PLoS ONE: kombinationsbehandling med histondeacetylaseinhibitoren LBH589 og Stråling er en effektiv Regimen for prostatakræft Cells

Abstrakt

strålebehandling (RT) fortsætter med at være en af de mest populære behandlingsmuligheder for lokaliseret prostatacancer (Kasket). Formålet med undersøgelsen var at undersøge

in vitro

effekt af LBH589 alene og i kombination med strålebehandling på væksten og overlevelsen af Cap-cellelinjer og de mulige mekanismer radiosensibilisering af denne kombinationsbehandling. Virkningen af LBH589 alene eller i kombination med strålebehandling på to CaP-cellelinier (PC-3 og LNCaP) og en normal prostata epitelcellelinie (RWPE-1) blev undersøgt ved MTT og klonogene assays, cellecyklusanalyse, western blotting af apoptose -relaterede og celle check point proteiner og DNA dobbelt streng pause (DSB) reparation markører. Den immunfluorescensfarvning blev anvendt til yderligere at bekræfte DSB ekspression i behandlede CaP-celler. Vores resultater viser, at LBH589 inhiberede proliferation i både CaP og normale prostataepitelceller i en tid-og-dosisafhængig måde; lav-dosis LBH589 (IC

20) kombineret med RT stærkt forbedret effektivitet i celle drab i Cap celler; sammenlignet med RT alene, kombinationsbehandling med LBH589 og RT-induceret mere apoptose og førte til en støt stigning af sub-G1 befolkning og afskaffelse af RT-induceret G2 /M anholdelse, øget og vedvarende DSB, mindre aktivering af non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) /homolog rekombination (HR) reparation veje og et panel af cellecyklus relaterede proteiner. Disse resultater antyder, at LBH589 er et potentielt middel til at øge radiosensitivitet af humane CaP-celler. LBH589 anvendes enten alene eller i kombination med strålebehandling er en attraktiv strategi til behandling af human CaP

Henvisning:. Xiao W, Graham PH, Hao J., Chang L, Ni J, Power CA, et al. (2013) kombinationsbehandling med histondeacetylaseinhibitoren LBH589 og Stråling er en effektiv regime til prostatacancerceller. PLoS ONE 8 (8): e74253. doi: 10,1371 /journal.pone.0074253

Redaktør: Hari Koul, University of Colorado, USA

Modtaget: 8. oktober, 2012; Accepteret: August 2, 2013; Udgivet: 26 august, 2013 |

Copyright: © 2013 Xiao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af en Career Development Fellowship fra National Health Medical Research Council (YL), Australien; St George Hospital Cancer Research Trust Fund (PHG), Sydney, Australien; og Kina Scholarship Rådet (WWX), Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Aktuelle behandlingsmuligheder for lokaliseret CaP er strålebehandling (RT), kirurgi og endokrin behandling. Selvom aggressiv stråling bliver bedre biokemisk kontrol, større rektale og urinveje toksicitet forekom også [1]. Lokal fiasko efter RT forbliver 20% -35% i mellemrunder og højrisiko-CaP patienter [2], hvilket fører til øget metastaser og lavere overlevelse. Således undersøgelse af en ny kombination tilgang med en selektiv radio-sensibiliserende med RT for at forbedre er et presserende behov CaP radiosensitivitet.

histondeacetylaseinhibitorer (HDACi) er en ny gruppe af agenter, der er rettet mod histon deacetylase (HDAC) og lovende radiosensibilisatorer øjeblikket er under efterforskning. Radiosensibilisering af HDACi, såsom valproat [3] er blevet påvist i prækliniske undersøgelser. HDACi er en potent inducer eller regulator af cellulære adfærd, såsom apoptose, cellecyklus og DNA reparation processer. Det menes at udøve dets virkning hovedsageligt ved at modificere histon og chromatin strukturer, således modulere gentranskription [4]. Desuden kan disse acetylaser og deacetylaser også modulere cellefunktioner uafhængige af genekspression ved at virke på ikke-histon proteiner, såsom p21 [5], p53 [6], Ku70 [6]. Ved at optræde på en række histon og ikke-histon-proteiner, HDACi er stand til at mediere apoptose, cellecyklus, og DNA reparationsprocesser i en velorganiseret måde.

LBH589 er et hydroxamsyrederivat og et hidtil ukendt pan- HDACi [7]. Qian et al. rapporterede, at LBH589 alene reducerede angiogenese og tumorvækst i et PC-3 xenograft dyremodel [8]. Et fase I studie er blevet udført ved at behandle kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) patienter med oral LBH589 med eller uden docetaxel, viser lovende resultater til fremtidig klinisk anvendelse [9]. Disse resultater understøtter den hypotese, at LBH589 kan være nyttige i kombination med strålebehandling til behandling af lokaliseret CaP.

I denne undersøgelse vi hypotese, at LBH589 kunne dræbe CaP celler og behandling af Cap celler med LBH589 før RT ville øge følsomheden af Cap celler til RT.

Materialer og metoder

Kemikalier og antistoffer

LBH589 (panobinostat) blev købt fra Selleck kemikalier (Selleck Chemicals South Loop West, Houston, TX, USA). Andre anvendte kemikalier blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Pty Ltd, Castle Hill, NSW, Australien), medmindre andet er angivet. Primære og sekundære antistoffer anvendt i denne undersøgelse er anført i tabel 1.

antistof

Kilde

Skriv

Fortynding

Inkubationstid

Temperatur

Application

Kanin anti-human Caspase-3 (Pro) EpitomicsMAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-human Caspase-3 (Active) EpitomicsMAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant histon H3 (acetyl K9) AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-humant histon H4 (acetyl K8) AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-humant p21AbcamPAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant p-p53AbcamPAb1: 1000 grader /n4

° CWBMouse anti-human p53AbcamMAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant phospho-CDK1 (Tyr15) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant Cdk1 (cdc2) AbcamPAb1: 10000o /n4

° CWBRabbit anti-humant p-Chk-1AbcamPAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant Chk-1AbcamPAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant p-Chk-2AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-human Chk-2AbcamPAb1: 500o /n4

° CWBRabbit anti-humant phospho-Rb (Ser795) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant phospho-Rb (Ser807 /811) Cell Signaling TechnologyPAb1: 1000 grader /n4

° CWBMouse anti-human RbAbcamMAb1: 1000 grader /n4

° CWBMouse anti-human γH2AXAbcamMAb 1: 500 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4

° cIF WBRabbit anti- menneskelig Ku70EpitomicsPAb1: 1000 grader /n4

° CWBRabbit anti-humant Ku80EpitomicsPAb1: 1000 grader /n4

° CWBMouse anti-human BRCA1AbcamMAb1: 200 (IF) 1: 200 (WB) o /n4

° CWB, IFRabbit anti -human BRCA2AbcamPAb1: 200 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4

° CWB, IFMouse anti-humant RAD51AbcamPAb1: 100 (IF) 1: 1000 (WB) o /n4

° CWB, IFMouse anti -human GAPDHMilliporeMAb1: 500o /n4

° CWBMouse anti-human IgG1-negative controlDakoIgG11: 1000 grader /n4

° CIFGoat anti-kanin IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500.045 minroom temperatureWBGoat anti-muse-IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologyIgG1: 500.045 . minroom temperatureWBGoat anti-mus Alexa Fluor® 488 Dye ConjugateInvitrogenIgG1: 100045 minroom temperatureIFTable 1. Antistoffer anvendes til western blotting og immunfluorescensfarvning

Bemærkninger: Mab: monoklonalt antistof; o /n: overnight; PAb: polyklonalt antistof; WB: western blotting; HVIS: immunofluorescens; HRP: peberrod peroxidas CSV Hent CSV

Cell kultur

De androgen-ikke-responsive PC-3 og androgen-responsive LNCaP CaP-cellelinjer, og den normale menneskelige prostata RWPE-1-cellelinje blev opnået fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA). PC-3 og LNCaP-celler blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% (vol /vol) opvarmet føtalt bovint serum (FBS), 50 U /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin mens RWPE-1 celler blev dyrket i K-SFM medium suppleret med 0,2 ng /ml rekombinant epidermal vækstfaktor (rEGF) og 25 ug /ml bovin hypofyse uden FBS. Alle cellelinjer blev opretholdt i en fugtig inkubator ved 37 ° C og 5% CO

MTT assay

Cell proliferation blev evalueret i CaP og normale prostata cellelinier efter LBH589 behandling ved hjælp MTT-assay efter en offentliggjort fremgangsmåde [10]. Kort fortalt blev 2000 celler podet i plader med 96 brønde inkuberet i kulturmedier i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med en række koncentrationer af LBH589 (0 ~ 20 pmol /L) eller det samme volumen af DMSO kontrol i frisk medium i yderligere 24, 48 og 72 t. Absorbansen (OD) blev aflæst ved 560 nm på en BIO-TEC mikropladelæser (BIO-RAD, Hercules, CA, USA). Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange. Resultater repræsenteres som OD-forholdet af de behandlede og kontrolceller. IC

20 (20% hæmmende koncentration) af LBH589 på 24 timer blev beregnet og valgt af følgende eksperimenter.

Colony danner assay

PC-3, LNCaP og RWPE-1 celler blev anvendt til kolonidannende assays som tidligere beskrevet med mindre modifikationer [10]. Kort fortalt, 1,5 ~ 2 × 10

6 PC-3, blev LNCaP og RWPE-1-celler behandlet i 6 cm skål med LBH589 ved den respektive IC

20 koncentrationer eller samme volumen af DMSO (kontrol) i 24 timer og derefter 200 ~ 2 × 10

5-celler blev podet i 6 cm skåle. Efter 8 timer recovery blev LBH589-behandlede og DMSO-behandlede kontrolceller udsat for en enkelt dosis bestråling (0-8 Gy) ved stuetemperatur under anvendelse af en lineær accelerator (Elekta, Stockholm, Sverige) i en dosis på 2,7 Gy /min med 6 MV fotoner (Cancer Care Centre, St George Hospital, Sydney, Australien). Efter RT, blev alle celler straks vasket med medikamentfrit medium. Efter 14 dages inkubation blev celler farvet med krystalviolet. Kolonierne, defineret som grupper af 50 celler, blev bedømt manuelt ved hjælp af et Olympus INT-2 inverteret mikroskop (Tokyo, Japan). Data fra RT alene eller kombination behandlet (LBH589 og RT) celler blev normaliseret mod un-bestrålede celler (scoret som 100% kolonidannende evne).

Flowcytometrisk analyse for cellecyklusfordeling

0,5 ~ 2 × 10

6 PC-3 og LNCaP CaP-celler blev udpladet i 10 cm skål i 24 timer, derefter behandlet med LBH589 ved den respektive IC

20 koncentrationer eller DMSO (kontrol) i yderligere 24 timer før underkastet til 2 Gy RT. På specifikke tidspunkter (præ-RT, 2, 6, 12, 24, 48 og 72 timer efter 2 Gy), trypsinbehandlet adhærente og flydende celler blev samlet og fikseret i kold 70% (v /v) ethanol ved 4 ° C. Histogrammer af DNA-indholdet blev analyseret under anvendelse FlowJo software (V.7.6.1, Tree Star, Inc., Oregon, USA) for at bestemme cellecyklusfordeling (subs G1, G1, S og G2 /M).

immunfluorescensfarvning for γH2AX og HR reparationsvej proteiner

PC-3 og LNCaP CaP-celler blev behandlet med den samme protokol som beskrevet i cellecyklus-analyse (se ovenfor). Han modtog 2 Gy RT blev LBH589-behandlede og dSmo-behandlede celler underkastes immunfluorescensfarvning på specifikke tidspunkter (præ-RT, 24, og 72 timer efter 2 Gy). Fremstillingen celle til immunfluorescensfarvning blev som tidligere beskrevet med modifikationer [11,12]. De farvede celler blev undersøgt ved anvendelse af en FV300 /FV500 Olympus laser scanning konfokal mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) og billeder blev taget. For hver behandling tilstand, γH2AX, BRCA1, BRCA2 og RAD51 foci blev bestemt i mindst 50 celler. Optællingen af γH2AX, BRCA1, BRCA2, og RAD51 nukleare foci i disse celler blev udført af to uafhængige observatører (WWX og JLH).

Western blotting

PC-3 og LNCaP CaP celler behandlet med den samme protokol som beskrevet i cellecyklus-analyse (se ovenfor). LBH589-behandlede og kontrolceller blev underkastet 2 Gy RT. Både flydende og adhærerende celler blev opsamlet ved specifikke tidspunkter (præ-RT, 2, 6, 12, 24, 48 og 72 timer efter den 2. Gy) for western blotting som tidligere beskrevet [13]. Membraner blev inkuberet med forskellige primære antistoffer og peberrod peroxidise (HRP) -mærket sekundære antistoffer ved specifikke betingelser (tabel 1). ImageQuant LAS4000 systemet (GE Sundhedspleje, USA) blev anvendt til billedoptagelse.

Statistisk analyse

Alle forsøg blev udført mindst tre gange (n = 3). Resultater er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). For bestråling eksperimenter blev overlevelse fraktioner beregnet som følger: SF = [betyder plating effektiviteten af stråling (± LBH589) behandlede celler divideret med betyder plating effektiviteten af kontrol (± LBH589)]% Overlevelse fraktioner af kombination-behandlede celler blev korrigeret for cytotoksicitet af LBH589. RT overlevelse kurver blev monteret efter den lineære-kvadratisk model ved hjælp af GraphPad Prism 4.0 software (GraphPad, San Diego CA):

Survival = e

– (aD + βD

følgende parametre blev beregnet: α-værdi, β værdi, α /β-værdi, ID90, ID

50, og ID10 (RT dosis producere en overlevende fraktion på 10%, 50% og 90%, henholdsvis) ; og SF2 (overlevende fraktion ved 2 Gy). Den strålingssensibiliserende effekt af LBH589 var repræsenteret af dosen enhancement faktor (DEF), beregnet som ID

50 for RT behandlede celler divideret med ID

50 for kombination-behandlede celler [14]. To-ANOVA blev anvendt til at undersøge indflydelsen af RT dosis og LBH589 om resultatet parametre (fx overlevelse fraktion, cellecyklusfordeling, γH2AX foci nummer). En to-stikprøve t-test blev anvendt til at sammenligne den gennemsnitlige procentdel af subs G1, G1, S og G2 /M-fase-celler og middel γH2AX, BRCA1, BRCA2, RAD51 foci tal mellem specifikke to behandlingsbetingelser. Mulige signifikante forskelle (

0,05) blev evalueret ved hjælp af SPSS v 16,0 software (SPSS, Chicago, IL, USA)

Resultater

Effekten af LBH589 alene. på celleproliferation under anvendelse af CaP-celler og normale prostata epitelceller

tid og dosisafhængig celleproliferation inhibering virkning blev fundet i begge CaP-celler (PC-3 og LNCaP) og normale prostata-epitelceller (RWPE-1) (Figur 1A). IC

20 værdi ved 24 timer for PC-3, LNCaP og RWPE-1 var 10 pmol /l, 2,5 pmol /l, og 15 pmol /L, hvilket tyder på, at to CaP-cellelinier er mere følsomme over for LBH589 end . den normale prostata epitelial cellelinje

(a) Celler blev behandlet med en række koncentrationer af LBH589 i 24, 48 og 72 timer; (B) Celler blev behandlet med strålebehandling eller kombination med strålebehandling og LBH589 til analyse af kolonidannende effektivitet. Overlevelse fraktioner blev væsentligt reduceret i PC-3 og LNCaP CaP-celler (

0,01), men ikke i normale REWP-1 celler (

0,05); (C) Typiske billeder er vist for koloni vækst i RT og kombinationsbehandling (LBH589 og RT) i CaP og normale prostata celler. Alle resultater var fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Points, betyder; barer, SD.

Effekten af kombinationsbehandling på kolonidannelse hjælp CaP og normale prostata celler

strålingssensibilisering effekt af LBH589 på PC-3 og LNCaP blev indikeret ved signifikant reduceret overlevelse fraktioner (

= 0,0075 til PC-3,

= 0,0074 for LNCaP) og DEF i disse to cellelinjer 1 (1,77 til PC-3 og 1,29 for LNCaP) ( Figur 1B-C). Radiosensitivitet blev ikke signifikant forøget i RWPE-1 ved LBH589 forbehandling med DEF på 1,18 (

= 0,0823) (Figur 1B-C). RT parametre for RT alene og kombinationsbehandling i hver cellelinie er opsummeret i tabel 2. SF2, ID90, ID

50 og ID10 blev alle signifikant reduceret i PC-3 og LNCaP ved LBH589 forbehandling (

. 0,05), men ingen af disse ændret sig markant for RWPE-1

Cell linje

undergruppe

α værdi (Gy

-1)

β værdi (Gy

-2 )

α /β værdi (Gy)

SF2

ID90

ID10

DEF (forholdet mellem ID

50)

PC-3Radiation0.2590.0644.047*0.46*4.31*1.84*0.37*1.77LBH589-radiation0.5420.1194.5550.212.681.040.19LNCaPRadiation0.0280.0750.373*0.70*5.35*2.86*1.01*1.29LBH589-radiation0.0530.1180.4240.564.202.210.75RWPE-1Radiation1.0E-070.0382.6E-060.867.784.271.671.18LBH589-radiation0.0390.0420.9180.786.923.611.18Table 2. radiobiologiske parametre for stråling og LBH589-strålebehandling

Forkortelser:. SF2 = overlevende fraktion ved 2 Gy, ID90 = stråledosis producerer en overlevende fraktion på 90%, ID50 = stråledosis producerer en overlevende fraktion på 50%; ID10 = stråledosis producerer en overlevende fraktion på 90%, DEF = dosis enhancement faktor; *

. 0,05 vs. tilsvarende LBH589-stråling behandlede celler CSV Hent CSV

LBH589 alene kan inducere apoptose og histon acetylering i Cap celler

lav-dosis af LBH589 behandling (IC

20) i 24 timer induceret spaltning af fuld længde caspase-3 og acetylering af histon 3 (H3) og histon 4 (H4) i både PC-3 og LNCaP-celler (Figur S1), kan tyder LBH589 initiere apoptose pathway relateret til histonacetylering.

Effekt af kombinationsbehandling eller RT alene på cellecyklusfordeling

Procentdel af subG1 befolkning steget støt og betydeligt i kombinationen-behandlede celler sammenlignet med RT-behandlede celler i både CaP-cellelinjer (figur 2 og figur S2-S5), hvilket indikerer mere celledød herunder apoptose i kombination-behandlede celler. Ved RT-behandling alene, cellerne undergik midlertidig cellecyklus forsinkelse /G2 /M standsning mellem 2-24 timer, og derefter til sidst udvindes efter 24 timer. Følgelig RT reduceret G1 population mellem 2-24 timer og G1 genoptaget efter 24 timer (figur 2). Betragtninger, i kombinationsbehandling (LBH589 + RT), den LBH589 forbehandling på celler oprindeligt udløste en augment af G2 /M anholdelse ledsaget med faldet i G1 og S portioner. Kombinationsbehandlingen bringes derefter den efterfølgende og gradvis afskaffelse af alle G1, S og G2 /M populationer af behandlede celler med et minimum recovery (figur 2).

Procentdelen af subs G1, G1, S og G2 /M populationer blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri fra præ-RT til 72 timer efter RT;

0,01 (*): signifikant forskel i andelen af cellecyklus fase mellem den angivne tidspunkt og “Pre-RT” tidspunkt i RT-grupper;

0,01 (

#): signifikant forskel i andelen af cellecyklus fase mellem RT-gruppen og kombinationen gruppen ved “Pre-RT” tidspunkt;

0.01 (

): signifikant forskel i andelen af cellecyklus fase mellem den angivne tidspunkt og “Pre-RT” tidspunkt i kombination gruppe. Alle resultater var fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Points, betyder; barer, SD.

Forskelle i G2 /M subpopulation mellem kombination-behandlede og RT-behandlede grupper i hver hætte cellelinie blev også observeret. Celler, som kun modtog 2 Gy RT havde signifikant G2 /M arrest 6 ~ 12 timer efter RT i både PC-3 og LNCaP-cellelinjer, og G2 /M arrest varede i LNCaP-celler, indtil 48 timer efter RT. For kombination behandlede celler, initial LBH589 behandling forårsagede en signifikant stigning i G2 /M population procent forud for RT i begge CaP-cellelinier, og afskaffede yderligere G2 /M arrest efter efterfølgende 2 Gy RT (figur 2 og figur S2-S5).

kombinationsbehandling kan hæmme RT-induceret cellecykluskontrolpunkter aktivering i Cap celler

De mønstre af udtryk for disse checkpoint proteiner afveg i to CaP cellelinier efter RT alene eller kombineret behandling med LBH589 og RT er vist i figur 3. Som p53 er negativ i PC-3-celler, ekspression af både p21 og p53 forøget efter 2 Gy RT eller kombinationsbehandling i LNCaP-celler, men de er mere vedholdende i RT-behandling alene sammenlignet med kombinationsbehandlingen. Mønstrene for p21-ekspression i enkelte eller kombinationsbehandlinger i PC-3-celler er meget lig dem i LNCaP-celler. p21 i enten PC-3 eller LNCaP-celler og p53 i LNCaP-celler var ikke påviselig 24 h efter kombinationsbehandling fordi LBH589 forbehandling førte til gradvis nedsættelse af p21 og p53-ekspression (figur 3). Ekspression af p-CDK1 blev observeret i RT-behandlede celler før RT og var vedholdende indtil 72 timer efter 2 Gy RT i både PC-3 og LNCaP-celler; derimod dets ekspression var nedreguleret og endda blev upåviselig i kombination-behandlede grupper (figur 3). Udtrykket af total-Cdk1 (t-Cdk1) ikke ændrer sig med tiden, og forblev på samme niveau efter enkelt RT og kombinationsbehandling (figur 3).

Cell cyklus relaterede proteiner (p21, p-p53, p53, p-Cdk1, t-Cdk1, p-Chk1, t-Chk1, p-Chk2, t-Chk2, p-Rb795, p-Rb807 /811, t-Rb) og DNA skader og reparation relaterede proteiner (γH2AX, Ku70, Ku80, BRCA1, BRCA2, og RAD51) blev bestemt ved western blotting. t: Ændring i total protein niveauer upon DNA-skader; p: aktivering af DNA eller cellecyklus checkpoint proteiner (phosphoryleret form). Typiske billeder vises fra tre uafhængige forsøg (n = 3).

Ekspressionsniveauerne for total-Chk-1 (t-Chk-1) og total-Chk-2 (t-Chk- 2) (to vigtige checkpoint kinaser i cellecyklus kontrol) ved DNA-skader var stigende med post RT tid i RT alene gruppen. Tilsætningen af LBH589 ændrede ikke strålingsinduceret stigning i t-Chk-1 og t-Chk-2, men modvirkede stigningen på alle tidspunkter (figur 3). Kombinationsbehandling af LBH589 og RT førte til markant formindsket niveau af aktiveret Chk-1 og Chk-2 (p-Chk-1, og p-Chk-2) efter 6 timer efter RT behandling, sammenlignet med RT-behandling alene (figur 3) . forventes Ekspressionen af checkpoint proteiner til at beskytte celler mod stråling. Vores resultater antyder, at LBH589 kan påvirke både ekspressionen og aktiviteten af Chk-1 og Chk-2 således interfererende celle cycle management, når det kombineres med strålebehandling behandling. p-Rb795 og p-Rb807 /811 proteiner er vigtige checkpoints ansvarlige for G2 /M anholdelse af kræftceller til RT. Aktivering af disse to proteiner blev påvist i RT-behandlede celler, mens der ikke blev påvist eller meget svag ekspression af disse to proteiner i kombination-behandlede celler, hvorimod der ikke var nogen tydelig ændring detekteres for ekspressionen af total-Rb (t-Rb) (figur 3), hvilket betyder, at LBH589 forbehandling inhiberede RT-induceret aktivering af p-Rb795 og p-Rb807 /811. Tilsammen indikerer disse resultater, at ekspression og aktivering af disse cellecyklus-relaterede checkpoint proteiner ændres i kombination-behandlede grupper sammenlignet med RT alene-behandlede grupper.

Kombinationsbehandling kan inducere vedvarende DNA dobbeltstrengsbrud (DSB ) i Cap celler

DNA DSB blev undersøgt ved hjælp af γH2AX som en markør ved western blotting og fluorescens farvning. I 2 Gy RT-behandlede CaP-celler, ekspression af γH2AX begyndte at stige fra 10-15 min efter RT, toppede på 48 timer og 2 timer, for PC3 og LNCaP henholdsvis som vist ved Western blotting (figur 3). De γH2AX resultater fra Western blotting blev yderligere bekræftet ved immunfluorescensfarvning (figur 4). I modsætning til de celler behandlet med kombinationsterapi, γH2AX var moderat udtrykt i fasen forud for RT tidspunkt og var opreguleret på tidsskalaen i begge PC-3 og LNCaP-celler indtil 72 timer (figur 3). Antal γH2AX foci i kerner blev kvantificeret som vist i figur 4. Positive γH2AX foci var stadig påviselig 72 h efter 2 Gy RT i PC-3 og LNCaP-celler ved kombinationsbehandling. Disse resultater indikerer at DNA DSB fortsætter efter kombinationsbehandling sammenlignet med RT alene.

(A) Efter 2 Gy RT, gennemsnitlige γH2AX foci antallet steget betydeligt efter 24 timer i både PC-3 og LNCaP-celler og faldt til et lavere niveau på 72 timer, mens gennemsnitlig γH2AX foci nummer i kombination behandlet (LBH589 + 2 Gy RT) celler var signifikant højere end i RT-behandlede celler til enhver tid point og fortsatte med at stige indtil 72 timer. (B) Repræsentative billeder af γH2AX farvning efter 2 Gy RT eller kombinationsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.

s Restaurant 0,05 (†) angiver signifikant forskel mellem RT-behandlede celler og kombinationsprodukter-behandlede celler på samme tidspunkt.

0,05 (*) angiver signifikant forskel mellem celler på bestemte tidspunkter og celler, der modtager den samme behandling på “Pre-RT” tidspunkt. Points, betyder; barer, SD. N = 50. Typiske billeder vises fra tre uafhængige eksperimenter (n = 3). Forstørrelse × 60 i alle billeder.

Kombinationsbehandling kan mindske aktivering af non-homolog ende sammenføjning (NHEJ) reparation vej i Cap celler

Da vedvarende DNA DSB blev set i combination- behandlede celler, to NHEJ pathway proteiner (Ku70 og Ku80), der er ansvarlige for reparation af RT-induceret DSB blev yderligere undersøgt ved western blotting i RT og kombination-behandlede celler. Ekspressionsmønstre for Ku70 og Ku80 var forskellige for PC-3 og LNCaP-celler (figur 3). I PC-3 celler, blev positivt udtryk for Ku70 og Ku80 fundet 6 timer efter RT og øges gradvist indtil 72 timer efter RT hvorimod udtryk for Ku70 og Ku80 var målbart efter 48 h i kombinationsbehandling (figur 3). I LNCaP-celler blev positivt udtryk for Ku70 og Ku80 fundet ved alle tidspunkter for RT alene og kombinationsbehandling med LBH589 og RT, men ekspressionsniveauer af Ku70 og Ku80 var meget højere efter RT alene sammenlignet med kombinationsbehandling på alle tidspunkter (figur 3). Disse resultater indikerer NHEJ pathway var involveret i RT i Cap celler, og at forbehandling med LBH589 kan nedsætte dens aktivering sammenlignet med RT alene.

Kombinationsbehandling kan mindske aktivering af homolog rekombination (HR) reparation vej i Cap celler

BRCA-1, BRCA-2 og Rad-51 er DSB reparation proteiner i HR-vejen. Ekspressionen af disse proteiner blev i stigende grad induceret fra 2 h, indtil 72 timer efter enkelt RT ved Western blotting (figur 3). Sammenlignet med den alene RT-gruppen, udtryk for BRCA-1 og BRCA-2 proteiner i kombination behandlingsgrupper fulgte samme tendens, men blev ophævet efter 6 timer efter RT i begge cellelinier. Især blev ekspressionen af RAD51 protein opretholdes i et lavere niveau indtil 72 timer i PC-3-celler og blev markant reduceret indtil 24 timer i LNCaP-celler i kombinationsgrupperne (figur 3). De BRCA-1, BRCA-2 og Rad-51 skyldes western blotting blev yderligere bekræftet ved immunfluorescensfarvning (figur 5-7). Antallet af foci fra tre protein reparation markører i kerner blev kvantificeret som vist i figurerne 5-7. Resultaterne fra western blot var i overensstemmelse med de immunfluorescensfarvning resultater. Vores resultater tyder på, at ud over at påvirke NHEJ reparation vej, kan LBH589 også bevidstgøre RT via forstyrrende HR vej hvilket svækkede DSB reparation evne hætten celler.

(A) Efter 2 Gy RT, gennemsnitlig BRCA1 foci antallet steget signifikant efter 24 timer i både PC-3 og LNCaP-celler og opretholdes forøget ved 72 timer, mens gennemsnitlig BRCA1 foci nummer kombineret-behandlede (LBH589 + 2 Gy RT) celler også blev øget ved 24 og 72 timer, men var signifikant lavere end at i RT-behandlede celler. (B) Repræsentative billeder af BRCA1 farvning efter 2 Gy RT eller kombinationsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP-celler.

s Restaurant 0,05 (†) angiver signifikant forskel mellem RT-behandlede celler og kombinationsprodukter-behandlede celler på samme tidspunkt.

(A) Efter 2 Gy RT, gennemsnitlig BRCA2 foci antallet steget markant på 24 timer i både PC-3 og LNCaP celler og vedligeholdt forøget ved 72 timer, mens gennemsnittet BRCA1 foci nummer kombineret-behandlede (LBH589 + 2 Gy RT) -celler blev også øget ved 24 og 72 timer, men var signifikant lavere end i RT-behandlede celler. (B) Repræsentative billeder af BRCA2 farvning efter 2 Gy RT eller kombinationsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.

s Restaurant 0,05 (†) angiver signifikant forskel mellem RT-behandlede celler og kombinationsprodukter-behandlede celler på samme tidspunkt.

(A) Efter 2 Gy RT, gennemsnitlig RAD51 foci antallet steget markant ved 24 og 72 timer i både PC-3 og LNCaP celler, mens gennemsnitligt BRCA1 foci nummer i kombination-behandlede (LBH589 + 2 Gy RT) -celler blev også øget ved 24 og 72 timer, men var signifikant lavere end i RT-behandlede celler. (B) Repræsentative billeder af RAD51 farvning efter 2 Gy RT eller kombinationsbehandling (LBH589 + 2 Gy RT) i PC-3 og LNCaP celler.

s Restaurant 0,05 (†) angiver signifikant forskel mellem RT-behandlede celler og kombinationsprodukter-behandlede celler på samme tidspunkt.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi påvist, at LBH589 hæmmede væksten af PC-3, LNCaP CaP celler og RWPE-1 normale prostata epitelceller i en dosis og tidsafhængig måde, som svarer til tidligere rapporterede toksiciteter af andre hydroxamater [15]. Den normale prostata epitelcellelinie RWPE-1 var den mest modstandsdygtige over for LBH589 mens LNCaP var den mest følsomme af de tre cellelinier, hvilket antyder CaP-celler er relativt følsomme over for LBH589.

Det er blevet erkendt, at α /β værdi er væsentligt lavere i CaP end de fleste andre kræftformer. De α /p-værdier for PC-3 og LNCaP celler i den aktuelle undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere rapporter, som er mellem 0,5 og 4 Gy [16]. Når celler modtaget kombinationsbehandling (LBH589 og RT), blev de α /p værdier af PC-3 og LNCaP-celler steg til 4,555 og 0,424 Gy hhv. DEF var 1,77 til PC-3 og 1,29 for LNCaP. Den α /β værdi på RWPE-1 normal prostata-cellelinien var 0,243 og 0,257 Gy efter RT alene eller kombineret behandling, som er tilsvarende lavere end de to CaP-cellelinier. DEF var 1,18, som er mindre end den, PC-3 og LNCaP-cellelinjer. Disse resultater berettiger yderligere

in vivo

undersøgelse og kliniske forsøg.

I den aktuelle undersøgelse, viste vores resultater, at selv lav dosis af LBH589 (IC

20) i 24 timer behandling kunne udløse apoptose i Cap-celler (Figur S1) og den procentdel af de subG1 population celler i kombinationsbehandling af LBH589 og RT gradvist steget, mens det var konsekvent ganske lav i RT behandlede celler, hvilket betyder, at kombinationsbehandlingen kan fremkalde mere celledød.

Cellecyklusanalyse yderligere bekræftet, at flere PC-3 og LNCaP-celler blev blokeret i G2 /M-fasen efter 24 timers LBH589 behandling og procentdelen af celler i G1-fasen faldet betydeligt. Desuden behandling med LBH589 i 24 timer reducerede indhold af S-fasen af LNCaP-celler til et lavere niveau. I alle de cellecyklusfaser, G2 /M-fase celler er de mest følsomme over for stråling og S-fase celler er de mest modstandsdygtige [17]. Vores resultater antyder, at standsning af cellecyklus ved G2 /M og fald i S-fasen procentdel kunne være ansvarlig for radiosensibilisering virkning LBH589.

Kronisk sygdom

PLoS ONE: kombinationsbehandling med histondeacetylaseinhibitoren LBH589 og Stråling er en effektiv Regimen for prostatakræft Cells

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar