PLoS ONE: Hypoxi-Inducerbare Faktorer modulere Stemness og Malignitet for tyktarmskræft celler ved at spille Opposite Roles i Canonical Wnt Signaling

Abstrakt

Denne undersøgelse undersøgte den rolle, som hypoxi-inducerbare faktorer (HIFs) i maligne spillet fænotype vedligeholdelse og kanonisk Wnt signalering. Under normoxi, vi bestemt, at både HIF-1α og HIF-2α udtrykkes i humane colon cancerceller, men ikke i deres ikke-maligne modstykker. Den stabile knockdown af HIF-1α eller HIF-2α udtryk fremkaldt negative virkninger på den maligne fænotype af tyktarmskræft celler, med laktat produktion, satsen for apoptose, migration, CXCR4-medieret kemotaksi, og tumorigen aktivitet alle bliver væsentligt påvirket af HIF knockdown og med HIF-1α depletering udøver større effekt. Knockdown af disse to HIF udskrifter induceret forskellige og endda modsatrettede effekter på β-catenin transkriptionel aktivitet i tyktarmskræft celler med forskellige genetiske Wnt signalveje. I SW480-celler, havde HIF-2α knockdown ikke påvirke β-catenin-niveauer, forøgelse af transkriptionel aktivitet af β-catenin ved at inducere dets kerneakkumulation, hvorimod HIF-1α silencing negativt påvirket stabiliteten og transkriptionsaktivitet β-catenin, inducerende sin exit fra kerner og dens rekruttering til cellemembranen via e-cadherin. Desuden, selv om HIF-1α depletion inducerede en vending af epitel-til-mesenchymal overgang (EMT), HIF-2α silencing ændret ekspressionen af ​​stamcellemarkører CD44, Oct4, og CD24 og differentieringsmarkør CK20 i den modsatte retning som HIF-1α silencing. Bemærkelsesværdigt, HIF-2α knockdown også forbedret β-catenin transkriptionel aktivitet under hypoksi i celler, som viste normal Wnt signalering, hvilket antyder, at genet negativt modulerer kanoniske Wnt signalering i colon cancerceller. Tilsammen vores resultater viser, at HIFs spiller modsatrettede roller i kanonisk Wnt signalering og er afgørende for stemness og malignitet vedligeholdelse af tyktarmskræft celler

Henvisning:. Santoyo-Ramos P, Likhatcheva M, García-Zepeda EA, Castañeda-Patlán MC, Robles-Flores M (2014) Hypoxi-Inducerbare Faktorer modulere Stemness og Malignitet for tyktarmskræft celler ved at spille Opposite Roles i Canonical Wnt Signaling. PLoS ONE 9 (11): e112580. doi: 10,1371 /journal.pone.0112580

Redaktør: Gregory M. Kelly, Western University, Canada

Modtaget: Juli 2, 2014 Accepteret: 8 okt 2014; Udgivet: November 14, 2014

Copyright: © 2014 Santoyo-Ramos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at for godkendte årsager, nogle adgangsbegrænsninger anvendelse på de data, der ligger til grund for resultaterne. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud fra Universidad Nacional Autónoma de México (DGAPA-UNAM IN226111 og IN215514) og Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT CB2011-151731). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Wnt signalering er blevet velkarakteriseret som et af de vigtigste bidragydere til tumorigenese i mange typer af faste tumorer. Afvigende kanonisk Wnt signalering er kendt for at bidrage til hurtig progression i de fleste kolorektale cancere. Faktisk har en stor mængde af eksperimentel evidens vist, at mutationer i adenomatøs polypose coli (APC) -gen fungerer som dørvogtere i den molekylære patogenese af størstedelen af ​​sporadiske og arvelige former af colorectalt carcinom [1], [2]. Den Wnt vej er også påvist at spille en vigtig rolle i udviklingen og regulering af voksne stamceller systemer, og kanoniske Wnt signalering understøtter dannelsen og vedligeholdelsen af ​​både stamceller og kræft stamceller (CSC) [3].

Canonical Wnt signalering opererer gennem regulering af phosphorylering og nedbrydning af transskription co-aktivator β-catenin. Uden stimulering med Wnt, er β-catenin samlet i den såkaldte ødelæggelse kompleks, hvori APC spiller en central rolle, og dette kompleks omfatter også axin, GSK-3β og Caseinkinase 1. Dette kompleks retter en række phosphoryleringsbegivenheder i p-catenin, der gør det et mål for ubiquitinering og efterfølgende proteolyse via proteasomet [4]. Stimulering med Wnt fører til hæmning af β-catenin opdeling, så β-catenin at akkumulere, trænge ind i kernen og aktivere Wnt-målgener, såsom

cyclin D1

C-MYC

proto -oncogenes, der fremmer optagelsen af ​​cellen i S-fasen af ​​cellens cyklus [5].

Tumor hypoxi og de kritiske formidlere af den cellulære ilt signalvejen, nemlig hypoxi-inducerbare faktorer (HIFs) , er kendt for at regulere flere trin med tumorigenese og er typisk forbundet med ændringer i metabolisme, neo-vaskularisering, invasion, metastase, lægemiddelresistens, og i sidste ende fattige kliniske resultater [6]. HIFs er heterodimere transkriptionsfaktorer, der består af HIF-α og HIF-β (eller ARNT), som udtrykkes konstitutivt på det transskriptionelle og translationelle niveau. HIF-1α og HIF-2α (også kendt som EPAS1) er de to mest undersøgte medlemmer af HIF-α familie. Under normoksiske betingelser, er HIF-a-underenheder hydroxyleret på centrale prolinrester, som tillader dem at blive anerkendt af von Hippel-Lindau (pVHL) tumor suppressor, substrat anerkendelse komponent i en E3 ubiquitinligase kompleks, der retter sig mod HIF-α for proteasomalaktivitet nedbrydning. Hypoksisk signalering stabiliserer HIF-α ved at inhibere prolyl hydroxylering, og til gengæld ubiquitin proteasomalaktivitet nedbrydning, hvilket gør HIF-α stand til at dimerisere med Arnt, binding til hypoxi-responsive DNA-element, og rekruttere transkriptionen coaktivator p300 /CBP for den transkriptionelle aktivering af en masse hypoxi-responsive gener [7].

i betragtning af de strukturelle ligheder mellem HIF-1α og HIF-2α, blev de menes at virke redundant i det cellulære respons på hypoxi. en voksende mængde af beviser indikerer dog, at HIF-1α og HIF-2α inducere ekspressionen af ​​forskellige sæt af gener. Selvom HIF-1α og HIF-2α har fælles mål såsom vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), de også regulere unikke genmål; HIF-1α regulerer glycolytiske enzymer [8] og HIF-2α aktiverer stamcellefaktor Oct4 [9]. I overensstemmelse med denne konstatering, Imamura et al. identificerede forskellige sæt HIF-1α og HIF-2α målgener i SW480 colon cancerceller efter cDNA microarray analyse [10].

Krydstale er rapporteret mellem kanoniske Wnt signalering og HIF signalering i tumorudvikling og metastase. Men de molekylære mekanismer, der er involveret i denne crosstalk forblive dårligt forstået. Adskillige rapporter har indikeret, at aktiviteterne i de transkriptionsfaktorer reguleres af hypoxi spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​stamceller ubevægelighed [9], og at HIF-1α-medieret Wnt aktivering fremmer opretholdelsen af ​​stamceller aktivitet [11]. Mazumdar et al. viste, at HIF-1α modulerer Wnt /β-catenin signalering i hypoksiske embryonale stamceller ved at øge β-catenin aktivering og ekspression af den nedstrøms effektorer LEF-1 og TCF-1 [11]. Desuden er der er eksperimentelle beviser understøtter hypotesen om, at både hypoxiske betingelser og kanoniske Wnt aktivering er involveret i at udløse en EMT-program i mange cancerceller [12], [13]. Endvidere krydstale er blevet vist, at eksistere mellem kanoniske Wnt signalering og HIF signalering i tumorudvikling og metastase via den synergistiske vekselvirkning af Wnt målgen

c-MYC

med HIF-1α [14], [15]. I denne henseende skønt normale fysiologiske HIF-1α responser i ikke-maligne celler kan inhibere aktiviteten af ​​normale c-Myc paradoksalt nok den deregulerede ekspression af onkogen c-Myc, der findes i mange cancere, såsom colorektal carcinom arbejder sammen med HIF- 1α at give tumoren metaboliske fænotype beskrives som Warburg effekten eller aerob glykolyse samt at fremme angiogenese [14].

Aktuel viden om de homeostatiske mekanismer, der regulerer den epiteliale kolon stemness og malignitet fortsat ufuldstændige, forhindrer betydelige fremskridt i behandlingen af ​​coloncarcinom. Denne undersøgelse undersøgte virkningerne af stabil HIF-1α og HIF-2α siRNA knockdown i maligne fænotype vedligeholdelse og i transkriptionsaktivitet medieret af β-catenin. Vores resultater viser, at selv om både HIF-1α og HIF-2α er afgørende for stemness og malignitet vedligeholdelse, disse to proteiner udøver forskellige effekter og spille modsatrettede roller i kanonisk Wnt signalering.

Materialer og metoder

Reagenser og antistoffer

følgende antistoffer blev anvendt i disse forsøg: allophycocyanin-konjugeret muse anti-CD44, muse-anti-CD44, og muse-anti-CD24 fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA); phycoerythrin (PE) -konjugeret muse-anti-CD133 fra Miltenyi Biotec (Auburn, CA, USA); muse anti-HIF-1α, muse-anti-HIF-2α, kanin-anti-Oct4, Alexa 647-konjugeret kanin-anti-mus, Cy3-konjugeret gede-anti-kanin, og muse-anti-lamin A /C fra Millipore (Billerica, MA ); kanin-anti-β-tubulin fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); biotin-konjugeret muse-anti-CXCR4 fra R muse anti-β-catenin, muse-anti-cytokeratin 20 (CK20), kanin anti-E-cadherin, kanin-anti-snail 1, muse-anti-vimentin, kanin-anti-GSK-3β, og gede-anti- (p-Ser9) -GSK-3β fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA); Alexa647-konjugeret gede-anti-kanin fra Molecular Probes, Inc., (Eugene, OR, USA); og allophycocyanin-konjugeret streptavidin fra Biolegend (San Diego, CA, USA). Muse IgG1 og IgG2b fra US Biologicals (Massachusetts, MA, USA) blev anvendt i samme koncentration som det primære antistof, som var isotype matchet kontrol i immunfluorescensfarvning og flowcytometri eksperimenter. Annexin V FLUOS Staining Kit fra Roche Applied Science (Mannheim, Tyskland) blev anvendt til at detektere apoptotiske og nekrotiske celler. Puromycin antibiotikum og L-lactat dehydrogenase blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). En vækstfaktor-reduceret Matrigel matrix blev indkøbt fra BD Biosciences. Alle andre kemikalier var af reagenskvalitet.

plasmider

pTOPFlash og pFOPFlash reporter plasmider blev opnået fra Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Den HRE-Luc reporter blev opnået fra Addgene (Plasmid 26.731: HRE-luciferase), en non-profit organisation dedikeret til at fremme plasmid deling blandt videnskabsfolk. Kontrolsekvenserne plasmid koder en kodet shRNA sekvens blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology. Styringen (void plasmid pSUPER), HIF-1a, og HIF-2α RNAi plasmider var generøse gaver fra Dr. Daniel Chung, og deres konstruktion og effektivitet blev beskrevet i en tidligere rapport [10].

Cell kultur

Alle cancercellelinier og de ikke-malign 112CoN cellelinie anvendt her blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) og dyrket som tidligere beskrevet [16]. Alle disse cellelinjer blev godkendt i januar 2012 af Short Tandem Repeat DNA-profilering udføres på Instituto Nacional de Medicina Genómica (INMEGEN) i Mexico City.

Western blotting

Prøver af protein (50 ug) blev separeret ved 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) efterfulgt af elektroforetisk overførsel på nitrocellulosemembraner (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) som beskrevet i en tidligere rapport [14]. En actin antistof blev anvendt til at kontrollere for lige belastning.

Immunopræcipitation

Cellerne blev vasket og homogeniseret i iskold pH 7,5 lysepuffer indeholdende 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100 og en blanding af proteaseinhibitorer og proteinphosphatase inhibitorer. Proteinkoncentrationen i supernatanten blev målt ved anvendelse af et detergent-kompatible proteinassay (Bio-Rad). Alikvoter af disse ekstrakter (1 mg /ml) blev inkuberet natten over ved 4 ° C med 2 ug /ml primært antistof med forsigtig rystning. Derefter blev 25 pi protein A-sepharose (30%, Calbiochem) blev tilsat og inkuberet i 2 timer. Immunkomplekserne blev derefter vasket to gange med puffer A (50 mM Tris-HCI og 0,6 M NaCl, pH 8,3) suppleret med 0,1 mg /ml trypsininhibitor og 1 mM PMSF, og én gang med puffer B (50 mM Tris-HCI og 0,15 M NaCl, pH 7,5) indeholdende protease og phosphataseinhibitorer.

HIF-1α eller HIF-2α knockdown

for at inducere stabil inaktivering af HIF-1α eller HIF-2α, cellerne blev transficeret med den pSUPER HIF-1α eller HIF-2α RNAi plasmid, som blev konstrueret og analyseret ved Dr. Daniel Chung som beskrevet i en tidligere rapport [10] eller med kontrolgruppen plasmid (der koder for en krypteret shRNA sekvens eller pSUPER void plasmid) under anvendelse af Lipofectamine 2000 . for at generere stabile transfektioner blev cellerne transficeret med enten 1 ug af kontrol plasmid eller 1 ug pSUPER HIF-1α RNAi eller HIF-2α RNAi plasmider. Stabile transfektanter blev selekteret med 3 ug /ml puromycin (Sigma) i fire uger, og klonerne blev udvalgt og screenet for HIF-1α eller HIF-2α silencing ved flowcytometri.

FACS-analyse

cellerne blev løsnet og dissocieret i 10 mM EDTA-opløsning. Cellesuspensionen blev vasket, resuspenderet i PBS suppleret med 4% føtalt kalveserum (FCS) (farvning puffer), farvet med den tilsvarende primære antistof og derefter inkuberet med det sekundære antistof. Celler farvet med det sekundære antistof alene blev anvendt som en negativ kontrol. For nuklear farvning blev kerner oprenset fra celleprøverne bruger Nuclei Isolation Kit (Sigma-Aldrich) ifølge producentens instruktioner. Kernerne blev vasket, fikseret, permeabiliseret, blokerede, og mærket med anti β-catenin og Alexa 647-konjugeret gede-anti-muse-antistof i farvning puffer. Som en negativ kontrol blev kerner holdes i separate rør probet parallelt med Alexa 647-konjugeret gede-anti-muse-antistof. Efter en sidste vask blev kernerne fikseret og analyseret ved flowcytometri.

lactat måling assay

Mængden af ​​lactat cancercellerne udskilles i dyrkningsmediet blev målt ved anvendelse af et enzymatisk assay ved anvendelse af L -lactat dehydrogenase (Sigma). I dette assay er lactat secerneres i dyrkningsmediet prøve reduceret til pyruvat og NADH i nærværelse af lactatdehydrogenase (LDH) (Sigma) og overskydende NAD. Mængden af ​​NADH dannes ved reaktionen, målt ved ændringen i absorbans ved 340 nm, er proportional med koncentrationen af ​​lactat til stede i prøven. For at undgå interferens med LDH der kan allerede være til stede i serum anvendes til at supplere dyrkningsmediet blev prøverne underkastet deproteinisering med 8% trichloreddikesyre (TCA) for at gøre dem proteinfrit før assayet.

Apoptose

SW480 kontrol eller HIF-1α eller HIF-2α-lyddæmpede celler podedes på plader med 24 brønde ved en tæthed på 1,5 x 10

5 celler pr. Fireogtyve timer efter podning blev cellerne inkuberet i fravær eller nærvær af apoptoseinducer H

2O

2 (1 mM) i 12 timer. Apoptose blev målt ved flowcytometri under anvendelse af Annexin V FITC kit (Roche) som anbefalet af producentens anvisninger. Nekrose blev målt ved propidiumiodid (PI) permeabilitet i fravær af detergent. Procentdelen af ​​apoptotiske celler blev bestemt ved flowcytometri.

sårheling assay

Kontrol eller HIF-1α- eller HIF-2α-lyddæmpet SW480-celler blev podet til konfluens på poly-L- lysin overtrukne objektglas i DMEM F12 suppleret med 5% FBS. Efter 24 timer blev en ridse fremstillet under anvendelse af en steril pipettespids. Kulturerne blev vasket med PBS. På dette tidspunkt (t = 0 h), blev sårkanterne fotograferet. Cellerne blev derefter dyrket i medium suppleret med 0,05% FBS i op til 72 timer og sårkanterne blev fotograferet på forskellige tidspunkter.

Migration assay

kemotaktiske respons på det stromale celle -afledt faktor-1α (SDF-1α) af HIF-1α og HIF-2a-lyddæmpet og kontrolceller blev vurderet ved anvendelse Boyden-kamre (3 um porestørrelse). I alt 1 × 10

5-celler blev tilsat til den øvre del af kammeret, og den nedre del af kammeret indeholdt SDF-1α (200 ng /ml i 0,05% FBS). For at opnå de absolutte antal migrerende celler, flowcytometrisk tæller for hver prøve blev opnået for en konstant, forudbestemt volumen og derefter sammenlignet med dublerede flowcytometrisk tællinger opnået fra kontrolbrøndene.

xenograft tumor model

valgte kloner af stabilt kontrol-, HIF-1α- eller HIF-2α-transficerede celler blev selekteret og screenet ved hjælp af flowcytometri for at bestemme HIF-1α og HIF-2α silencing effektivitet i sammenligning med kontrolceller. De celler, som viser den højeste knockdown effektivitet blev dyrket og anvendt til xenotransplantation i immunkompromitterede mus. For hvert injektionssted, 1 x 10

6 HIF-1α- eller HIF-2a-lyddæmpet celler blev resuspenderet i en høj koncentration af Matrigel (BD Biosciences), fortyndet i PBS til en slutkoncentration på 50% og subkutant (sc ) injiceret i flankerne af seks uger gamle nøgne mus (n = 5). Hver mus blev injiceret i øverste højre flanke med kontrol celler, ind i den nederste højre flanke med HIF-1a-tavshed celler, og ind i nederste venstre flanke med HIF-2a-lyddæmpet celler.

For xenotransplantater anvender CD44

– /CD133

– eller CD44

+ subpopulationer, celler blev opnået fra SW480-celler stabilt transficeret med kontrol pSUPER plasmid eller med pSUPER HIF-1α eller HIF-2α RNAi ved FACS cellesortering. De oprensede subpopulationer for hver betingelse blev opsamlet ved trypsinering. Derefter 1 × 10

4 celler pr injektionssted blev resuspenderet i vækstfaktor-reducerede Matrigel matrix, fortyndet i PBS til en slutkoncentration på 50% og s.c. injiceret i flankerne af seks uger gamle nøgne mus. Hver mus (n = 5 for hver betingelse) blev injiceret i den højre flanke med CD44

– /CD133

– celler og i den venstre flanke med CD44

+ celler oprenset fra hver betingelse (kontrol, HIF- 1α knockdown, eller HIF-2α knockdown). Fire uger (for RKO eller SW480-afledte celler) eller to uger (for SW620-afledte celler) efter podning, blev dyrene aflivet, og tumorerne blev fjernet og vejet.

Transfektion og luciferasereportergen assay

cellerne blev podet på 24-brønds plader ved en densitet på 1,2-1,8 × 10

5 celler pr. Fireogtyve timer efter podning blev cellerne anbragt i serum-frit medium og transficeret med 1 ug af et reporterplasmid (pTOPFlash) eller kontrol-plasmid (pFOPFlash) og med 0,05 ug af pRL luciferase plasmid eller CMV-GFP plasmid (transfektion kontrol). Luciferasereporteren aktivitet i cellelysaterne blev målt 24 timer efter transfektion under anvendelse af Dual Luciferase Assay kit (Promega, Madison, WI, USA). Aktiviteten blev normaliseret i forhold til aktiviteten af ​​

Renilla

luciferase eller med hensyn til proteinindholdet i hver prøve.

Immunofluorescensanalyse

SW480 kontrol eller HIF-1α- eller HIF-2α knockdown-celler blev dyrket på dækglas. Cellerne blev fikseret, permeabiliseret og co-immunfarvet med antistoffer mod β-catenin, E-cadherin, vimentin og snail 1. Fluorescensen blev analyseret ved laser konfokal mikroskopi som beskrevet i en tidligere rapport [16]. β-catenin og vimentin blev visualiseret med Alexa 647-konjugeret gede-anti-muse-antistof, og E-cadherin og snail 1 blev visualiseret med Cy3-konjugeret gede-anti-kanin-antistof. Cellen fluorescens blev afbildet under anvendelse af et konfokalt mikroskop (Leica TCS SP5) med en krypton argon laser. En kontrolprøve af celler blev farvet med det sekundære antistof kun at bekræfte, at ingen fluorescens signal blev detekteret fra disse celler.

Etiske erklæring

Alle dyrene blev håndteret i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af Animal Eksperimentelle bioetik retningslinjer Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, México. Desuden blev alle dyreforsøg godkendt af Animal Experimental Bioetik Udvalg Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Universidad Nacional Autónoma de México. Når angivet blev musene aflivet med CO

2.

Statistisk analyse

De data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM). Statistisk analyse af data blev udført under anvendelse af Students

t

test eller en envejs-ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest. En værdi på p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

HIF-1α og HIF-2α udtrykkes i colon cancerceller, men ikke i ikke-maligne celler under normoxiske betingelser

.

Hypoxi er en almindelig tilstand observeret i en lang række faste tumorer, og HIF over-ekspression er ofte forbundet med metastase og dårlige kliniske resultater.

In vivo

, hypoxi er sandsynligvis også være en funktionel del af en normal stamcelle niche. Men betydningen af ​​iltsvind i CSC vedligeholdelse forbliver stort set ukendt [17]. Fordi høj HIF ekspression er blevet påvist i tumorceller i fravær af hypoxi, sammenlignede vi ekspressionen af ​​disse faktorer i dyrkede coloncancer celler under normoxiske og hypoxiske betingelser med dyrkede ikke-malign 112CoN celler, der blev inkuberet under de samme betingelser ved Western blot . De i figur 1 resultater viser, at som forventet, hypoksi (3% O

2) inducerede ekspression af både HIF-1α og HIF2-α i både normale (112CoN) og kræftceller; dog under normoxiske dyrkningsbetingelser (20% O

2), kun de tyktarmskræft celler co-udtrykte både HIF-1α og HIF-2α, mens de ikke-maligne 112CoN celler ikke udtrykke disse faktorer, normoksiske forhold.

Normalt kolon (112CoN) eller kolon kræftceller blev dyrket under normoxi (20% O

2) eller hypoxi (3% O

2) i 12 timer. Total celleekstrakter af tyktarmen cellelinier blev fremstillet, og prøverne blev underkastet 10% SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Et immunoblot-analyse blev udført ved anvendelse af anti-HIF-1α eller anti-HIF-2a antistoffer som vist i figuren, og udviklet ved hjælp af et peberrodsperoxidasekonjugeret andet antistof. Actin antistof blev anvendt til at kontrollere for lige belastning. En densitometrisk analyse blev udført for at estimere niveauet af HIF-1α og HIF-2α ekspression, som blev normaliseret til de tilsvarende ekspressionsniveauer i ikke-maligne 112CoN celler. Alle assays blev udført tredobbelt, og dataene repræsenterer middelværdier ± SEM fra mindst tre uafhængige assays. * P. 0,05

Stabil knockdown af HIF-1α, men ikke HIF-2α nedsætter laktat produktion af kolon kræftceller under normoxiske betingelser

For at forstå de roller, som HIFs i kræft spillede fænotype vedligeholdelse og deres mulige samspil med kanoniske Wnt signalering, vi undersøgt virkningerne af den stabile knockdown af HIF-1α og HIF-2α af siRNA i SW480 celler, som udviser konstitutivt aktiv kanonisk Wnt signalering. Plasmiderne anvendt i denne undersøgelse, blev konstrueret og tidligere med succes probet af Dr. Daniel C. Chung [10], der venligt doneret plasmiderne til os. SW480-celler blev transficeret med kontrol scrambled shRNA plasmid, pSUPER HIF-1α RNAi eller pSUPER HIF-2α RNAi. Stabile transfektanter blev udvalgt under anvendelse af et antibiotikum i fire uger, og klonerne blev udvalgt og screenet ved hjælp af flowcytometri for HIF-1α og HIF-2α silencing i sammenligning med kontrolceller. Stabile transfektanter udviser et fald på mindst 85% i HIF-1α ekspression og et fald på mindst 90% i HIF-2α ekspression blev opnået og udvalgt ved flowcytometri som vist i figur 2A. Kræftceller udviser øget glykolyse og laktat produktion og faldt O

2 forbrug sammenlignet med ikke-transformerede celler, et fænomen kendt som Warburg effekten [18]. I overensstemmelse med denne effekt, Figur 2B viser, at en betydelig stigning i lactat produktion var tydelig i SW480 og RKO colon cancerceller sammenlignet med de ikke-maligne 112CoN colonceller. Vi derefter undersøgt virkningerne af den stabile silencing af hver HIF på lactat produktion af SW480 cancerceller under normoxi eller hypoksi. Som observeret i figur 2C, den stabile knockdown af HIF-1α i SW480-celler faldt lactatproduktion med mindst 50% sammenlignet med kontrolcellerne under normoxiske betingelser, hvorimod HIF-2α kun knockdown ført til et fald på 20% i lactat sekretion sammenlignet med kontrol celler under de samme betingelser (figur 2B). Efter 12 timers udsættelse for akut hypoxi, blev niveauerne af HIF proteiner forhøjet, og niveauerne af laktat produktion genvundet (Figur 2C). For således at undgå HIF overekspression, hvilket kunne tilsidesætte knockdown effektivitet (vist i fig S1) og gøre det vanskeligt at dissekere den rolle, som hver HIF i opretholdelsen af ​​den maligne fænotype spillede, besluttede vi at udføre de fleste analyser under normoxiske betingelser.

A). Stabile HIF-1α- eller HIF-2α-Knockdown eller kontrol (krypteret shRNA plasmid) transfektanter blev opnået som beskrevet i “Materialer og metoder”. Udvalgte kloner blev screenet ved hjælp af flowcytometri for at vurdere inaktivering af HIF-1α og HIF-2α i sammenligning med kontrolceller. B). Laktat sekretion blev øget betydeligt i kolorektale cancer cellelinjer sammenlignet med ikke-maligne 112CoN celler. C). Ændringer i lactat sekretion med HIF-1α- eller HIF-2α- tavshed SW480-celler i sammenligning med kontrolceller (CTR i figuren) dyrket under normoxi (20% O

2) eller hypoksi (3% O

2) i 24 timer. L-lactat blev bestemt ved en LDH enzymatisk assay som beskrevet i “Materialer og metoder”. Alle assays blev udført tredobbelt, og dataene repræsenterer middelværdier ± SEM fra mindst tre uafhængige assays. *: P. 0,05

Stabil knockdown af HIF-1α eller HIF-2α frembragte en stigning i basal eller H

2O

2-induceret apoptose i SW480 colon cancerceller

Det er velkendt, at HIF-1α fremmer celle overlevelse og apoptose modstand i flere cellesystemer under hypoxi. Vi udforskes, om blokaden af ​​HIF-1α eller HIF-2α udtryk i celler kræft, der udtrykker begge faktorer under normoxi påvirker også cellulære overlevelse. Vi anvendte hydrogenperoxid til at inducere akut apoptose, fordi det er blevet bredt rapporteret at være en potent inducer af apoptose i cancerceller på grund af produktionen af ​​alvorlig oxidativ stress. HIF-lyddæmpet SW480-celler blev behandlet med 1 mM H

2O

2 i 12 timer og derefter graden af ​​celleapoptose blev bestemt ved Annexin V-PI-farvning efterfulgt af flowcytometri analyse. Både apoptose og nekrose blev forstærket under normoxi som følge af HIF-1α eller HIF-2α silencing sammenlignet med kontrolcellerne, selv i fravær af apoptoseinducer (øvre del af figur 3). Imidlertid er andelen af ​​apoptotiske og nekrotiske celler opnået som et resultat af HIF-1α silencing var større end den induceret af HIF-2α knockdown i forhold til kontrollerne, og denne virkning var mere indlysende, når cellerne blev behandlet i 12 timer med 1 mM H

2O

2 (figur 3). Således er disse resultater antyder, at HIFs, navnlig HIF-1α, er involveret i fremme af celleoverlevelse og resistens over for apoptose.

Apoptose blev induceret ved dyrkning af HIF-lyddæmpet eller kontrol (transfekteret med røræg shRNA plasmid og angivet i figuren som CTR) celler i fravær eller nærvær af 1 mM H

2O

2 i 12 timer. SW480-celler blev trypsiniseret, vasket to gange med PBS, og ubehandlede (bærer) eller behandlet med H

2O

2 i 12 timer. Kulturerne blev farvet med Annexin V og PI, som beskrevet i “Materialer og metoder”, og analyseret ved flowcytometri. Alle assays blev udført tre gange (et repræsentativt histogram over data er vist), og grafen viser de middelværdier ± SEM fra tre uafhængige forsøg; *: P 0,05; **: P. 0,01

Stabil knockdown af HIF-1α eller HIF-2α mindsket celle migration af SW480 kræftceller, men kun HIF-1α knockdown hårdt ramt CXCR4-medieret kemotaksi

Vi udførte sårhelende assays til at undersøge virkningerne af disse proteiner på cellemigrering. Stabile HIF-1α- eller HIF-2α-lyddæmpet celler blev dyrket under normoxi til konfluens, og derefter ridser blev foretaget på monolaget. Billeder af ridser blev indfanget ved 0 og 48 timer, og ridse området blev analyseret på disse tidspunkter. Som det kan ses i figur 4A, i sammenligning med kontrollerne, blev migration blokeret af knockdown af HIF-1α eller HIF-2α (se henvisning grænselinjer trukket på billederne). Desuden evalueringen af ​​den cellulære migration baseret på den kemotaktiske aktivitet over SDF-1α medieret af CXCR4-receptoren viste, at CXCR4 ekspression blev reduceret som følge af HIF-1α, men ikke HIF-2α knockdown (figur 4B). I overensstemmelse med dette fund, undertrykkelse af HIF-1α-ekspression næsten afskaffet SDF-1α- CXCR4-medieret migrering af cancerceller gennem Transwell kamre, hvorimod inaktivering af HIF-2α ekspression faldt cellemigration ved kun 45% i forhold til kontrollerne (figur 4C).

A) En sårhelende assay blev anvendt til at bestemme, om den cellulære migration er afhængig af enten HIF-1α eller HIF-2α ekspression. SW480 knockdown og kontrol (krypteret shRNA plasmid) -celler blev dyrket til konfluens på 24-brønds vævskulturplader, og sårhelende assay blev udført som beskrevet i “Materialer og metoder”. Den ridsede område blev afbildet umiddelbart efter sårdannelse (tid 0) og 48 timer efter sårdannelse. Disse billeder er repræsentative for tre uafhængige forsøg. B) CXCR4 udtryk faldet som følge af HIF-1α knockdown. SW480 kontrol og tavse celler, som indikeret i figuren, blev frigjort under anvendelse af EDTA og vasket, og 1 x 10

5-celler blev inkuberet med muse biotin-konjugeret anti-CXCR4 og allophycocyanin-konjugeret streptavidin antistof og undersøgt ved flowcytometri. Dataene viser den mediane fluorescensintensiteter af CXCR4 udtryk og SSC (side-spredt lys, proportional med celle kornethed), og repræsenterer middelværdier ± SEM fra tre uafhængige forsøg. *: P 0,05; **: P 0,01. C) Signifikante forskelle blev observeret i SDF-1α-induceret kemotaktisk respons. Den kemotaktiske respons på SDF-1α af HIF-1α- eller HIF-2α-Knockdown eller kontrolceller (Ctr i figuren) blev vurderet ved anvendelse Boyden-kamre som beskrevet i “Materialer og metoder”. Cellerne blev inkuberet i 48 timer for at give mulighed for migration og udvindes under anvendelse af EDTA. Resultaterne repræsenterer de midler ± SEM fra tre forsøg udført in duplo. *: P 0,05; **: P. 0,01

Stabil silencing af HIF-1α eller HIF-2α faldt in vivo tumorigen aktivitet af indpodede coloncancerceller

Virkningen af ​​stabile siRNA-