PLoS ONE: Molekylær profilering Flere Menneskelige Kræft Definerer en inflammatorisk Cancer-associerede Molekylær Mønster og afdækker KPNA2 som en Uniform Poor Prognostisk Cancer Marker

Abstrakt

Baggrund

Immun unddragelse er en af ​​de anerkendte kendetegnende for kræft. Inflammatoriske reaktioner på kræft kan også bidrage direkte til onkogenese. Da immunsystemet er hardwired at beskytte værten, er der en mulighed for, at cancere, uanset deres histologiske oprindelser, udstyre sig selv med en fælles og delt inflammatoriske cancerassocieret molekylær mønster (Icamp) at fremme oncoinflammation. Imidlertid er definitionen af ​​Icamp ikke været begrebsmæssigt og eksperimentelt undersøgt

Metoder og Resultater

Genom-dækkende cDNA udtryk data blev analyseret for 221 normal og 324 kræft prøver fra 7 cancertyper:. Bryst , prostata-, lunge-, tyktarms-, mave-, oral og pancreas. I alt 96 inflammatoriske gener med konstant dysregulering blev identificeret, heraf 44 opreguleret og 52 ned-regulerede gener. Proteinekspression blev bekræftet ved immunhistokemi for nogle af disse gener. Den Icamp indeholder proteiner, hvis roller i kræft har været impliceret, og andre, som endnu at blive værdsat. Den kliniske betydning af mange Icamp gener blev bekræftet i flere uafhængige kohorter af tyktarmen og æggestokkene kræftpatienter. I begge tilfælde bedre prognose korreleret kraftigt med høj

CXCL13

og lavt niveau af

GREM1, LOX, TNFAIP6, CD36

, og

EDNRA

. En “Inflammatorisk Gene Integreret Score” blev videreudviklet fra kombinationen af ​​18 Icamp gener i kræft i æggestokkene, der forudsagde den samlede overlevelse. Mærkbart, som en selektiv nuklear protein import hvis immuno-regulerende funktion bare begynder at dukke op, karyopherin alpha 2 (KPNA2) er ensartet opreguleret tværs kræftformer. For første gang, blev kræft-specifikke opregulering af KPNA2 og dens kliniske betydning verificeret af væv microarray analyse i kolon og hoved-hals kræft.

Konklusion

Dette arbejde definerer en inflammatorisk signatur deles af syv epitelial typer kræft og KPNA2 som en konsekvent opreguleret protein i kræft. Identifikation af Icamp ikke blot kan fungere som en ny biomarkør for prognosticering og individualiseret behandling af kræft, men også få betydelige biologiske implikationer

Henvisning:. Rachidi SM, Qin T, Sun S, Zheng WJ, Li Z (2013 ) Molekylær profilering af flere menneskelige kræftformer Definerer en inflammatorisk Cancer-associerede Molekylær Mønster og afdækker KPNA2 som en Uniform Poor Prognostisk Cancer Marker. PLoS ONE 8 (3): e57911. doi: 10,1371 /journal.pone.0057911

Redaktør: Matthew L. Anderson, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: 22 oktober, 2012; Accepteret: 29 Januar 2013; Udgivet: 25 marts 2013

Copyright: © 2013 Rachidi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev delvist støttet af pilotprojekter fra National Institutes of Health /National center for Research Resources (NIH /NCRR) giver P20 RR017696-05 og P20 RR017677; National Institute of General Medical Sciences (NIH /NIGMS) R01GM063265-09S1; PhRMA Fondens Forskningsenhed Starter Grant (til W.J.Z); T.Q. blev støttet af PhRMA Fondens Forskningsenhed Starter Grant, NIH /NCRR 5P20RR017677-10, NIH /NIGMS R01GM063265-09S1 og T32GM074934 07. Z.L. er støttet af NIH tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

forholdet mellem kræft og inflammation blev observeret så tidligt som i 19

århundrede, da Ronald Virchow beskrevne tumor-infiltrerende leukocytter. Men det var først de seneste to årtier, at den inflammatoriske mikromiljø er blevet anerkendt som et centralt element i carcinogenese, at blive involveret i kræft initiering, promotion og metastase [1]. Kroniske infektioner er etableret ætiologiske faktorer for mange humane cancere [2]. Tilsvarende kronisk inflammation, såsom inflammatorisk tarmsygdom og kronisk hepatitis øger risikoen for tyktarms- og hepatocellulære carcinomer, henholdsvis. I de fleste tilfælde er immun-overvågning menes at eliminere tumorigene foci [3]. Men kræft-initierende celler omprogrammere immunceller til at oprette en tumor-venlig mikromiljø og derved unddrager antitumor immunitet. Desuden kan kræft oplyse både medfødte og adaptive arme af immunsystemet gennem myeloide afledte suppressorceller [4], regulatoriske T-celler [5] og andre mediatorer, for at fremme vækst og invasion.

rolle af inflammation i carcinogenese begynder med tumorinitiering, via flere mekanismer som genotoksisk stress via reaktive oxygenarter, induktion af aktiverings-induceret cytidindeaminaseinhibitor (AID) [6], TNF-α-induceret optagelse af β-catenin til kernen [7 ] og andre. Beyond indledning, cytokiner aktiverer pro-tumorigene transkriptionsfaktorer, såsom STAT3 og NF-KB i eksisterende cancerceller [8]. Inflammatoriske celler også dæmpe antitumor immunitet gennem molekyler såsom indolamin-2,3-dioxygenase og arginase 1, som interfererer med funktionen af ​​T-lymfocytter [4]. Epiteliale-mesenkymale overgang også begunstiget af cytokiner, såsom TGF-β, fremme distale metastaser [9].

“Onco-betændelse” bidrager derfor til de forskellige kræft kendetegnende, herunder celleproliferation, angiogenese og flygte fra apoptose . Trods denne omfattende cross-talk mellem cancerceller og inflammatoriske mikromiljø, tilgangen til afdække kritiske spillere i dette samspil har hidtil været sporadisk og ikke-udtømmende. I denne undersøgelse har vi hypotesen, at der eksisterer et fælles inflammatorisk mønster blandt de forskellige typer cancer, som udgør en signaturprofil betegnes som Icamp. Vi udførte en omfattende analyse af genekspression på 7 almindelige epitelial typer kræft. En robust oncoinflammatory profil blev identificeret, viser uafhængige og stærke prædiktive værdier i kliniske resultater af flere kræftformer. Denne tilgang har også ført til opdagelsen og validering af KPNA2 som den mest konsekvent opreguleret protein i kræft.

Metoder

Etik Statement

Adgang til patientprøver og anonym analyse af data blev godkendt af Institutional Review Board for menneskelige forskningspotentiale på Medical University of South Carolina.

datasæt

Denne analyse omfattede genekspression profiler fra 7 typer af kræft. Et datasæt blev inkluderet for hver kræft type, hvilket resulterer i alt 7 datasæt. De kræftformer, der indgår i denne undersøgelse, er: bryst-, tyktarms-, lunge-, oral, prostata, bugspytkirtel og gastrisk kræft [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Datasæt blev opnået fra Gene Expression Omnibus (GEO) datasæt, en NCBI offentlig database. Hver af datasættene inkluderet microarray-mRNA-ekspression data fra kræft og normalt væv (tabel S1). Alle datasæt, der anvendes [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array platform for kvantificering af genekspression niveauer.

CDEP analyse på syv GEO datasæt

De syv epitelial kræft typer blev undersøgt at identificere gener, der viser konsekvent differentiel ekspression ved hjælp af nyligt udviklede konsekvent differential ekspressionsmønster (CDEP) metoden [17]. De rå microarray data, der sammenligner genekspression mellem normale og kræftceller blev hentet fra NCBI s GEO database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/) (tabel S1). Efter at have udelukket 10 adenom prøver i tyktarmen datasæt, blev 545 prøver undersøgt, hvoraf 324 var fra kræftvæv og 221 var normale. Udtrykket værdier af de udtages i bugspytkirtelkræft datasæt blev midlet. De rå datasæt blev præ-behandlet individuelt. For hver datasæt blev genekspression værdier justeret og normaliseret ved GCRMA tilgang implementeret i R [18]. Den falske opdagelse sats (FDR) af hvert gen på hver normaliserede datasæt blev beregnet under anvendelse permutation metode gennemføres af “RankProd” pakke i R [19]. Hvert gen i hvert datasæt blev derefter forbundet med en rå FDR, for at være op /ned-reguleret [17]. For gener ikke er til stede i platformen for et datasæt, blev medianen FDR værdien af ​​dette datasæt tildelt [17].

CDEP meta-analyse blev derefter anvendt til de rå FDRs af de syv datasæt. For hvert datasæt er falsk positiv-raten er defineret som sandsynligheden for en ikke-opreguleret gen bliver falsk kaldet som overudtrykte (eller en ikke-nedreguleret gen bliver falsk kaldet som undertrykt). Antallet af gener er opreguleret, nedreguleret, og ikke-differentielt udtrykt for hver datasæt blev estimeret ved en Beta blanding model implementeret i WinBUGS [20]. Baseret på denne sats og bruge uafhængige Bernoulli fordelinger, vi beregnet sandsynligheden for et gen, som skal fejlagtigt identificeres som over /under-udtrykt blandt de syv datasæt for hver FDR tærskel

l.

Proceduren blev evalueret ved at estimere falsk opdagelse sats (FDR

g) at observere den ovennævnte forventede log sandsynlighed, dvs. andelen af ​​falske positiver blandt generne identificeret at være konsekvent differentielt udtrykt. Den “null log sandsynlighed” blev beregnet ved at permutere de værdier i forhold til generne inden for hver datasæt, og derefter udføre de samme ovennævnte procedurer til at beregne den forventede værdi af “nul log sandsynlighed” i hver permutation

b

for hvert gen, idet der som et cutoff.

Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery (DAVID)

efter identifikation af de differentielt udtrykte gener på tværs af de 7 kræfttyper, det sæt af opreguleret og down-regulerede gener blev indgået DAVID database (https://david.abcc.ncifcrf.gov/), og dem med gen anmærkninger relateret til inflammation og /eller immunrespons blev udvalgt til yderligere analyse.

Menneskelig protein Atlas (HPAT)

Seks af de syv cancertyper og deres tilsvarende normale væv blev undersøgt for proteinet ekspressionsniveauet af alle de immunrelaterede gener ved HPAT (www.proteinatlas.org).

Oncomine Cancer database

Oncomine database (www.oncomine.org) blev anvendt til at identificere den kliniske betydning af immun-relaterede gener og deres evne til at forudsige patientens overlevelse og sygdom tilbagefald. X-flise software [21] blev anvendt til at bestemme de optimale cut-off point for at adskille lav risiko fra højrisikopatienter.

inflammatorisk Gene Integreret Score (IGIS)

IGIS for hver ovariecancer patient er summation af risikoen værdi på 18 Icamp gener med selvstændig prognostisk betydning demonstreret af uddannelsen datasættet [22]. Disse gener er

CCL28, CXL12, EDNRRB, GFRA1, GREM1, IL8, JAM2, LOX, MAL, MIF, MPZL2, PIGR, PTGER4, RSAD2, SERPINA5, TFF3, TNFAIP6 og TNFSF4

. Den prædiktive værdi af IGIS blev testet ved hjælp af et uafhængigt TCGA ovariekræft datasæt, baseret på afskæringsværdier forhånd bestemt af uddannelsen datasættet [22]. For en given patient, er værdien af ​​en gen, der giver dårlig prognose er dens relative risiko (RR), mens værdien af ​​et gen, hvis ekspression i patienten forudser bedre prognose blev sat til nul. Som et eksempel, hvis en patient A falder i højrisikogruppe for gener 1 og 2, men i gruppen lav risiko for gen 3, vil patientens IGIS være summation af relativ risiko for gen 1 og relative risikoen for at gen 2, idet værdien af ​​gen 3 er nul.

Ingenuity Pathway Analysis (IPA)

Brug af Ingenuity Pathway Analyse værktøj (www.ingenuity.com) blev inflammatoriske gener kortlagt i flere netværk, hver fremvisning over-udtrykt og under-udtrykte dem.

væv microarrays

Tissue microarrays (TMAS) for tyktarmskræft og hoved-hals kræft prøver indeholdt formalinfikserede, paraffin indlejret væv. Tyktarmskræft TMA’er blev udviklet fra patientprøver opnået på Medical University of South Carolina (MUSC), Charleston, SC, USA. Vores undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board. Den tyktarmskræft kohorte bestod af tumorer fra 55 patienter og tilstødende normalt væv fra 50 af dem, sammen med 15 lymfeknude metastatiske prøver. Hver af de normale og cancer prøver var mindst to gange. Klinisk og demografiske oplysninger, herunder alder, køn, histologiske type, kvalitet, tumor (T) og lymfeknude (N) etaper, samlet og tilbagefald overlevelse blev opnået fra Cancerregisteret af Hollings Cancer Center på Medical University of South Carolina . Hovedet-halscancer TMA blev opnået fra US Biomax, som indeholdt 60 hoved-hals skællede celle carcinomer og normale prøver fra 9 uafhængige patienter.

Immunhistokemi (IHC)

5-um sektioner var skæres fra TMA blokke. KPNA2 farvning blev udført under anvendelse af et kanin-polyklonalt antistof specifikt for humant KPNA2 (Abcam, Cat # 84440) ved 1:500 fortynding. Objektglas blev bagt i 1 time ved 60 ° C og de-paraffinized. Efter antigen-genvinding under anvendelse citratpuffer (pH = 6,0), blev endogen peroxidase standset under anvendelse af 3% H

2O

2 i dH

2O i 5 minutter og ikke-specifik binding blev blokeret med 2% normalt gedeserum i 3 timer ved stuetemperatur. Prøver blev inkuberet med anti-KPNA2 antistof ved 4 ° C i 16 timer efterfulgt af sekundært antistof (Vectastain ABC Kit, PK-4001) og udvikling med DAB-substrat (Vector Labs SK-4100). Farvning viste absolut specificitet til kernen uden mærkbar off-target-signal. KPNA2 kvantificering blev udført ved en kirurgisk patolog (S. S.), som blev blindet for patientens kliniske parametre. Kvantificering inkluderet nukleare farvningsintensitet (1: svag; 2: moderat, 3: stærk, men mindre intens end 4 og 4: intens). Og procentdelen af ​​positive kerner i alle tumorceller i en TMA kerne

Resultater

data-mining workflow og identifikation af konsekvent differentielt udtrykte gener i syv mennesketyper kræft

Rådata fra 7 datasæt (tabel S1) blev først opnået fra Gene Expression Omnibus (GEO). Hvert datasæt svarer til en cancer seværdighed: bryst-, tyktarms-, lunge-, oral, pancreas, prostata og gastriske cancere. Disse datasæt omfatter udtryk microarray profiler fra kræft væv og tilsvarende normale væv. Efter bestemmelse dysregulerede gener i hver kræft type, blev den Konsekvent Differential Expression Mønster (CDEP) metode anvendes til identifikation differentielt udtrykte gener på tværs af de syv datasæt. 911 gener blev opreguleret og 618 gener blev nedreguleret. Brug af DAVID blev disse gener derpå funktionelt klassificeret og immun-relaterede gener blev identificeret (figur S2, tabel S2). For yderligere at forbedre signal-til-støj-forhold, gener, som udviste en fold ændring (FC) 2 i fem eller flere cancertyper blev udelukket. Dette resulterede i en robust inflammatorisk profil, betegnet Icamp, af 44 opreguleret og 52 nedreguleres gener på mRNA-niveauet (Figur 1). Proteinet ekspression af Icamp blev verificeret ved IHC i 6 cancertyper: bryst, colon, lunge, pancreas, prostata og gastriske af minedrift det humane protein Atlas (tabel S3, fig S5). Den kliniske betydning af Icamp blev bestemt ved anvendelse Oncomine database. Endelig blev Ingenuity Pathway Analyse værktøj, der anvendes til at lokalisere funktionen af ​​Icamp i cancer-associeret inflammation.

Heat kort, der viser den 44 opreguleret og 52 ned-regulerede gener på tværs af de syv kræftformer, i tillæg til retningen af ​​dysregulering i kræft i æggestokkene. ↑, opreguleret. ↓, nedreguleret. ↔, uændret.

Identifikation af immun-relaterede gener

Blandt de op-regulerede gener i Icamp, blev de involverede i den positive regulering af lymfocytapoptose betydeligt beriget med 11,2 folder. Små kemokiner af CXC familie, såsom

CXCL9

,

CXCL10

CXCL11

blev beriget med 9,5 folder (figur S2A). Derudover blev tumorer også beriget med gener i andre immunologiske kategorier som vært-virus interaktion og respons på såret (figur S2A). Nedreguleret gener blev stærkt beriget for komplement komponenter i det alternative forløb (9,9 folder), T-celle-associerede gener, såsom CD8a, granzym A og mal, T celledifferentieringsfaktorer proteiner (7,3 folder) og gener involveret i regulering NK cellefunktion såsom lektin-lignende receptor underfamilie K, medlem 1 (

KLRK1

) (Figur S2B).

funktioner mange Icamp gener endnu ikke forstået. For eksempel blev KPNA2 vist at være opreguleret på tværs af et bredt spektrum af cancertyper (figur 1) [23], [24], [25], [26], [27]. Det er uklart, men hvis den mulige tumor-fremmende aktivitet af KPNA2 skyldes dens funktion som et nukleart transportør selektive immunregulatoriske proteiner, såsom STAT1 [28] og interferon-γ-induceret transkriptionsfaktor IRF-1 [29].

Angivelse af Icamp på proteinniveauet

for at undersøge protein udtryk mønster af Icamp gener, tog vi fordel af offentligt tilgængelige protein udtryk database, HPAT. Gener, der ikke udviser differentiel ekspression ved IHC blev ikke udelukket på grund af den begrænsede følsomhed af denne fremgangsmåde. Ved hjælp af IHC som en filtrering skridt ville udvide de falske negative observationer, begrænser kraften i denne undersøgelse. Men det var informativt at definere, hvilke gener viste protein ændringer i hvad kræftformer, da dette har direkte indflydelse på valg af gener for yderligere funktionelle analyser. For eksempel blev KPNA2 fundet at være forøget i alle typer cancer undtagen pancreascancer (figur 2). På den anden side, polymere immunoglobulin receptor (PIGR), et protein involveret i trans-epithelial transport af immunoglobuliner, er konsekvent nedreguleret i cancerceller (figur 2). Helt, proteinekspression data for 34 opreguleret og 38 ned-regulerede gener (total = 72) af de 96 gener (Tabel S3, fig S5). Af de 34 up-regulerede gener på mRNA-niveauet, blev 13 også opreguleret ved IHC i mindst 3 af 6 cancertyper undersøgt. Som for transkriptionelt ned-regulerede gener (38 blev undersøgt for protein-ekspression), 20 viste nedregulering ved IHC i ≥3 af de samme 6 kræfttyper.

Et eksempel på en opreguleret gen (KPNA2 ) (a) og en nedreguleret gen (PIGR) (B) i 5 kræfttyper på proteinniveauet. Numre svarer til de gennemsnitlige fold ændringer i mRNA-niveauer i alle 7 kræftformer i den aktuelle undersøgelse.

kliniske betydning af Icamp gener

Vi valgte siden bruge ovariecancer at studere betydningen af ​​Icamp gener baseret på to betragtninger. Først er de fleste af æggestokkene maligniteter er af epitel oprindelse, som er histologisk ligner de syv typer cancer, hvorfra genet profil blev defineret. For det andet blev ovariecancer ikke anvendt til at generere Icamp gener. Den prædiktive værdi af disse gener i kræft i æggestokkene vil validere nytten af ​​vores gen-opdagelse tilgang. Som kontrol blev de kliniske prædiktive værdier af disse gener også undersøgt i coloncancer. For at bestemme retningen af ​​dysregulering af hvert gen i kræft i æggestokkene, vi minerede 5 offentliggjorte datasæt [30], [31], [32], [33], [34] og en yderligere datasæt fra The Cancer Genome Atlas (TCGA) ( tabel S4), der tilsammen indeholder mindst 35 normale og 878 cancerpatienter prøver. Baseret på antallet af datasæt, der viser dysregulation i hver retning, blev hvert gen mærket som forhøjet, uforandret eller undertrykt i kræft i æggestokkene (figur 1). Et gen er fast besluttet på at være forhøjet, hvis 1) mindst 1 datasæt viser opregulering (p 0,05) og ingen af ​​de andre datasæt viser nedregulering, eller 2) mindst tre datasæt viser opregulering og ikke mere end en datasæt viser nedregulering (p 0,05). Den omvendte gælder for undertrykte gener. Baseret på det, blev 33 af de 44 up-regulerede gener også forhøjet i kræft i æggestokkene, 3 blev undertrykt og 8 kunne ikke bestemmes. Blandt de 52 ned-regulerede gener, blev 28 også undertrykt i ovariecancer, 7 var uændrede, 10 var forhøjet og 7 blev ikke fastslået (figur 1). Således mindst 61 ud af 96 Icamp gener samstemmende dysreguleret i kræft i æggestokkene.

Colon [35], [36], [37] og ovariecancer datasæt [22], [30], [38] , [39], [40] fra Oncomine samt TCGA tyktarmskræft datasæt, blev derefter analyseret for kliniske betydning af ekspressionsniveauet af individuelle Icamp genet. En række gener, såsom

CCL20

,

CD36

IL18RAP

individuelt viste signifikante korrelationer med kliniske variabler i tyktarmskræft såsom tumor stadie (T1 til T4), lymfeknuder node status (n0 til N2), metastase (M0 eller M1), patologisk bedømmelse (G1 til G4) og Duke fase (A til D) (figur 3A og 3B). I kræft i æggestokkene, blev alle de up-regulerede gener steget med mere fremskreden (

CXCL10

,

RIPK2

SPP1

) eller højere patologisk bedømmelse (

CXCL11

,

KPNA2

,

RSAD2

,

THOC4

og

TNC

) (Figur 4A). Som for ned-regulerede Icamp gener, mere fremskredne stadier tillægges højere udtryk for nogle gener (

CCL28

CFD

) og lavere udtryk for andre (

CLU

,

LEAP2

,

PIGR

TFF3

) (figur 4B).

Fire uafhængige undersøgelser blev analyseret for ekspression af angivne gener og deres kliniske betydning. Den lodrette akse repræsenterer den normaliserede ekspression intensiteten af ​​hvert gen i forhold til medianen intensitet hele genet prober. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse. Gener er opført i alfabetisk rækkefølge.

Samme som i figur 3, bortset fra at fem uafhængige studier af ovariecancer blev analyseret for ekspression af angivne gener og deres kliniske værdi.

Vi næste bestemmes, hvis Icamp genekspression niveau forudsiger overlevelse, baseret på rå microarray data for tyktarmskræft [37] og ovariecancer [22]. Gener, som viste forskellige ekspressionsniveauer mellem overlevende og ikke-overlevende på en, tre og /eller fem år blev testet af Kaplan-Meier-analyse (figur 5 og 6). I tyktarmskræft, blev bedre samlet overlevelse forudsiges med højere niveauer af GFRA1 og THOC4, og lavere niveauer af C7, GREM1, ISG15, LIFR, LOX, MMRN1, SCN4B, SPP1, TNC, TNFAIP6 og ZC3H8 (figur 5A). Den dysreguleret udtryk for mange Icamp gener også har betydelig prædiktiv værdi for kræft tilbagefald (figur 5B).

To datasæt fra Smith

et al.

[37] blev undersøgt for de angivne gener. Høj, patienter med forhøjet genekspression. Lav, patienter med lav genekspression. RR, relativ risiko. Gener er opført i alfabetisk rækkefølge. Rød: Forhøjet Icamp gen, Blå:.. Fortrængning Icamp gen

Rå genekspression data blev opnået fra Tothill

et al

[22] for (A) og (B), og fra TCGA for (C). Rød: Forhøjet i kræft i æggestokkene, Blå: Fortrængning i ovariecancer, Sort: Uændret eller ukendt. IGIS score blev beregnet på grundlag af alle de 18 gener, der er angivet i (A).

I fase IIIC kræft i æggestokkene, blev forbedret samlet overlevelse forbundet med højere mRNA-niveauer af IL8, MIF, MPZL2, PIGR, RSAD2 , SERPINA5 og TFF3, men lavere CCL28, CXCL12, EDNRB, GFRA1, GREM1, JAM2, LOX, MAL, PTGER4, TNFAIP6 og TNFSF4 (figur 6A). Den dysegulation af mange af disse gener forudsiger også fornyet overlevelse (figur 6B).

Interessant lavere ekspression af flere gener (GREM1, LOX, TNFAIP6, CD36, og EDNRA) forventet bedre prognose i både ovarie- og coloncancer. På den anden side, CXCL13 elevation forudsagt bedre prognose i begge sygdomme (figur 5 og 6).

For at bestemme den prognostiske værdi af Icamp gener som en gruppe, en inflammatorisk gen integreret score (IGIS) blev udtænkt til æggestokkene cancer (figurerne 6C). IGIS inkluderet 18 gener, som uafhængigt viste signifikant forudsigelighed (p 0,05) af Kaplan-Meier analyse. Denne score tager hensyn til antallet af gener, inden for hvilken patienten falder i risikogruppe højt, samt risikoen hvert af disse gener tildeler. Robusthed IGIS blev valideret ved hjælp af den uafhængige ovariecancer TCGA datasæt. Baseret på cutoff værdier forudbestemt fra grunduddannelsen datasæt over [22], scene IIIC patienter fra TCGA datasættet blev kategoriseret som enten høj eller lav risiko for hvert gen. Så for hvert gen, hvor en TCGA patient viser dårlig prognose, relativ risiko (RR forhånd bestemt af uddannelse datasæt) af dette gen blev sat til patienter IGIS score. De TCGA patienter i sidste ende var fordelt med forskellige Igis scores baseret på ekspressionsniveauer af alle 18 Igis gener. Vi fandt, at IGIS faktisk forudsagt samlet overlevelse (RR = 1,21, p = 0,02) (Figur 6C).

kliniske betydning af KPNA2 i colon adenocarcinom og hoved-hals planocellulært karcinom

Vi næste fokuseret på KPNA2 i colon adenocarcinom og hoved /nakke pladecellekarcinom, da KPNA2 overekspression ikke er blevet rapporteret i disse to cancertyper. KPNA2 er en nuklear /cytoplasmatisk protein involveret i import af udvalgte cytoplasmatiske proteiner ind i kernen. Det binder til kernelokalisering (NLS) af dets last protein og at karyopherin β1, og hele proteinkompleks translokerer tværs kernekappen gennem kerneporen kompleks (NPC) [41]. Blandt KPNA2 kunder er interferon-γ-induceret transkriptionsfaktor IRF-1 [29] og STAT1 [28], som begge er involveret i værtens immunrespons.

Vi undersøgte KPNA2 udtryk med immunohistrochemistry hjælp af vores i -house tumor microarray, som indeholder 55 primære tyktarmskræft prøver, 15 lymfeknudemetastaser og 50 tilsvarende tilstødende normale væv fra patienter med forskellige sygdomstilstande etaper. Vi fandt en drastisk stigning i KPNA2 ekspression i primære og metastatiske lymfeknuder colontumorer forhold til tilstødende normale væv (figur 7A, 7B og 7C). KPNA2 ekspression også korreleret med tumor (T) trin, hvor procentdelen af ​​positive celler steg fra T1 gennem T4 (T1: 6,4%, T2: 10%, T3: 20,6% og T4: 25,4%) (figur 7D). Da de fleste af patienterne var i T2 (n = 11) og T3 (N = 31) kategorier, fandt vi signifikant forskel i KPNA2 ekspression mellem T2 og T3 (p = 0,017). Forskellen var også signifikant mellem kombineret T1-T2 og T3-T4 etaper (p = 0,003) (Figur 7D). Endnu vigtigere, patienter med KPNA2 intensitet score ≥3 vises værre samlet overlevelse end dem med KPNA2 intensitet ≤2 (Relativ risiko = 1,9, p = 0,048) (figur 7E).

A. Repræsentative billeder af KPNA2 immunhistokemisk farvning fra normale og maligne colon væv. B. Kvantificering af KPNA2 farvningsintensitet i normale væv (N, n = 50), primær tumor (T, n = 55) og lymfeknudemetastaser (LN Ca, n = 15). * P 0,0001. C. Hyppigheden af ​​KPNA2 positive celler. * P 0,0001. D. Procentdelen af ​​KPNA2-positive celler korrelerer med T fase. * P 0,05. E. Kaplan-Meier kurve, der viser den samlede overlevelse af patienter tyktarmskræft med forskellig KPNA2 udtryk.

Svarende til tyktarmskræft, mundtlige og larynx planocellulært karcinom viste forhøjede niveauer af KPNA2 sammenlignet med uafhængig mund og svælg normale væv (figur 8A, 8B og 8C). Selvom KPNA2 viste ingen sammenhæng med sygdommen scenen, det var højere i hver af grad 2 (39,2% positive celler) og grad 3 (49% positive celler) carcinomer i forhold til grad 1 (26,3%). (P (G1 vs. G2) = 0,03 og p (G1 vs. G3) = 0,002) (figur 8D).

A. Repræsentative billeder af KPNA2 immunhistokemisk farvning fra normale og maligne tunge væv. B. KPNA2 farvningsintensitet i primær tumor og tilstødende normale væv * p 0,0001. C. Hyppigheden af ​​KPNA2 positive celler i primær tumor og tilstødende normale væv (2%). * P 0,0001. D. Sammenhæng mellem KPNA2 udtryk og tumor klasse. * P. 0,05

TNFAIP6 er overudtrykt i colon adenocarcinom

Tumor nekrose faktor alfa-induceret protein 6 (TNFAIP6) er et udskilt glycoprotein af epitelceller og leukocytter udtrykt under normale og inflammatoriske tilstande. Dens anti-inflammatoriske funktion er veletableret i forskellige inflammatoriske tilstande, såsom osteoarthritis, og det kan påvises i serumprøver fra patienter med autoimmune lidelser [42]. For nylig, transkriptionel profilering af blod fra kolorektal patienter og normale kontroller af QRT-PCR identificerede TNFAIP6 som biomarkør for tarmkræft [43]. Denne undersøgelse viser, at TNFAIP6 mRNA er forhøjet i perifere blodceller af patienter med tarmkræft. Her, vi undersøgte proteinniveauer af TNFAIP6 i colon cancerceller og tilstødende normale epitel. Immunohistokemisk farvning af 55 coloncancer-prøver og 50 hosliggende normale væv afslørede en øget ekspression i cancer på en per celle basis, samt en stigning i hyppigheden af ​​TNFAIP6-udtrykkende celler (figur 9A, B og C). TNFAIP6 proteinniveauer ikke forudsige den gennemsnitlige patientoverlevelse (data ikke vist). Som for recidiv, fandt vi en tendens til dårligere gentagelse overlevelse i stærkt udtrykker patienter (figur 9D), uden at nå statistisk signifikans (RR = 2,44, p = 0,09).

A. Repræsentative billeder af TNFAIP6 immunhistokemisk farvning fra normale og maligne colon væv. B. TNFAIP6 farvningsintensitet i primær colon tumor (n = 55) og tilstødende normalt væv (n = 50). * P 0,001. C. Hyppighed af TNFAIP6 positive celler i primær tumor (n = 55) og tilstødende normalt væv (n = 50). * P 0,0001. D. Kaplan-Meier kurve, der viser recidiv overlevelse af patienter tyktarmskræft med forskellig TNFAIP6 udtryk, baseret på procentdelen af ​​positive celler.

Diskussion

Denne undersøgelse var designet til at begrebsmæssigt og eksperimentelt løse en roman hypotese om, at kræft, uanset ætiologi, havn delte iCAMPs at unddrage sig immune overvågning, og at highjack vært immunitet for at fremme kræftpsykologisk inflammatorisk vækst og metastase. En saglig og omfattende strategi data-mining blev forpligtet sig til at tage fat på denne hypotese og at udvinde fælles molekylære ekspressionsmønstre i et stort antal patienter fra mange uafhængige undersøgelser for at sikre sammenhæng i vores resultater. Ekspressionen af ​​selektive gener blev bekræftet ved væv microarrays. Selv om den biologiske betydning af vores fund venter yderligere undersøgelser, er det klart, at Icamp ikke blot eksisterer, men også viser signifikant klinisk relevans. Kernen Icamp gensæt gengiver mange veletablerede gener, som udtrykkes afvigende i cancervæv, såsom VCAN og KPNA2. (https://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/).

doi:10.1371/journal.pone.0057911.s003

(PDF)

Figure