PLoS ONE: Genomisk Tab af Tumor suppressor miRNA-204 Fremmer Cancer Cell Migration og Invasion ved Aktivering AKT /mTOR /Rac1 Signaling og actin Reorganization

Abstrakt

Stigende tyder på, at kromosomale regioner, der indeholder microRNA er funktionelt vigtige i cancere. Her viser vi, at genomisk loci kodning miR-204 ofte går tabt i flere kræftformer, herunder kræft i æggestokkene, pædiatriske renale tumorer og brystkræft. MIR-204 viser drastisk reduceret ekspression i flere kræftformer og fungerer som en potent tumorsuppressor, inhibering af tumormetastase in vivo, når systemisk leveret. Vi viste, at MIR-204 udøver sin funktion ved at målrette gener involveret i tumorigenese herunder

hjerneafledt neurotrofisk faktor

(

BDNF

), en neurotrophin familiemedlem, som er kendt for at fremme tumor angiogenese og invasionsevne . Analyse af primære tumorer viser, at øget ekspression af BDNF eller dens receptor tropomyosin-relateret kinase B (TrkB) parallelt en markant reduceret ekspression af MIR-204. Vores resultater viser, at tabet af miR-204 resultater i BDNF overekspression og efterfølgende aktivering af den lille GTPase Rac1 og actin reorganisering gennem AKT /mTOR signalvejen fører til kræft celle migration og invasion. Disse resultater tyder på, at mikrodeletion af genomiske loci, der indeholder miR-204 er direkte forbundet med deregulering af centrale onkogene veje, der giver afgørende incitament for tumorvækst og metastase. Vores resultater giver en stærk begrundelse for at manipulere miR-204 niveauer terapeutisk at undertrykke tumor metastase

Henvisning:. Imam JS, Plyler JR, Bansal H, Prajapati S, Bansal S, Rebeles J, et al. (2012) Genomisk Tab af Tumor suppressor miRNA-204 Fremmer Cancer Cell Migration og Invasion ved Aktivering AKT /mTOR /Rac1 Signaling og actin reorganisering. PLoS ONE 7 (12): e52397. doi: 10,1371 /journal.pone.0052397

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: Juni 8, 2012; Accepteret: November 14, 2012; Udgivet: December 21, 2012 |

Copyright: © 2012 Imam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af William og Ella Medical Research Foundation tilskud (MKR), GCCRI starte fond (MKR), CPRIT fællesskab (BZ), National Institutes of Health (NIH) T32 uddannelse tilskud (YFC), og NIH /National cancer Institute kræft center tilskud (P30 CA054174-17). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Identifikation af kromosomale regioner, der huser onkogener og tumor-suppressor er afgørende for forståelsen af ​​tumoren patogenese og forbedrede behandlingsresultater [1]. Selvom flere kræftrelaterede gener er blevet identificeret i regioner med kromosomafvigelser [2], ekstra regioner med tilfældige eller tilbagevendende kromosomafvigelser husly faktorer vigtige i væksten kræft og progression mangler at blive identificeret. Nylige undersøgelser viser, at microRNA (miRNA) er én sådan gruppe af faktorer [3]. MiRNA er små, endogen, ikke-kodende RNA’er, der regulerer posttranskriptionel genekspression ved binding til 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) af mål-mRNA’er. MiRNA er kendt for at spille vigtige funktioner i flere biologiske processer, herunder udvikling og differentiering [4], og dereguleret ekspression af miRNA har været impliceret i flere humane sygdomme, herunder cancer [5]. Voksende tyder på, at miRNA kan fungere som onkogener eller tumorsuppressorgener [6].

I denne undersøgelse har vi fokuseret på kromosomale loci indeholder miR-204. MIR-204 er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i glatte muskelceller forkalkning samt endoplasmatisk reticulum stressrespons i trabekelværkcellerne [7], [8]. Desuden har de seneste rapporter vist lige så vigtige roller for miR-204 i tumorigenese, herunder reguleringen af ​​carcinogenese i perifere nerve kappe tumorer, og migration og invasion af endometriecancer cellelinjer [9], [10]. Men meget lidt er kendt om den mekanisme, hvormed MIR-204 regulerer onkogenese i almindelighed og tumorvækst og metastase i bryst- og ovariecancer i særdeleshed. Desuden er stort set intet ved om, hvorvidt miR-204 kan målrettes terapeutisk og hvordan miR-204 ekspression reguleres i kræft. Vores resultater viser, at kromosomale loci indeholdende MIR-204 ofte går tabt, hvilket resulterer i dens nedre ekspression i flere cancertyper. Vi viser, at MIR-204 virker som en potent tumorvækst og metastase lyddæmper. Vigtigere, vores resultater viser, at MIR-204 kan målrettes terapeutisk som systemisk tilførsel af MIR-204 inhiberede brystkræft lunge metastase uden at forårsage nogen hepatotoksicitet. Vi fandt, at MIR-204 virker som en tumorsuppressor ved at målrette funktionen af ​​gener associeret med tumorgenese, herunder

hjerneafledt neurotrofisk faktor

(

BDNF

). BDNF er et fysiologisk vigtig nerve vækstfaktor, som spiller en kritisk rolle i udviklingen af ​​nervesystemet ved at binde og efterfølgende aktivering af tyrosinkinasereceptor, tropomyosin-relateret kinase B (TrkB) [11], [12]. Desuden er BDNF /TrkB pathway rapporteret at have en kritisk rolle i tumorigenese da det fremmer proliferation, differentiering, angiogenese og tumorindtrængen [13]. Overekspression af BDNF /TrkB har også været impliceret i dårlig prognose af adskillige faste tumorer, herunder neuroblastom, ovarie-, bryst-, prostata- og lungekræft [14], [15], [16]. Vores resultater viser, at tabet af MIR-204 resultater i BDNF /TrkB overekspression og samtidig aktivering af AKT /mTOR /Rac1 signalvej, hvilket fører til actin reorganisering under kræft cellemigration og invasion. Disse resultater understreger den funktionelle betydning af kromosomale regioner, der indeholder specifikke miRNA i tumorvækst og metastase.

Resultater

Somatic Tab af miR-204 i kræft

At identificere miRNA, der er forbundet med afvigende kromosomale regioner i humane kræftformer, brugte vi i høj opløsning custom miRNA komparativ genomisk hybridisering (CGH) og high-density CGH offentlige domæne datasæt for æggestokkene, brystkræft og pædiatriske nyre- tumorer. Denne analyse viste adskillige miRNA i de minimale kromosomal sletning og forstærkning regioner i disse tumorer. Til at begynde at forstå den funktionelle betydning af kromosomal loci forbundet med miRNA i tumorigenese, vi første omgang fokuseret på miRNA udviser genomisk tab (Figur S1A). Den 9q21.12 kromosomale region, der indeholder miR-204 blev ofte tabt i 44,63% (158/354) af ovariecancer, 28% (10/35) af brystkræft og 40% (15/38) af pædiatriske nyre tumorer (figur 1A , 1B og fig S1B), hvilket yderligere bekræftet ved kvantitativ genomisk real-time PCR-analyse (figur 1C og 1D). Endvidere reduktion i niveauerne af modent MIR-204 også stærkt korreleret med dets genomiske DNA-indhold i alle tre tumortyper (Figur 1E-1G).

A, høj opløsning miRNA-CGH på udvalgte pædiatriske renale tumorer med (venstre) eller uden (højre) mIR-204 deletioner. Deletion af genomisk loci indeholdende miRNA er angivet med punkterede vinkelrette linjer. Røde og grønne prikker angiver position og værdi af hver probe afspejler kopiantals forandring, repræsenteret i tre eksemplarer på CGH array. Den grå trend linje repræsenterer den gennemsnitlige værdi af den tredobbelte probe for hver tumor. B, grafer opnået fra metaanalyse af høj opløsning CGH af ovariecancer (

n

= 354; fås fra TCGA), der repræsenterer en delmængde af tumorer med eller uden sletning. Sletningen af ​​genomisk loci indeholder miR-204 er angivet med stiplede vinkelrette linjer. C og D, allele PCR af MIR-204 genomisk locus i pædiatriske renale tumorer (C) og ovariecancere (D). Y-aksen viser log

2 forvandlet relative kvantificering værdier. Stiplede linjer viser tabet af kopi tærskel. E-G, grafisk repræsentation af QRT-PCR-analyse viser niveauer af miR-204 hos pædiatriske renale tumorer (

n

= 38, E), i fremskredent stadium ovariecancer (

n

= 11 , F) og, i brystcancer (

n

= 10; G), i forhold til normal matchede kontrol nyre (

n

= 38), normal ovarie væv (

n

= 5) og normale matchede brystvæv (

n

= 10).

MIR-204 retsakter som en potent tumorvækst og metastase Suppressor

drastisk reduceret ekspression af miR-204 i flere kræft væv fik os til at tage fat på rollen som miR-204 i tumorigenese. For at afgøre dette, vi først vurderet effekten af ​​miR-204 på forankring uafhængige vækst. Embryonal nyre HEK-293-celler (HEK-293-celler passeret mere end 52 gange er rapporteret at være meget tumorgene [17]) overudtrykker MIR-204 udviste reduceret kolonidannende kapacitet, der blev reddet med overekspression af en inhibitor af MIR-204 ( Figur 2A). Lignende resultater blev også opnået med MIR-204 overudtrykkende brystcancer MDA-MB-231 og ovariecancer SKOV3-celler (data ikke vist). For yderligere at bekræfte MIR-204 potentiale tumor suppressor-lignende aktivitet, høj passage HEK-293-celler, der stabilt overudtrykker enten MIR-204 eller et kodet sekvens blev injiceret ind i nyren kapsler af nøgne mus og tumorvækst og metastase bedømmes 24 dage efter injektion . I skarp kontrast til at kontrollere tumorer, blev MIR-204 overudtrykker tumorer drastisk reduceret i størrelse (figur 2B). Dernæst undersøgte vi, om MIR-204 inhiberer også tumorcelleinvasion. Histologisk analyse af xenograft tumorsektioner angivet drastisk nedsat eller ingen invasivitet af tumorer i nyrevæv der overudtrykkes MIR-204 sammenlignet med kontrol (figur 2C). I overensstemmelse med dette, miR-204 overekspression drastisk reduceret de vandrende og invasive kapacitet brystkræft (MDA-MB-231) og ovariecancer (SKOV3) celler (figur 2D og data ikke vist) in vitro.

A , mIR-204 inhiberer forankringsuafhængig vækst. Næringsstof forbrug (venstre) og graf (højre) viser antallet af kolonier dannet i blød agar brøndene ved HEK-293-celler, der stabilt overudtrykker enten scramble eller MIR-204, yderligere transficeret med MIR-204-inhibitor. (*)

P

0,05; (**)

P

0,01. Resultater er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg. B, MIR-204 overekspression hæmmer tumorvækst. Fotografi viser repræsentative for tumorvækst i

rag2

– /-, yc

– /- SCID-mus injiceret (i nyrerne kapsel) med HEK-293 celler stabilt overudtrykker enten scramble kontrol eller miR -204. Søjlediagram viser betyde tumor volumen for miR-204 (

n

= 9) og scramble (

n

= 9) transfektanter. (*)

P

0,001. C, histologisk analyse af snit fra tumorxenografter overudtrykker enten scramble (kontrol) eller MIR-204. Billeder, der er vist i højre panel repræsenterer forstørret billede af boxed region er angivet i venstre panel. Tumorinvasion i kontroltransfektanter afspejles af invasionen af ​​tumor i nyrevæv. D, basalmembranmatrix invasion assay af MDA-MB-231-celler transficeret med 75 nM scrambled sekvens (kontrol) eller MIR-204 mimic (MIR-204) eller MIR-204 mimic transficerede celler yderligere transficeret med MIR-204 inhibitor (miR- 204 + inhibitor). Søjlediagram viser det gennemsnitlige antal invaderede celler tælles mikroskopisk i fem forskellige felter pr filter. (***)

P

. 0,001

Terapeutisk målretning af miR-204

For yderligere at underbygge metastaser suppressor aktivitet af miR-204 vi udførte terapeutiske eksperimenter i brystkræft lunge metastase. Vi først etableret lungemetastaser ved haleveneinjektion af MDA-MB-231 brystcancerceller udtrykker luciferase-GFP, og efterfølgende injiceret MIR-204 eller MIR-204 mutant oligo (negativ kontrol) i halevenen af ​​nøgne mus hver 5 dage for 30 dage ved hjælp af LANCErII, et lipid-baserede in vivo levering køretøj. Interessant, systemisk levering af miR-204 resulterede i signifikant reduktion eller eliminering af lungemetastaser, mens miR-204 mutant oligo injicerede mus havde alvorlige lunge metastase, målt over perioden på 60 dage (figur 3A-3D og figur S2). Vigtigere, mus injiceret med MIR-204 viste ingen tydelige bivirkninger som afsløret ved fravær af hepatotoksicitet eller ændringer i legemsvægt (figur 3E og data ikke vist). Disse resultater indikerer, at MIR-204 kan være en sikker og levedygtig terapeutisk regimen til behandling af tumorvækst og metastase.

A, injektion af MIR-204 oligonukleotid i halevenen undertrykt lunge metastase. Levende bioluminescens billeder af mus injiceret med MIR-204 (

n

= 6) eller MIR-204 mutant (neg kontrol.

n

= 6) oligonukleotider under anvendelse af Xenogen In Vivo Imaging System ( IVIS) (Xenogen). Billeder blev taget efter subkutant injektion af 150 mg /kg D-luciferin substrat i PBS til bedøvede mus. B er tumormetastase volumen vurderes startende fra dag 10 indtil dyrene blev aflivet på dag 60. Brug af ROI-analyse, tumor lysintensitet blev beregnet i foton /s, hvilket svarer til antallet af levende celler in vivo. C, repræsentative lunge billeder, der viser GFP

+ ve foci (rød cirkel) i neg. kontrolgrupper. D, repræsentative lunge sektioner viser metastatiske foci i neg. kontrolgrupper. E, ingen hepatotoksicitet i MIR-204 injicerede mus. Sektioner af lever fra miR-204 injicerede mus viser ingen tegn på hepatotoksicitet. Tilstedeværelsen af ​​multifokale periportale lymfocytter er ikke usædvanligt, og er et almindeligt fund hos unge dyr.

MIR-204 Mål gener associeret med tumorgenese

For at forstå den mekanisme, hvormed miR-204 kan spille en rolle i tumorigenese, vi identificeret gener reguleres af mIR-204. Da de fleste miRNA handle for at mindske target mRNA-niveauer [18], udførte vi genekspression analyser på celler, der overudtrykker MIR-204 og bestemt de potentielle mål for MIR-204. Af generne ændres i MIR-204 overudtrykkende celler, nedreguleret gener er mest sandsynligt at være rettet direkte af MIR-204. Interessant flere af de nedreguleret gener er associeret med cancer-relaterede processer og fysisk eller funktionelt interagere med hinanden, som afsløret ved pathway-baserede analyser (Fig S3). Vi udførte detaljerede analyser på to sådanne gener:

BDNF

Ezrin Hoteller, som viste højere niveauer af ændring i vores microarray analyse og på samtlige forudsagte biologiske veje med højeste funktionelle berigelse betydning. BDNF med dets receptor TrkB vides at spille en kritisk rolle i tumorangiogenese og metastase; og Ezrin, et cytoskelet organisator protein, er blevet impliceret i tumorvækst metastase af flere voksne og pædiatriske tumorer, herunder osteosarcom, mammary og pancreatiske adenocarcinomer, ovariecarcinom samt rhabdomyosarcom og pædiatriske renale tumorer [19], [20], [21 ]. Desuden flere mål forudsigelse algoritmer, herunder SvMicrO [22], Bayesian beslutning fusion tilgang [23], og miRmate [24], som vi for nylig har genereret samt Targetscan [25] og Pictar [26], også forudsagt

BDNF

Ezrin

at blive ramt af miR-204. Desuden blev der fundet miR-204 bindingssteder skal evolutionært bevaret hele hvirveldyr, hvilket tyder på, at den har en vigtig regulerende funktion på tværs af en række arter. Vigtigere er det, miR-204 og

BDNF

/

TrkB

samt

Ezrin

udtryk viste en stærk omvendt korrelation i flere tumorer (Figur 4A-4C og figur S4A-S4C) .

A-C, øget BDNF udtryk korrelerer stærkt med lavere miR-204 udtryk i flere kræftformer. Grafisk fremstilling af QRT-PCR-analyse, der viser den inverse korrelation mellem miR-204 og

BDNF

i pædiatriske nyre tumorer (

n

= 38 A), avanceret stadie ovariecancer (

n

= 11, B) og brystkræft (

n

= 10, C), i forhold til normalt matchede kontrol nyre (

n

= 38), normal ovarie væv (

n

= 5) og normale matchede bryst væv (

n

= 10). D-H,

BDNF

er et respektabelt mål for miR-204. D, skematisk den formodede miR-204 bindende sekvens i

BDNF

3’UTR. E, HEK-293-celler blev co-transficeret med Renilla luciferase ekspressionskonstruktionen pRL-TK og ildflueluciferase konstruktioner indeholdende enten pMIR-

BDNF

3’UTR i fravær og nærvær af MIR-204 mimic eller pMIR-

BDNF

3’UTR mutant. Ildflue-luciferase aktivitet af hver prøve blev normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Middelværdi ± SEM for tre uafhængige forsøg (udført i dobbeltbestemmelse for hvert forsøg). (**)

P

0,01; (***)

P

0,001. F, QRT-PCR-analyse af miR-204 overekspression celler og celler transficeret med miR-204-hæmmere ved hjælp af

BDNF

-specifikke primere. G, western blot-analyse af HEK-293-celler transficeret med MIR-204 mimic anvendelse af anti-BDNF-antistof (1:1000). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Gel fotografier er repræsentative for tre uafhængige forsøg. H, grafisk repræsentation af band intensiteter kvantificeret ved hjælp af Total Labs TL100 1D gel analyse software (

n

= 3; Nonlinear). BDNF proteinniveauet til kontrol blev sat til 100.

For at validere vores microarray og målrette forudsigelse resultater, vi først undersøgt, om miR-204 mål

BDNF

/

Ezrin

ved at binde til det forudsagte sted i sin 3’UTR (figur 4D og fig S4D). Faktisk luciferaseaktiviteten af ​​en pMIR-reporterkonstruktion der indeholder

BDNF

eller

Ezrin

3’UTR blev signifikant undertrykt, hvilket blev yderligere reduceret i celler, der overudtrykker MIR-204 sammenlignet med konstruere uden 3’UTR (figur 4E og fig S4D). I modsætning hertil mutation af frøet sekvens i

BDNF

3’UTR-indeholdende konstruktionen ikke kun gendannede luciferaseaktivitet til nær den for vildtype-konstruktionen, men også afsmeltet transkripter fra disse konstruktioner ufølsom over for MIR-204 overekspression ( Figur 4E), hvilket bekræfter en specifik interaktion mellem mIR-204 og den forudsagte bindingssted i 3’UTR’er af disse gener. For yderligere at underbygge disse resultater, vi bestemt niveauerne af BDNF /Ezrin i celler, der overudtrykker miR-204. MIR-204 overekspression resulterede i signifikant reduktion af BDNF /Ezrin både på RNA og protein niveauer (Figur 4F-4H og fig S4E og s4f). Dernæst undersøgte vi hvorvidt BDNF og Ezrin er funktionelt vigtige mål for miR-204. For at løse, at vi udførte redningsforsøg. En indførelse af

BDNF

eller

Ezrin

reddet MIR-204 inducerede fænotyper, herunder forankringsuafhængig vækst, cellemigration og invasion (figur S5 og data ikke vist). Disse resultater tyder på, at miR-204-medieret regulering af

BDNF

Ezrin

er en vigtig begivenhed i kræft cellevækst, migration og invasion.

Tab af miR-204 aktiverer AKT /mTOR Signaling og Rac1 Translokation i cancerceller

for at bestemme den mekanisme, hvormed miR-204 kan udvise sin tumorvækst og metastase suppressor aktivitet, vi undersøgt effekten af ​​miR-204 om AKT /mTOR signalering som både BDNF og Ezrin er blevet vist at aktivere AKT pathway [27], og selektiv aktivering af AKT af mTOR er blevet vist at regulere kræft cellemigration og invasion [28]. Interessant MIR-204 overekspression resulterede i reduceret aktivitet af AKT og mTOR downstream mål 4E-BP1 og S6 (figur 5A). 4E-BP1 er en oversættelse inhibitor, der dissocierer fra eIF4E ved phosphorylering for at tillade proteintranslation, og S6 er et ribosomalt protein, hvis phosphorylering letter samlingen af ​​ribosomet og deraf translation af mRNA. For at bekræfte vores in vitro-resultater, vi analyserede udtryk for phospho-AKT (Pakt) og phospho-S6 (PS6) i tumor xenograft overekspression miR-204. Som vist i figur S6, blev niveauerne af Pakt og PS6 væsentligt reduceret, mens den samlede AKT og totale S6 niveauer forbliver uændret i tumorer overudtrykker MIR-204 sammenlignet med kontrolpatienter transfektant tumorer, som afsløret ved immunohistokemisk analyse. For yderligere at underbygge forestillingen om, at AKT /mTOR pathway er faktisk et vigtigt mål for miR-204, vi co-transficeret miR-204 med konstitutivt aktiv AKT T308D /S473D mutant og viste, at konstitutivt aktiv AKT reddet de negative virkninger af miR- 204 om downstream PS6 og phospho-4E-BP1 (p4E-BP1) niveauer (figur 5, sammenligne 5A og 5B). Imidlertid kunne vi ikke finde redningen af ​​negative virkninger medieret af miR-204 på Pakt niveauer i celler co-transficeret med konstitutivt aktiv AKT (figur 5B). Dette skyldes mutationen af ​​Ser

473 til Asp

473 i konstitutivt aktive AKT, og derfor anti-phospho-Ser

473-AKT antistof anvendes til Western blot-analyse kun detekteret endogent Pakt, som reduceres i niveau i nærværelse af mIR-204 (figur 5A og 5B).

A, mIR-204 undertrykker aktiveringen af ​​AKT og mTOR signalering. HEK-293-celler transficeret med MIR-204 blev dyrket i serumfrie betingelser og underkastet western blot-analyse under anvendelse af anti-phospho-Ser

473-AKT (1:1000), anti-total-AKT (1:1000) , anti-phospho-Ser

235/236-S6 (1:1000), anti-total-S6 (1:1000), anti-phospho-Thr

37 /46-4E-BP1 (1:1000 ) og anti-alt-4E-BP1 (1:1000). β-actin (1:10,000) blev anvendt som en loading kontrol. Gel fotografier er repræsentative for tre uafhængige forsøg. B, HEK-293-celler transficeret med konstitutivt aktiv AKT T308D /S473D mutant (CA-AKT) i fravær og nærvær af MIR-204 blev dyrket i serumfrit tilstand og underkastet western blot-analyse som descried i A. C, overekspression af mIR-204 afskaffer BDNF-induceret membran ruffling og Rac1 translokation. HEK-293-celler transficeret med MIR-204 eller MIR-185 blev dyrket i serumfrie betingelser og behandlet med eller uden BDNF (100 ng /ml) i 10 minutter og farvet med Rac1 antistof (rød) og FITC-phalloidin (grøn) . Pile viser membran-ruffling regioner. D, MIR-204 forøger følsomheden af ​​HEK-293-celler til apoptose som bestemt ved Annexin V /PI-farvning under anvendelse af FITC-Annexin V Apoptose Detection Kit. Den procentvise cellepopulation vist er middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg. E, western blot-analyse af HEK-293-celler transficeret med MIR-204 ved anvendelse af anti-caspase-3 (1:500) antistof og anti-PARP (1:1000) viser øget spaltning af caspase-3 og PARP. β-actin (1:10,000) blev anvendt som en loading kontrol. Gel fotografi repræsenterer tre uafhængige forsøg.

AKT styrer celle invasionsevne ved at regulere flere processer, der er involveret i actin organisation, celle-til-celle-adhæsion, og cellemotilitet [28], [29] , [30]. For at undersøge om MIR-204 kan spille en direkte rolle i denne proces, vurderede vi virkningen af ​​MIR-204 overekspression på aktiveringen af ​​den lille GTPase-protein Rac1, der funktionelt vekselvirker med AKT /mTOR og er rapporteret at spille en kritisk rolle i cellevandring og actin reorganisering efter induktion med BDNF [31] eller epidermal vækstfaktor (EGF) [28]. Stimulering af MDA-MB-231-celler (og SKOV3 eller HEK-293-celler) med BDNF eller EGF induceret membran ruffling og forårsagede Rac1 der skal omplantes til ruffling region (figur 5C, fig S7, og data ikke vist). I modsætning hertil blev membranen ruffling og Rac1 translokation ikke observeret i celler, der overudtrykker MIR-204 ved induktion med BDNF eller EGF (Figur 5C, fig S7, og data ikke vist). Unddragelse af apoptose, som er kritisk for tumorvæksten og progression [32] kunne være en anden mekanisme centralt for onkogenese i cancere, der udviser tab af MIR-204. Endvidere har øget AKT /mTOR aktivitet også blevet forbundet med nedsat apoptose i cancere [33]. Faktisk MIR-204 overekspression forårsagede en signifikant stigning i niveauerne af både aktiverede caspase-3 og poly ADP ribose polymerase (PARP), indikatorer for irreversibel beskadigelse af integriteten af ​​cellen og genomet, med en deraf følgende stigning i apoptotisk aktivitet (figur 5D og 5E). Tilsammen vores resultater tyder på, at tabet af MIR-204 fremmer tumorcellevækst, migration og invasion ved at aktivere dens målgener, der er kendt regulatorer af onkogen signaleringskaskade.

Discussion

Mange miRNA forbundet med cancere er kendt for at være lokaliseret til genomiske skrøbelige steder [34]. Men overraskende lidt om den funktionelle betydning af regioner med kromosomafvigelser indeholder miRNA. Det er sandsynligt, at de første genetiske skærme (med lavere komparativ genomisk hybridisering opløsning) tager sigte på at opdage kromosomafvigelser overset ændringer i genomiske regioner, der indeholder miRNA. Fordi miRNA påvirke flere gener i en eller flere veje, der regulerer cellevækst og apoptose og bidrager til tumordannelse når dereguleret, en nærmere undersøgelse af mindre genomiske regioner koder miRNA vil sandsynligvis give vigtig indsigt i den mekanisme for tumorigenese. Da foreslås fleste miRNA skal nedreguleres i kræft, mener vi, at mikrodeletion af genetiske regioner, der indeholder specifikke miRNA er en hyppigere begivenhed, der spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​menneskelige kræft og fortjener større opmærksomhed.

i denne undersøgelse giver vi bevis for, at mIR-204, der virker som en potent tumorvækst og metastase suppressor er somatisk tabt i humane cancere. Vi viser, at MIR-204 regulerer ekspressionen og funktionen af ​​pro-angiogeniske protein BDNF og dets receptor TrkB i tumorer. Vores resultater viser, at tabet af MIR-204 fremmer BDNF (eller EGF) -induceret kræft cellemigration og invasion ved at aktivere AKT /mTOR pathway fører til Rac1 translokation og actin reorganisering. Da AKT og Rac1 kræver hinanden for deres aktivering [28], [35], vores resultater tyder på, at tabet af miR-204-ekspression i humane tumorer kan inducere positive feedback loop mellem BDNF /Akt1 /mTOR og Rac1 under kræftcellen migration og invasion. Støtte dette, har både mTOR komplekser mTORC1 og mTORC2 blevet rapporteret at regulere motilitet og metastase af colorektal cancer via Rac1 signalvejen [36], og Rac1 er blevet vist at samtidigt regulere mTORC1 og mTORC2 [37]. Endvidere BDNF, som aktiverer GTP-bundne Rac1 niveauer [38], er blevet vist, at være blokeret af mTOR inhibitor rapamycin [39]. Disse undersøgelser, sammen med vores resultater viser reducerede niveauer af Pakt /pS6K i cellelinjer og i tumorer overudtrykker MIR-204, indikerer stærkt, at BDNF /AKT /mTOR /Rac1 signaleringskaskade er en af ​​de vigtigste mål for MIR-204. Fremtidige undersøgelser med henblik på at løse effekten af ​​miR-204 på mTORC1 og mTORC2 komponenter såsom Raptor /Sin1 vil sandsynligvis give yderligere indsigt. Svarende til BDNF, viser vores resultater, at MIR-204 inhiberer EGF-induceret aktivering af Rac1. Dette er væsentligt, da krydstale mellem EGFR og BDNF receptor TrkB har vist sig at fremkalde kræft celle migration [40] og respons på EGF er et vigtigt skridt i kræftcellen invasion og er direkte forbundet med metastaser [41]. Disse iagttagelser antyder, at MIR-204 kan have en bredere rolle i ændring vækstfaktor-induceret kræft cellemigration og invasion i almindelighed. Ud over cancer cellemigrering og invasion, kan aktivering af BDNF /TrkB signalering også bidrage til omgåelse af apoptose i MIR-204 udtømte celler som BDNF /TrkB overekspression er blevet forbundet med stabilisering og aktivering af AKT resulterer i nedsat apoptose [42]. I overensstemmelse med dette, vores resultater viser, at miR-204 overekspression resulterer i reduceret phosphorylering og aktivering af mTOR downstream mål 4E-BP1 og S6 kinase.

Fordi miR-204 har bopæl inden for

forbigående receptor potentielle kation kanal element 3

(

TRPM3

) genet, som er et medlem af transient receptor potentielle kanaler familie af proteiner, der vides at være vigtige for cellulær calcium-signalering og homeostase, vil det være fristende at spekulere i, at fænotyper associeret med den genomiske tab af kromosomale loci indeholder miR-204 kan også bidraget med værten genet

TRPM3

. Vores resultater viser undertrykkelse af tumorvækst og metastase efter indføring af MIR-204 alene, og ingen ændring i niveauerne af

TRPM3

gen i MIR-204 efterligner eller inhibitor overudtrykkende cancerceller (fig S8), foreslår tydeligt, at miR-204 forbundet tumor suppressor fænotype er ikke medieret gennem

TRPM3

. Men vi kan ikke udelukke, at miR-204 og sin vært gen

TRPM3

virker synergistisk for at regulere undertrykkelse af tumorvækst samt tumor celle migration og invasion. Da en konkret rolle for

har TRPM3

i tumorigenese ikke blevet rapporteret, en detaljeret undersøgelse af,

TRPM3

potentiale tumor suppressor rolle og synergieffekt med miR-204 (hvis nogen) vil være genstand for fremtidige undersøgelser.

tilsammen vores resultater tyder på, at genetiske loci indeholder specifikke miRNA kan spille en kausal rolle i væksten af ​​kræft og metastaser ved at regulere nøglen onkogene vej. Evne miR-204 til at målrette

BDNF

/

TrkB

Ezrin

, der har betydelige roller i normale cellulære processer og er overudtrykt i aggressive kræftformer, viser, at miR -204 kan styre vigtige reguleringsmekanismer, dysregulering af som kan prædisponere normale udviklingsmæssige /differentiering begivenheder til at undergå transformation. Derfor vil strategier til anvendelse af MIR-204 som terapeutiske regimer har den fordel, at vende uhensigtsmæssigt aktiverede trin i cancerceller til en mere normal tilstand. Identifikationen af ​​miR-204 som en potent tumorsuppressor sammen med demonstration af dens terapeutiske potentiale og ubetydelig hepatotoksicitet etablere en stærk rationale for at udvikle miR-204 som et levedygtigt terapeutisk regimen til behandling af kræft.

Materialer og metoder

Normal og tumorvæv prøver og cellelinier

cellelinier, der repræsenterer pædiatriske renale tumorer (HEK-293, embryonal nyre cellelinie), ovarie (SKOV3) og bryst (MDA-MB-231) cancere anvendes til eksperimenter blev opnået fra ATCC og dyrket ifølge protokollerne leveret. Halvfjerds-seks pædiatriske renale tumorer og normal matchede nyre blev erhvervet fra Børnenes Oncology Group (Arcadia, CA). Elleve avancerede stadie æggestokkene tumorer og fem normale æggestokkene væv blev opnået fra UT MD Anderson Cancer Center (Houston, TX). Femten brystkræft væv og normale matchede væv blev opnået fra UT Health Science Center (San Antonio, TX).

RNA og protein Analyser

Total RNA blev ekstraheret fra tumorer og normale væv, samt som alle cellelinier, og blev underkastet QRT-PCR-analyse, som tidligere [43] beskrevne. Western blot-analyse blev udført som tidligere [43] beskrevne. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.