PLoS ONE: Potentielt Funktionel SNP’er (pfSNPs) som nye genomiske Prædiktorer af 5-FU respons i metastatisk colorectal kræftpatienter

Abstrakte

5-fluorouracil (5-FU) og dens pro-drug Capecitabine er ofte blevet brugt i behandling af kolorektal cancer. Imidlertid vil ikke alle patienter reagerer på lægemidlet, og der er derfor behov for at udvikle pålidelige tidlige prædiktive biomarkører for 5-FU respons. Her rapporterer vi en roman potentielt funktionelt enkelt-nukleotid polymorfisme (pfSNP) tilgang til at identificere SNPs, der kan tjene som prædiktive biomarkører for respons på 5-FU i kinesisk metastatisk kolorektal cancer (CRC) patienter. 1547 pfSNPs og ét variabelt antal tandem repeat (VNTR) i 139 gener i 5-FU stof (både PK og PD vej) og kolorektal cancer smitteveje blev undersøgt i 2 grupper af CRC patienter. Krympning af levermetastaser målt ved RECIST kriterier blev anvendt som klinisk slutpunkt. Fire non-responder-specifikke pfSNPs tegnede sig for 37,5% af alle ikke-respondenter (P 0,0003). Fem ekstra pfSNPs blev identificeret fra en multivariat model (AUC under ROC = 0,875), der blev anvendt for alle andre pfSNPs, bortset fra de ikke-responder-specifikke pfSNPs. Disse pfSNPs, som kan differentiere de andre ikke responderede fra respondenter, hovedsageligt bor i tumorsuppressorgener eller gener impliceret i tyk- kræftrisiko. Derfor kan i alt 9 nye SNP’er med potentiel funktionel signifikans kunne skelne mellem ikke-responders fra respondere til 5-FU. Disse pfSNPs kan være nyttige biomarkører til at forudsige respons på 5-FU

Henvisning:. Wang J, Wang X, Zhao M, Choo SP, Ong SJ, Ong SYK, et al. (2014) Potentielt Funktionelle SNP’er (pfSNPs) som nye genomiske Prædiktorer af 5-FU respons i metastatisk colorectal kræftpatienter. PLoS ONE 9 (11): e111694. doi: 10,1371 /journal.pone.0111694

Redaktør: Anthony W I. Lo, Queen Mary Hospital, Hongkong

Modtaget: Juli 22, 2014 Accepteret: September 29, 2014; Udgivet: 5. november 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (SERC 112 148 0008) fra Singapore Biomedical Research Council – Science and Engineering Research Council (BMRC-SERC) til A /professorerne Caroline Lee, Simon Ong, Yik Ying Teo og Samuel Chong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hvert år mere end en million individer på verdensplan vil udvikle tyktarmskræft [1], der tegner sig for 10% af den globale kræft byrde. Kolorektal cancer (CRC) er den hyppigst diagnosticerede cancer i Singapore (7,909 nye sager mellem 2005-2009) [2]. Mere end halvdelen af ​​CRC patienter udvikler metastatisk sygdom (fase 4) enten på diagnose eller tilbagefald efter initial helbredende hensigt terapi. Dette svarer til en betydelig andel af patienter, der kan have brug for behandling for metastaser eller tilbagefald af tyktarmskræft.

5-fluorouracil (5-FU) og dens pro-drug, capecitabin, er meget udbredt i behandling af CRC. Det er blevet foreslået, at der er to forskellige virkningsmekanismer for 5-FU. For det første virker som anti-metabolit, hvorved dets aktive form, FdUMP, produceret af thymidinphosphorylase (TYMP), inhiberer thymidylatsyntase (Tyms). For det andet kan det inducere celledød, hvorved inkorporeringen af ​​dens aktive produkter FUTP og FdUTP til RNA og DNA, henholdsvis fører til efterfølgende celle apoptose [3]. Uridinmonofosfat syntetase (UMPS, også kendt som OPRT) er ansvarlig for omdannelse af 5-FU til FUMP, som er det første trin at fremstille FUTP og FdUTP. Imidlertid kan de to veje overlapper, fordi mellemproduktet i “celletoksicitet” pathway, FUDP, også kan omdannes til FdUDP og efterfølgende FdUMP og deltage i “anti-metabolit” pathway. 5-FU er kataboliseres i den inaktive form af DHFU ved dihydropyrimidindehydrogenase (DPYD), og DPYD er det hastighedsbegrænsende enzym i nedværdigende 5-FU.

På nuværende tidspunkt er der ingen pålidelige test for tidlig forudsigelse af respons på 5-FU. Udvikling af en pålidelig tidlig prædiktiv biomarkør for svar på almindelige kemoterapi, ligesom 5-FU, i metastatisk kolorektal cancer har potentiale til at føre til passende skræddersy behandling til den enkelte patient og hjælpe med at flytte os tættere på en virkelig personlig pleje. Samlet økonomisk omkostningsfordele realiseres i både forudsagte respondenter og ikke-respondenter. Respondenter får passende behandling med tillid forventede reaktion. Predicted ikke-respondere til konventionel behandling undgå spildt udgift på 3 cykler af udsigtsløs behandling, unødvendige toksiciteter, som selv kræver retsmidler og tid tab i form af udsigtsløs behandling og tab af et vindue af muligheder for effektiv behandling. Disse patienter kan vælges som kandidater til nye behandlingsformer og kombinationen kemoterapi.

Indtil videre varianter kun i de “5-FU PD” gener blev rapporteret at være signifikant associeret med 5-FU effekt målt ved tumor krympning i nogle undersøgelser [4] – [7]. Desværre, replikation af sådan rapporterede forbindelse mellem “5-FU PD” gen varianter og tumorkrympning stadig en udfordring [4], [6], [8] – [13], hvilket tyder på mulige tilstedeværelse af andre loci ved bestemmelse 5-FU virkningsfuldhed .

Det var interessant at bemærke, at varianter i den “5-FU PK” gener hovedsageligt blev undersøgt for deres tilknytning til 5-FU toksicitet, ikke effekt [14] – [17], på trods af de ekspressionsniveauerne af disse gener har tidligere været forbundet med 5-FU effekt [18]. Begrænsede indsats [8], [19] forsøgt at udforske den mulige sammenhæng for effekt, men mislykkedes.

Desuden har de fleste undersøgelser af reaktion på 5-FU behandling primært fokuseret på SNPs i et par kandidatgener. Kun én undersøgelse undersøgte 21 varianter primært i kodende region af 11 gener involveret i metabolisme /action af 5-FU og andre beslægtede farmakologiske pathways [19]. Men denne undersøgelse stadig ikke omfattende afhøre alle mulige varianter, der kan være involveret i 5-FU svar.

En anden begrænsning af igangværende undersøgelser er, at kun univariate analyser har, indtil videre, været ansat, og dette kan ikke have tilstrækkelig strøm til detektion af sammenslutning af narkotika respons med mindre almindelige /sjældne SNPs med lille stikprøve. Multivariat model blev med succes anvendt til at estimere den passende dosis af warfarin baseret på kliniske og genetiske data [20].

Derfor, i denne undersøgelse, vi ansætter en ny tilgang spørgekriterierne potentielt funktionelle SNP’er (pfSNPs) i relevante lægemiddel og sygdom pathway at identificere association med lægemiddel respons. 1.547 potentielt funktionelle SNPs + 1 VNTR- (Variable Number Tandem Repeat) fra 139 gener i stoffet (både PK og PD vejen) og smitteveje blev undersøgt. Potentielt funktionelle SNP’er blev identificeret ved hjælp af pfSNP Web Resource (https://pfs.nus.edu.sg/) [21], som omfattede SNPs, som tidligere blev rapporteret til at være funktionel eller associeret med sygdom /narkotika reaktion; SNPs, der blev udledt at være potentielt funktionel fra genetiske tilgange såvel som dem forudsagt at være potentielt funktionel fra sekvensmotiver.

Da antallet af prøver var begrænset, en to-trins forsøgsdesign blev anvendt. I den første fase, undersøgte vi 62 patienter, der var kun på Capecitabine, et pro-drug af 5-FU, at identificere interessante SNP’er der er marginalt forbundet med lægemiddel respons som målt ved tumorkrympning. Disse SNP’er blev derefter undersøgt i en anden gruppe af 27 patienter, som blev behandlet med 5-FU og oxaliplatin. Kombineret Multivariat og Minimeringsannonceenheder (CMC) analyse blev anvendt til at vurdere den mindre almindelige (≤5%), ikke-responder-specifikke pfSNPs for deres tilknytning til 5-FU lægemiddelrespons mens en logistisk regression baseret multivariat model ved hjælp af trinvis Akaike Information Criterion (stepAIC ) fremgangsmåde blev anvendt til at afhøre de andre pfSNPs for deres tilknytning til 5-FU stof hos patienter, der ikke bære ikke-responder-specifikke pfSNPs.

Materialer og metoder

Patient prøver og kliniske parametre

krympning af lever metastaserende CRC tumor blev brugt som den kliniske effektmål for måling behandlingseffekt. Reaktion evalueringskriterier I solide tumorer (RECIST) [22] bruges til at bestemme tumor respons. I patienterne rekrutteret, var der ingen patient tilhører kategorien ‘Complete Response “. Patienter med ‘Delvis svar’ blev anset som “Respondenter” og patienter med ‘Progressiv sygdom “eller” stabil sygdom “blev klassificeret som” ikke-respondenter “i foreningen analyse.

I alt 89 uafhængige kinesiske metastatisk CRC patienter blev rekrutteret. Alle patienter havde levermetastaser og fik neo-adjuverende kemoterapi før operation for leveren læsion. Tabel 1 viser karakteristika for de patienter i hver undersøgelse.

I gruppe 1, 62 ubeslægtede Stage IV CRC kinesiske patienter blev rekrutteret. Disse patienter blev behandlet med kun Capecitabine og de har aldrig tidligere været eksponeret for dette stof. Af disse 62 patienter, 13 havde partielt respons, 31 havde stabil sygdom, og 18 havde progressiv sygdom. Derfor er responsrate på denne gruppe patienter er kun ~21%, hvilket er typisk for monoterapi behandling [23]. ~79% Af patienterne var mænd, og den mediane alder af kohorten var 60 år.

I gruppe 2, 27 ubeslægtede kinesisk lever metastatisk CRC patienter, som blev behandlet med 5-FU (et par havde Capecitabine) alene (nogle få) eller med oxaliplatin regime (de fleste) som deres neo-adjuverende kemoterapi blev undersøgt. Nogle af disse patienter havde også tidligere været eksponeret for disse lægemidler. Af disse 27 patienter, 12 havde partielt respons, syv havde stabil sygdom, og otte havde progressiv sygdom. Derfor var responsraten ~45%, hvilket er typisk for patienter, der gennemgår to-drug kombinationsbehandling [24]. To tredjedele af disse patienter er mænd, og havde en gennemsnitsalder på 62 år

Etik erklæring

Denne undersøgelse er blevet godkendt af Singhealth Centraliseret Institutional Review Board (CIRB) (referencenummer.: NC05-22 og 2005/421 /B).

Valg af potentielt funktionelle SNPs (pfSNPs) for foreningen undersøgelse

pfSNP ressource (https://pfs.nus.edu.sg/) [21] blev anvendt til at identificere SNPs i gener associeret med 5-FU /Capecitabine, oxaliplatin samt kolorektal cancer. Ca. blev fundet 2800 pfSNPs i 214 gener at være forbundet med søgeord herunder “fluorouracil”, “5-fluorouracil”, “capecitabin”, “platin”, “oxaliplatin” samt “kolorektal cancer”. Da kun 1.536 SNP’er kan genotypebestemmes inden for en enkelt tilpasset GoldenGate Genotypning Array (Illumina, Inc.), blev følgende kriterier anvendes til at vælge en delmængde af disse 2800 pfSNPs: alle SNPs i promotoren, kodning, 5 ‘/3’ un-oversat regioner, som har en GoldenGate score (GGS: mål for assay kvalitet ved deres platform) på mere end 0,5 blev udvalgt. For intronerne, pfSNP med et GGS 0,7 blev selekteret og monomorfiske dem rapporteret i HapMap CHB population blev udelukket, bortset fra dem, der tidligere rapporteret som funktionelle. For enhver tilstødende SNPs, der kan forstyrre hinanden i analysen, valgte vi SNP efter følgende rækkefølge: “Tidligere rapporterede → Ikke-Synonym → Synonymt → UTR → Intron”. En liste over alle de SNPs inkluderet på GoldenGate array er tilgængelig som tabel S1.

Blandt de markører, der var uegnet til at blive genotypebestemmes af GoldenGate assay blev 14 vigtige markører i 5-FU svar forudsigelse udvalgt til at være genotypet ved andre metoder (anført i tabel S2). De 14 markører indbefatter den tidligere godt undersøgt VNTR med indlejret SNP [25] samt 6bps 3’UTR Indel i Tyms genet fordi GoldenGate teknologi kunne kun genotype SNPs. Andre markører er SNPs med lav GoldenGate scoringer i Tyms, TYMP og DPYD gener. En skræddersyet Sequenom s MassARRAY panel blev brugt til at genotype 11 af de 14 markører og en SNP blev genotype af ABI TaqMan. Derudover har vi udviklet en ny metode til at genotype af VNTR (rs2853542) og indlejret SNP (rs34743033) i Tyms genet. Dette VNTR kan have enten 2 eller 3 gentagelser, og SNP kan forekomme i både den anden og tredje gentagelse [26]. Vi udviklede en robust metode under anvendelse Sanger sekventering til dette formål. Et fragment på 486 bp blev amplificeret ved anvendelse af primerne (F- CTGCTGGCTTAGAGAAGGCG og R- AGCGGAGGATGTGTTGGATC) og amplikonet blev sekventeret i begge retninger under anvendelse af forward og revers primere. Forskellige genotyper ville give forskellige mønstre på den fremadgående og tilbagegående sekventering læser (Som vist i fig S1), hvilket tillader genotype til nemt at kunne udledes.

Sammenfattende var der 1.536 markører (anført i tabel S1) genotype med en enkelt tilpasset Illumina GoldenGate SNP genotypning array, 11 (anført i tabel S2) ved Sequenom s MassARRAY, 1 (rs11479) ved ABI TaqMan og VNTR (rs2853542), med den integrerede SNP (rs34743033) blev genotype hjælp Sanger sekventering.

fordelingen af ​​SNP’er og gener udvalgt i de tre kategorier (CRC, fluorouracil og Platinum relateret) er afbildet i figur S2. Mere end halvdelen af ​​SNP’er (863) er fra fluorouracil-relaterede gener og 702 SNP’er er fra platin-relaterede gener. En betydelig del af SNP’er (656) er fra CRC-beslægtede gener, selv om 40% (32 ud af 80) af disse gener og 88% (579 ud af 656) af SNP’er er relateret til fluoruracil og /eller platin samt .

antallet af SNP’er i hvert gen region og funktionskategori dækket i denne undersøgelse er vist i figur S3. Hver af de fire genregioner, nemlig promotor, kodning, intron og 3’UTR, er tilstrækkeligt dækket i almindelighed. For promotoren og 3’UTR, de fleste af SNP’er genotypede er dem, der ændrer tf bindingssteder. I kodende region, SNPs der ændrer ESE /ESS steder er de mest udbredte, og ikke-synonyme SNPs, der forårsager skadelige virkninger er den anden mest rigelige. Intronen region SNP’er er beriget med de med en underskrift nylig positiv selektion.

Fordelingen af ​​SNP mindre allel frekvens for introniske versus ikke-intron region er vist i tabel S3. For kodning, 3’UTR, og promotorområder, har en række SNPs ikke tidligere genotypede af HapMap blevet genotype i denne undersøgelse. Da undersøgelsen har til formål at også udforske sjældne varianter, blev en række SNPs rapporteret af HapMap at være monomorf også genotype. For intron-regionen, da de fleste af SNPs er dem med en underskrift af nyere positiv selektion, har de MAF mere end 5%. Vi har ikke genotype mange monomorfiske dem inden introns.

Single markør association analyse

Hardy-Weinberg ligevægt og mindre allel frekvens blev analyseret ved hjælp af Microsoft Excel-baserede SNP Statistik Lommeregner udviklet internt. Enkelt markør association analyse blev udført ved anvendelse Plink [27]. P-værdi blev beregnet ved permutationen-baserede metode, og Odds Ratio (OR) og tilsvarende 95% konfidensinterval blev bestemt ved hjælp af regelmæssig allel-baserede forening analyser, fordi permutation-baserede metode ikke giver sådanne oplysninger. Genotypen af ​​VNTR (rs2853542) og indlejret SNP (rs34743033) i Tyms genet omkodes som en bi-allelisk SNP omfattende den høje ekspression allel og den lave ekspression allel ifølge Kawakami et al [26].

kombineret Multivariat og Minimeringsannonceenheder (CMC) analyser for ikke-responder-specifikke SNPs

kombineret Multivariat og Minimeringsannonceenheder (CMC) metode blev først foreslået som en metode til at analysere sjældne SNP’er [28]. CMC udnytter Hotelling T

2 test for at analysere mere end 2 grupper af kollapsede varianter. Når kun 2 grupper af sådanne varianter analyseres, kan Fishers eksakte test anvendes. I denne undersøgelse anvendte vi Fishers eksakte test for at vurdere, om den kollapsede mindre allel af ikke-responder specifikke SNPs, som er mindre almindelig (≤5% mindre allel frekvens) ville være en god indikator for modtagelighed for 5-FU.

Logistisk regression baseret multivariat model ved hjælp Akaike Information Criterion (stepAIC) procedure til at forudsige lægemiddelrespons hos patienter, som ikke har ikke-responder-specifikke SNPs

patienter, der ikke har nogen af ​​de ikke-responder specifikke SNP’er, blev inddelt i 2 grupper. Data fra den første gruppe bestående 80% af patienterne blev brugt til at træne en logistisk regression baseret multivariate model ved hjælp af Akaike s Information Criterion (AIC) i en trinvis algoritme (ved hjælp af R-pakken “stepAIC”), mens data fra de andre 20% af patienter blev anvendt til validering af modellen. Den valgte model blev evalueret af arealet under kurven (AUC) på modtageren Operating Karakteristiske (ROC) kurver. Den optimale cut-off point for den logistiske regression blev valgt, hvor den maksimale sum af sensitivitet og specificitet opnås [29], [30].

Resultater og Diskussion

En høj konkordans (R

2 = 0,9494) blev observeret mellem allelfrekvenserne af SNPs i vores undersøgelse, og dem fra CHB (kinesisk i Beijing) befolkning HapMap (Slip 27) (Figur S4) bekræfter kvaliteten af ​​vores genotypebestemmelse. En stor del af de undersøgte i denne undersøgelse SNPs var enten monomorf (36%) eller havde en høj mindre allel frekvens (MAF≥0.1, 46%) (Figur S5). Halvfjerds-to og 66 SNPs i gruppe 1 og 2 henholdsvis blev fundet afviger væsentligt fra Hardy-Weinberg ligevægt og blev udelukket fra yderligere analyse.

Genotype lykkedes (97-100%) tildelt i ni ud af 11 SNP’er genotypebestemt ved anvendelse af Sequenom s MassARRAY. Sanger sekventering held tildelt genotype af de 2 SNPs til alle prøverne, mens TaqMan assay held tildelt genotyper til 96% af prøverne. Alle SNP’er held genotype ved disse metoder blev fundet at være i Hardy-Weinberg ligevægt.

Single SNP association analyse identificeret tre ikke-responderende specifikke SNP’er i UMPS genet, som kan udgøre potentielle prædiktiv biomarkør for manglende respons på 5-FU

Da antallet af prøver i denne undersøgelse var lille, var et kryds validering tilgang anvendes, hvor prøverne blev adskilt i 2 forskellige grupper for opdagelse og validering til at øge robustheden af ​​vores resultater.

der blev fundet i alt 36 SNPs i 12 gener at være forbundet med lægemiddelrespons før multiple test korrektion i gruppe 1-patienter (tabel 2). Som prøvens størrelse var lille (n = 62), ingen af ​​disse markører var statistisk signifikante efter Bonferroni korrektion.

Ikke desto mindre var der 68 lavfrekvente pfSNPs i gruppe 1, der var entydigt kun findes i ikke -responders (ikke-responder-specifik pfSNP). For at vurdere, om nogen af ​​disse ikke-responder-specifikke pfSNPs kan udgøre potentielle prædiktiv biomarkør for manglende respons på 5-FU, vi undersøgte en anden gruppe på 27 patienter. Af disse 68 ikke-responderende specifikke pfSNPs, 24 forblev non-responder-specifik, selv i gruppe 2, og disse er vist i tabel 3. Det er dog kun 3 af de ikke-responder-specifikke SNP’er i uridinmonofosfat syntetase (UMPS) genet, nemlig rs2291078 (E /4 /T1050A C350 *), rs3772809 (E /6 /A1336G H446Y) og rs3772810 (E6 /3UTR /A28G) (tabel 2, SNP’er 42-44) (tabel 3, SNP’er 1-3) findes at være statistisk signifikant (p = 0,036 før multiple test korrektion) i gruppe 2. Når de 2 grupper af patienter blev kombineret og analyseret, disse 3 SNP’er forblev statistisk signifikant (p = 0,032 før multiple test korrektion). Den iagttagelse, at ud af i alt 89 patienter i den kombinerede gruppe, blev der ikke respondenter sig at bære denne allel tyder på, at denne allel kan være en “kausal” allel til bestemmelse af respons på 5-FU. De ikke-statistisk signifikante data opnået (efter flere test korrektion) tyder på, at dette ikke kan være den eneste “kausale” alleler for 5-FU respons, og der er sandsynligvis andre alleler, der også spiller en rolle i 5-FU svar tyder “locus heterogenitet “af respons til 5-FU.

UMPS gen er vigtig ved bestemmelse 5-FU respons, som det omdanner 5-FU til dets aktive metabolit, FUMP, som kan deltage i både celletoksicitet pathway samt i “anti-metabolit” pathway. I celletoksicitet pathway, kan FUMP omdannes yderligere til FUTP og FdUTP som derefter inkorporeres i RNA og DNA hhv. I “anti-metabolit” sti, kan FUMP omdannes til FdUMP og hæmmer Tyms.

Disse 3 alleler i UMPS genet er i perfekt koblingsuligevægt (LD) og dermed vil forekomme sammen hele tiden. De forudsagte molekylære funktioner i de tre alleler unikke for non-responders er alle forbundet med afbrydelse af UMPS genfunktioner og støtte deres unikke tilstedeværelse i de ikke-respondenter (figur 1).

en allel af rs2291078 (UMPS E /4 /T1050A C350 *) var forudsagt til at skabe en stopcodon i exon 4 i UMPS mRNA. UMPS mRNA indeholdende dette stopkodon kan hurtigt forringet siden stopkodon optræder mere end 50 bp fra den sidste exon-exon junction ville inducere non-sense medieret henfald af mRNA [31]. Derfor kan patienter, der bærer dette En allel har lavere UMPS mRNA og protein overflod.

Samtidig forekomst af 3’UTR pfSNP rs3772810 (UMPS E6 /3UTR /A28G) med denne pfSNP rs2291078 tyder på, at ekspressionen af ​​dette gen kan være yderligere svækket. G allelen af ​​3’UTR SNP rs3772810 (UMPS E6 /3UTR /A28G) forventes at skabe bindingssteder for miRNA 23a, 23b og 130a *. Den miRNA 23a viser sig at være opreguleret under hypoxisk tilstand almindeligt forekommende i tumorer [32]. Især en nylig publikation rapporterede, at miRNA 23a opreguleres i metastatisk colorectal cancer [33] tyder på, at patienter med G-allelen kan være ikke-responsiv til 5-FU siden miRNA 23a kan undertrykke ekspressionen af ​​UMPS mRNA indeholdende G-allelen .

også co-forekommende med disse 2 pfSNPs, er de ikke-synonyme pfSNP rs3772809 (UMPS E /6 /A1336G H446Y), som har potentialet til at ændre funktionen af ​​UMPS genet. Derfor er disse 3 co-forekommende pfSNPs, som tegnede sig for 17,2% af alle ikke responderede har potentiale til at blive de kausale varianter, der påvirker funktionen af ​​UMPS og dermed svar på 5-FU, selvom der kræves yderligere forsøg for at validere potentielle funktionalitet af disse pfSNPs.

kombineret Multivariat og Minimeringsannonceenheder (CMC) analyser afslørede, at mindst fire ikke-responder specifikke pfSNPs, der ikke er i koblingsligevægt væsentligt kan skelne ikke responderede fra respondenter

Vi fortsatte med at afgøre, om en kombination af ikke-responder specifikke pfSNPs (tabel 3) kan tegne sig for en større procentdel af 5-FU ikke responderede, end de ovennævnte 3 ikke-responder specifikke umps pfSNPs i perfekt LD, der viser statistisk signifikans (før flere test korrektioner ). Da de 3 ikke-responderende specifikke UMPS pfSNPs er i perfekt LD, kun en blev udvalgt til yderligere analyser. Vi identificerer derefter det mindste antal yderligere ikke-responder specifikke pfSNPs fra tabel 3, der kan forklare den maksimale procentdel af 5-FU ikke-respondenter og ansat Kombineret Multivariat og Minimeringsannonceenheder (CMC) analyser [28] for at bestemme dens statistisk signifikans.

Især tre andre ikke-responder specifikke pfSNPs sammen med et af de UMPS ikke-responder specifikke pfSNPs tegnede sig for 37,5% af alle ikke-respondenter fra de 2 grupper af patienter (tabel 4). CMC-analyser afslørede statistisk signifikans (P = 0,0003) af disse fire ikke-responder specifikke pfSNPs (3 ikke UMPS plus en hvilken som helst af de 3 umps pfSNPs) tyder signifikant sammenhæng af disse pfSNPs med ikke-lydhørhed.

SNP rs3218592 forårsager en ikke-konservativ aminosyreændring i REV3L genet, som koder for den katalytiske underenhed af DNA Polymerase Zeta. DNA Polymerase Zeta blev rapporteret at være signifikant nedreguleret i human colorectal cancer [34] og blev foreslået at være en tumor suppressor [35]. T allel af rs3218592 (E /26 /C8285T, R2762Q), som er unikt findes i ikke-responder i vores undersøgelse forventes at være til skade for det protein funktion ved både Polyphen [36] og finkæmme [37]. Vi hypotese således at patienterne bærer dette skadelige allel ville have mere aggressiv sygdom og dermed er mere tilbøjelige til at være ikke-responsiv på behandling.

pfSNP (rs8071253) bor i promotorregionen af ​​TK1 og forudsiges at skabe en xenobiotisk stress aktiveret TGA1a transskription bindingssted.

den tredje SNP (rs501415) har bopæl inden for første intron af WDR7 og forventes at forstyrre AML1 (RUNX) transskription faktor binder site. Da hele RUNX familien deler den samme bindingssted (TGT /cGGT) [19], postulerer vi, at denne SNP også kan påvirke bindingen af ​​RUNX3. RUNX3 var blevet hyldet som et tumorsuppressorgen og reduceret ekspression af RUNX3 tidligere er blevet forbundet med dårligere overlevelse i kolorektal cancer patienter [38]. Ikke desto mindre rolle WDR7 i 5-FU modstand forblev uklart. Det blev rapporteret at være forbundet med 5-FU ved PharmGKB [39], men publikationen [39] blev for nylig trukket tilbage [40].

Den logistiske regression-baserede multivariat model identificeret yderligere 5 pfSNPs som ikke ikke -responder-specifik, som kan skelne respondere fra non-respondere Salg

Ud over de ikke-responder specifikke pfSNPs der er forbundet med patienter, som ikke reagerer på 5-FU, vi fortsatte med at identificere yderligere pfSNPs, der kan være forbundet med 5-FU lægemiddelrespons ved at uddanne en logistisk regression baseret multivariate model med stepAIC metoden ved hjælp af data fra de andre pfSNPs. Den multivariate model identificeret 5 ekstra pfSNPs, nemlig rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q), rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A, E589K), rs17431184 (PTEN, I /7 /T-400C), rs2236722 (CYP19A1, E /2 /A115G, W39R) og rs17160359 (ABCB1, 5UR //G-4254T) (tabel 5), som kan skelne mellem respondenter fra ikke-respondenter. AUC (areal under kurven) for ROC (Receiver Operating Characteristic) kurve af disse 5 SNP’er er 0,875 (figur 2). Et forudsagt værdi på 0,794 blev identificeret som den optimale skæringspunkt at forudsige lægemiddelrespons, med følsomhed på 62,5% og specificitet på 100%. Med denne tærskel, kan den logistiske-baserede multivariat model korrekt identificerer 39,1% (25/64) af ikke-respondenter. Sammen med 37,5% af ikke-respondenter forudsagt af de ikke-responder-specifikke SNP’er, kan i alt 76,6% (49/64) af ikke-respondenter være korrekt identificeret af begge modeller.

AUC for ROC-kurven er 0,875. Pointen med maksimal sum af sensitivitet og specificitet er fremhævet af den grønne cirkel på ROC-kurven. Den tilsvarende følsomhed og specificitet er 62,5% og 100% hhv.

Det er bemærkelsesværdigt, at SNP’er i den flerdimensionale model primært er lokaliseret i tumorsuppressorgen (PTEN) eller i gener, der er primært forbundet med kolorektal cancer (DLG5, EXO1, CYP19A1 og ABCB1) (tabel 5). Især en af ​​de ikke-responder-specifik SNP (rs3218592, REV3L E /26 /C8285T, R2762Q) (tabel 4), der befinder i genet, Rev3L, har også været impliceret som et tumorsuppressorgen [41].

PTEN (phosphatase og tensin homolog) genet er et velkendt tumorsuppressorgen, der for nylig blev rapporteret at styre DNA-reparation og følsomhed over for genotoksisk stress [42]. Jo højere frekvens af C-allelen i respondenter (26% i de responderende vs. 12% i den ikke-responders) antyder, at patienter med denne allel kan udvise lavere tolerance over for genotoksisk stress forårsaget af DNA-beskadigende midler ligesom 5-FU.

DLG5 (diske stor homolog 5) genet koder et medlem af membranen-associeret guanylat kinase (Maguk) familie af stilladser proteiner, som er involveret i at opretholde den epiteliale integritet [43]. T allel af rs2289310 (DLG5, E /23 /G4442T, P1481Q) forårsager en ikke-konserveret aminosyreændring i nærheden af ​​en af ​​PDZ-domæner i dette gen (aa 1391-1472; Prosite score 13,531). Denne variant blev postuleret at forringe stilladser funktioner DLG5 [44] og forbedre tight junction-medierede tarm permeabilitet [45]. Denne polymorfi er også blevet forbundet med øget risiko for inflammatorisk tarmsygdom [45], som kan medføre øget risiko for kolorektal cancer [46]. Idet en øget gut permeabilitet blev rapporteret at føre til højere 5-FU absorption i rotter [47], vi hypotese, at T-allelen ville føre til bedre lægemiddelabsorption og dermed bedre respons. I overensstemmelse med vores hypotese, flere responders har T-allelen (MAF på 34% i responder vs. 17% i ikke-responder) i denne undersøgelse.

EXO1 (exonuklease 1) -gen er blevet impliceret at spille roller i DNA-replikation, rekombination, reparation, telomer integritet [48] samt skader signalering beslutninger [49]. A allel af rs1047840 (EXO1, E /12 /G1765A eller E /13 /G1765A, E589K) forårsager en ikke-konserveret aminosyreændring og forudsiges at opholde i en region, der er stærkt konserveret blandt XP-G /RAD2 DNA Reparation endonuklease Familie (HMMPanther PTHR11081). I Kin-kohorten analyser, har A-allelen er forbundet med højere risiko for kolorektal cancer i en britiske befolkning [50]. Denne SNP er også blevet forbundet med større risiko for forskellige andre kræftformer i den kinesiske befolkning [51] – [57]. Vi hypotesen, at den øgede cancer risiko forbundet med denne SNP kan skyldes mindre effektiv reparation af DNA-skade i individer, der bærer A-allelen. Som metabolitterne af 5-FU får inkorporeret i DNA beskadige værts-DNA, kan de ineffektive reparationsmekanismer af individer, der bærer A-allelen af ​​denne SNP resultere i større celledød dermed øge effektiviteten af ​​5-FU-behandling. Dette er i overensstemmelse med vores observationer, at større procentdel af respondere bærer A-allelen af ​​denne SNP sammenlignet med ikke-respondere (30% versus 16%).

CYP19A1 (cytochrom P450, family 19, subfamily A, polypeptid 1) eller Aromatase er et medlem af cytochrom P450-superfamilien af ​​enzymer og spiller en vigtig rolle i metabolismen af ​​østrogener. Østrogen er blevet forbundet med lavere risiko for colorectal cancer [58] – [60]. Selv om flere SNP’er i CYP19A1 genet var blevet rapporteret at være forbundet med risiko for tarmkræft i en kaukasisk population [61], SNP rs2236722 (E /2 /A115G eller E /3 /A115G, W39R) blev ikke undersøgt i denne undersøgelse som det er monomorf i HapMap CEU population. Ikke desto mindre er denne SNP (rs2236722), som forekommer med en frekvens på 3,3% i HapMap CHB befolkning og 9,5% i vores undersøgelse, forårsager en ikke-konserveret aminosyreændring fra hydrofob tryptofan til ladet arginin i CYP_P450 familien domæne og er forudsagt af Polyphen [36] at være en skadelig ændring. Derfor er det muligt, at denne skadelige forandringer i CYP19A1 kan føre til lavere østrogenniveau fører til højere kolorektal risiko cancer.