SD af tre eksperimenter. *

P

0,05, **

P

0,01, for

t

-test

For yderligere at undersøge, hvorvidt undertrykkelse. af Snail med 20 (S) -Rg3 var ansvarlig for inddrivelse af E-cadherin under hypoxiske betingelser blev en dual-luciferase reporter assay udført. En E-cadherin promotor-luciferase-reporterkonstruktion og en intern vektor kontrol stand til at udtrykke Renilla luciferase blev co-transficeret ind i celler. Hypoxi blev fundet at gøre næsten 50% tab af luciferase signalintensitet i både SKOV3 og 3AO celler, mens 20 (S) -Rg3 undertrykt hypoxiske virkninger og forårsagede en signifikant stigning i luciferase intensitet (fig. 5C). Disse resultater viste, at 20 (S) -Rg3 blokeret hypoxisk hæmning af E-cadherin promotor-aktivitet.

20 (S) -Rg3 hæmmer æggestokkene vækst og cancer EMT

in vivo

< Som vist i fig.