PLoS ONE: Den intracellulære Lokalisering af ID2 Expression Har en Prædiktiv værdi i ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Baggrund

ID2 er medlem af en underklasse af transskription regulatorer tilhører den generelle bHLH (basic-helix-loop-helix) familie af transkriptionsfaktorer. I normale celler, ID2 er ansvarlig for at regulere balancen mellem proliferation og differentiering. Nyere undersøgelser har vist, at ID2 er involveret i tumor progression i flere kræfttyper, såsom prostata eller bryst.

Metodologi /vigtigste resultater

I dette arbejde, vi undersøgte, for første gang, forholdet mellem ekspressionen af ​​ID2 i ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) patienter og de klinisk-patologiske træk og prognose af disse patienter. Immunhistokemi blev udført på væv microarrays, som omfattede 62 NSCLC-tumorer. I maligne væv, er blevet opdaget ID2 udtryk i både nukleare og cytoplasmatiske rum, men vi har vist, at kun nukleare udtryk for ID2 er omvendt korreleret med differentiering karakteren af ​​tumor (p = 0,007). Interessant, blandt patienter med dårligt differentierede tumorer, høj nukleare udtryk for ID2 var en uafhængig og ugunstig prognostisk faktor for overlevelse (p = 0,036).

Konklusioner

Disse resultater tyder på, at ID2 kunne inddrages i tumor dedifferentiation processer NSCLC, og kunne bruges som prognostiske markør for patienter med dårligt differentierede tumorer

Henvisning:. Rollin J, Bléchet C, Régina S, Tenenhaus A, Guyétant S, Gidrol X (2009) Den intracellulær Lokalisering af ID2 Expression Har en Prædiktiv værdi i ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 4 (1): e4158. doi: 10,1371 /journal.pone.0004158

Redaktør: Axel Imhof, universitetet i München og Center of Integrated Protein Science, Tyskland

Modtaget: Juli 8, 2008; Accepteret: December 4, 2008; Udgivet: 8. januar 2009

Copyright: © 2009 Rollin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ID2 (hæmmer af DNA-binding 2) hører til en underklasse af proteiner, ID familien, findes inden for store bHLH (basic-helix-loop-helix) gruppe af transkriptionsfaktorer. Interessant, da de ikke besidder den basiske domæne, ID-proteiner ikke binder direkte til DNA og i stedet virke som dominante negative antagonister af klasse A bHLH transkriptionsfaktorer. Blandt de kendte mål for ID proteiner er E-proteinet og medlemmer af Ets familien [1]. ID-proteiner er involveret i væv udvikling [2], [3], og er blevet beskrevet som inhibitorer af differentiering i mange celletyper, herunder myeloide celler [4], B-lymfocytter [5], og muskelceller [6]. ID2 ekspression er generelt lav i normale væv, og opreguleres i tumorer. Høje niveauer af ekspression er blevet observeret i maligniteter såsom neuroblastom [7], [8], kolorektal adenocarcinom [9], Ewing sarkom [10], prostatacancer [11], og bugspytkirtelkræft [12]. Tilsammen disse resultater tyder på, at ID2 kan spille en vigtig rolle i tumor initiering og progression.

Til dato er der kun en enkelt undersøgelse evaluere rolle ID2 i lungekræft, specifikt i småcellet lungecancer (SCLC ) [13]. Lungekræft er en førende årsag til kræftdødsfald i hele verden. Den mest rigelige histologiske type, der påvirker ca. 80% af patienterne er ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), i modsætning til småcellet lungecancer. Den samlede 5-års overlevelsesraten for NSCLC patienter er omkring 15% [14]. Når en diagnose er blevet etableret, er behandlingsmuligheder typisk baseret på scenen og histologi [15], selv om denne stratificering ordning ikke konsekvent afspejler biologi tumor. Som et resultat, vil over 50% af patienter med tidlige fase lungekræft sidst dør, mens andre på en mere fremskredent stadium vil overleve [14], [16], ligger til grund for behovet for yderligere prognostiske markører til bedre at forudsige resultatet af sygdom [17].

i dette papir, har vi vurderet udtryk for ID2 ved immunhistokemi på NSCLC væv mikroarrays indeholdende 62 tumorer. Vi derefter yderligere undersøgt forholdet mellem ID2 udtryk og clinicopathologic parametre, for at vurdere dets mulige rolle som prognostisk markør for NSCLC.

Resultater

ID2 Expression i Normal Lung og i NSCLC væv

Immunfarvning for ID2 blev udført på en tumor microarray (TMA) indeholdende 62 NSCLC prøver fra humane patienter. De kliniske og histologiske træk ved patienter er beskrevet i tabel 1. I ikke-kræft lungevæv, svag til moderat ID2 ekspression blev detekteret i bronkiale epitelceller i både cytoplasmaet og kerner. Desuden blev svag ID2 farvning observeret i cytoplasmaet i endotelceller (Figur 1A-D)

A-B:. ID2 farvning af epitel- og endotelceller i ikke-kræft lunge. C-F: Repræsentativ ekspression på TMA med stærk ID2 farvning i kernen og med moderat (C, D) eller svage (E, F) cytoplasmatisk farvning. C, D er ringe differentierede adenocarcinomer og E, F er en dårligt differentieret storcellet carcinom. G-H: Tumor med fravær af nuklear farvning med moderat (G, H) cytoplasmatisk udtryk for ID2. G, H er moderat differentieret planocellulært karcinom.

ID2 udtryk i tumorceller fra de 62 NSCLC patienter meget forskelligartede både med hensyn til intensitet og lokalisering (figur 1). Ud af 62 NSCLC-patienter, en stor andel (98%, 61/62) udtrykt ID2-protein næsten udelukkende i tumorceller (median af global farvning score = 3; 0 til 18). Nuklear immunoreaktivitet var positiv i 33 (53,3%) af de NSCLC prøver (median af nuklear farvning score = 1; 0 til 11), og cytoplasmatisk ID2 blev påvist i 57 (92%) ud af 62 tumorer (medianen af ​​cytoplasmatisk farvning score = 2; 0 til 8). Mange dårligt differentierede tumorer udviste stærk ID2 farvning i kerner sammen med svag eller moderat cytoplasmatisk farvning (Figur 1E-J). I modsætning hertil blev ID2 ikke udtrykkes i kerner af delvist eller veldifferentierede tumorer, mens svag til moderat ekspression blev observeret i cytoplasmaet (figur 1K-P).

Association of ID2 Expression med klinisk-patologisk Parametre

medianen af ​​farvningen score for enten nuklear, cytoplasmatisk eller global ekspression af ID2, som beskrevet ovenfor, blev anvendt som en cut off at klassificere patienter i to grupper: “lav” (dvs. lav ID2 ekspression) og “høj” (dvs. høj ID2 ekspression). Multipel komponent analyse (MCA) blev udført på data indsamlet fra de 62 patienter og den grafiske gengivelse er præsenteret i figur 2A. Kort fortalt er variable kvarterer på grafen potentielt associeret sammen. MCA viste, at lav nuklear ekspression af ID2 var forbundet med veldifferentierede tumorer og lymfeknude involvering. I modsætning hertil blev der høj ekspression af ID2 i kernen set oftere i tumorer, der var dårligt differentieret og havde avancerede lokal invasion (T3-T4 status). I samarbejde med MCA blev DEMOD analyse udført og viste en signifikant sammenhæng mellem nuklear ekspression af ID2 og histologisk differentiering af NSCLC (figur 2B). Vores resultater viste 15 ud af 17 (88%) veldifferentierede tumorer udviste lave ekspressionsniveauer af ID2. Desuden dårligt differentierede tumorer havde stærk nuklear ekspression af ID2 (p = 0,007) i 12 ud af 19 (63%) tilfælde. Der blev dog ikke signifikant sammenhæng fundet mellem ID2 udtryk og lymfeknude involvering eller T-status, muligvis på grund af den ulige fordeling af T-status mellem grupper (52 og 10 patienter i T1-T2 og T3-T4, henholdsvis). Cytoplasmisk ekspression af ID2 var ikke forbundet med differentieringen kvalitet af den NSCLC, men viste sig overraskende forbundet med den histologiske type af tumorer. Tumor udtryk for ID2 var høj i 22 ud af 33 (67%) tilfælde af adenocarcinom i forhold til 5 ud af 19 (26%) tilfælde af pladecellekræft (p = 0,016) (Figur 2B).

A : Nuclear, cytoplasmisk, og global ekspression af ID2 inden NSCLC-tumorer er blevet anvendt som aktive variabler og er repræsenteret ved fed kvadrater og cirkel. Klinisk-patologiske træk (dvs. differentiering, histologisk type, genre, rygerstatus stadium og TNM klassifikation) er blevet anvendt som illustrative variabler og er repræsenteret ved åbne sugetablet. Alle variabler blev placeret i henhold til grovheden centrum for alle patienter, der tilhører den repræsenterede kategori. Kliniske parametre potentielt associeret med ID2 ekspression er understreget og med kursiv. B: DEMOD analyse blev udført for at identificere de statistiske associationer mellem ID2 ekspression og klinisk-patologiske træk. Kun parametre identificeret med MCA er blevet præsenteret i tabellen (dvs. histologisk type, T-status, lymfeknude involvering status, og differentiering af tumor).

univariate og Multivariate Survival Analysis

for at afgøre, om immunfarvning af ID2 havde en prognostisk værdi, vi undersøgte sammenhængen mellem globale, nukleare, og cytoplasmatisk udtryk for ID2 med den overordnede overlevelse af patienter. Først, vi analyserede konventionelle klinisk-patologiske parametre. Vi observerede en væsentlig effekt af tumor fase (p = 0,0001) og tumorstørrelse (p = 0,014) på ​​patientens samlede overlevelse (figur 3A-C), mens nodal status (n0 vs. N +) var borderline signifikans (p = 0,06) . Histologisk differentiering var ikke en prognostisk markør i vores kohorte af NSCLC-patienter (p = 0,48; data ikke vist). Ligeledes har vi ikke oplever en betydelig forskel i den samlede overlevelse mellem patienter med høje ekspressionsniveauer af ID2 og de udviser lave ekspressionsniveauer af ID2 (Figur 3D-E). Men efter lagdeling af data i henhold til histologisk differentiering (Figur 3G-I), dårligt differentierede NSCLC patienter med højt nukleart udtryk viste en kortere samlet overlevelse end patienter med lav ID2 nukleare udtryk (median overlevelse = 24 vs. 41 måneder, henholdsvis ; p = 0,036, figur 3G). Desuden multivariat analyse ved hjælp Cox ‘regressionsmodel viste, at nukleare ID2 udtryk hos patienter med dårligt differentierede tumorer var en uafhængig prognostisk faktor af den samlede overlevelse (p = 0,034; RR = 13,7; IC 95% = 1,2 til 161, tabel 2). Nr prognostiske værdi af ID2 nuklear ekspression blev observeret i moderate eller godt differentierede tumorer (data ikke vist)

A-F:. Kaplan-Meier-kurver for alle de NSCLC-patienter (n = 59) ifølge sygdomsstadium (A), nodal status (B), T-status (C), nuklear (D), cytoplasmatisk (E), og global ekspression af ID2 (F). G-I: Kaplan-Meier-kurver opnået for patienter med dårligt differentieret tumorer (n = 18) i overensstemmelse med nuklear (G), cytoplasmatisk (H), og global (I) ekspression af ID2. Kurver blev sammenlignet med log-rank test.

Diskussion

rolle ID2 er blevet undersøgt i flere typer af kræft (dvs. prostata, bryst, kolorektal, neuroblastom , og for ganske nylig småcellet lungekræft), men til dato intet er kendt om ekspressionen af ​​ID2 i ikke-småcellet lungekræft, som berører 80% af patienter med lunge maligniteter. Her har vi fokuseret på ekspressionen af ​​ID2 i NSCLC og dens forhold til de klinisk-patologiske parametre og prognose af sygdommen. Ekspression af ID2 blev evalueret i 62 NSCLC-tumorer ved immunhistokemi under anvendelse af væv microarrays. Mens størstedelen af ​​de analyserede i denne undersøgelse patienter udtrykte ID2, patientgruppen var meget heterogen med hensyn til både ekspressionsniveauet og intracellulær lokalisering. Vi har imidlertid påvist, at høj ID2 ekspression i kerner synes at være korreleret med dårlig differentiering af tumoren. Denne observation er godt i overensstemmelse med kendte egenskaber ID2, eftersom proteinet er blevet karakteriseret som en inhibitor af differentiering i talrige væv, herunder epidermis og muskel [18], [19]. Således ID2 inhiberer muskulære differentiering ved direkte interaktion med MyoD, et bHLH transkriptionsfaktor kræves til myoblastisk differentiering [20]. Desuden i prostata karcinom, blev stærk ID2 udtryk forbundet med dårligt differentierede kvaliteter af tumor, hvilket tyder på, at ID2 også kan inddrages i reguleringen af ​​tumor dedifferentiation [11], [21]. Vores data viser, at et højt nukleart ekspressionsniveau af ID2 var en uafhængig og negativ prognostisk markør for overlevelse hos patienter med dårligt differentierede lungetumorer. Således patienter med tumorer, der udviser høj nuklear ekspression af ID2 har 13,7 gange højere risiko for at dø end patienter med lav ekspression af ID2. Den prognostiske værdi af høj ID2 ekspression er allerede blevet påvist i andre typer cancer, såsom neuroblastom og prostatacancer [7], [11], [21], [22], [23]. Imidlertid har tidligere undersøgelser af brystkræft og SCLC rapporteret, at høj cytoplasmatisk ekspression af ID2 var forbundet med en god prognose, hvorimod der ikke blev fundet nogen korrelation mellem nuklear ekspression af ID2 og overlevelsen af ​​patienter [13], [22]. Kamalian

et al.

Foreslog, at i SCLC forøget ekspression af ID2 i cytoplasma kunne være på grund af sin eksport fra kerner og kan reducere pro-tumorale effekt af ID2. Disse resultater var globalt i overensstemmelse med vores undersøgelse, som vi vist en direkte sammenhæng mellem nukleare udtryk for ID2 og overlevelse af patienter. forskelle med hensyn ID2 lokalisering, kan dog have oprindelse i en del af forskellene mellem de to sygdomme, men også af forskelle i specificiteten af ​​antistofferne. Faktisk har vi brugt Zymed antistoffer som anbefalet af Perk

et al.

, Der advarede mod brugen af ​​dårligt specifikke ID2 antistoffer [24]. Sammenlagt vores data tyder på, at både ID2 udtryk og intracellulær lokalisering skal evalueres for at bestemme prognosen for kræftpatienter, herunder med lungekræft. Den intracellulære lokalisering af ID2 kan spille en vigtig rolle i kontrollen af ​​ID2 funktion og celleskæbne regulering. Kurooka

et al.

Bestemt, at nucleo-cytoplasmatisk shuttling af ID2 er en aktiv mekanisme afhænger af CRM-1-proteinet, og er omvendt korreleret til transkriptionel repression via E-boxen sekvens [25]. Desuden Lasorella og Iavarone viste, at interaktionen mellem ID2 og actin-associerede protein enigma homolog (ENH) styrer også lokaliseringen af ​​ID2 [26]. Faktisk nedregulering af ENH ekspression forhindrer relocalization af ID2 ind i cytoplasmaet i differentierede neuroblastomceller. Dette resultat giver os mulighed for at spekulere på det fremgår, at ENH eller CRM-1 protein i dedifferentieringen mekanisme NSCLC. Vores resultater indikerer, at nuklear ID2 sandsynligvis er en prognostisk faktor i NSCLC og ENH-medieret translokation af ID2 til cytoplasmaet kan forklare manglen på prognostisk værdi for cytoplasmatisk ID2. Men den rolle ID2 opdelingen i lunge tumor progression, selvom potentielt interessant, ville kræve yderligere vurdering.

Den mekanisme, der ID2 fremmer lunge tumor progression er ikke klart endnu. Men resultaterne opnået i andre modeller antyder, at virkningen af ​​ID2 kunne afhænge af inhibering af Rb tumor suppressor pathway [3], [27]. Desuden er det blevet påvist, at ID2 også regulerer angiogenese og apoptose via transkriptionel regulering af

VEGF

BCL2

gener, henholdsvis [28], [29]. Imidlertid kunne virkningen af ​​ID2 også være vævsspecifik: i brystcancer-cellelinier, høj ekspression af ID2 reducerede vækstpotentiale og invasivitet, medens opregulering af ID2 forøget proliferation og invasive potentiale i prostata tumorceller [11], [22], [23].

Endelig, selv om vores resultater er foreløbige, de foreslår, at ID2 kunne inddrages i tumor dedifferentiation processer NSCLC, og kunne bruges som prognose markør for patienter med dårligt differentierede tumorer. Interessant nok i NSCLC, dårligt differentierede karcinomer er vanskelige at klassificere, og som sådan, kan identifikation af nye prognostiske beslutningstagere for denne særlige gruppe hjælpe med at forbedre det terapeutiske resultat af patienterne.

Materialer og Metoder

tumor prøver

Vi har analyseret vævsprøver opsamlet i et prospektivt gruppe på 62 patienter med NSCLC, som havde fået foretaget komplet kirurgisk resektion af lunge tumor som en indledende behandling (dvs. uden forudgående strålebehandling eller kemoterapi) mellem januar 2002, og august 2004 i thorax kirurgisk Institut for Trousseau Hospital (Tours, Frankrig). Kirurgiske prøver blev fikseret i 10% formalin og paraffin indlejret til rutinemæssig histologisk undersøgelse og immunhistokemi. Histologiske typer, differentiering, TNM klassifikation, og scene gruppering (opsummeret i tabel I) blev bestemt i overensstemmelse med World Health Organization (WHO) kriterier for lungetumorer [30]. Skriftligt samtykke blev opnået fra alle patienterne i denne undersøgelse som anbefalet af fransk lovgivning.

Tissue Microarray Manufacturing og Immunhistokemi

For væv microarray (TMA) fremstilling, repræsentative områder af NSCLC prøverne blev identificeret ved en kirurgisk patolog på hæmatoxylin-eosin (HE) farvede lysbilleder. For hver tumor blev tre centrale biopsier 1 mm i diameter og derefter tages fra udvalgte områder af donorblokke og opstillet i en recipient paraffinblok bruge en manuel væv arrayer (Beecher instrumenter, Sun Prairie, USA). Snit (4 um tykke) af TMA blokke blev skåret og immunohistokemi blev udført under anvendelse af et kanin polyklonalt antistof dannet mod ID2 (ZMD.325, Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig). Kort fortalt blev TMA sektionen deparaffineret, rehydreret, og underkastes varme antigen-genvinding i en ethylendiamin tetraeddikesyre puffer (MS-Unmasker, pH 7,8, Diapath) i 20 min. ID2 antistof blev påført i et 1/50 fortynding. Immunfarvning blev udført med Lab Vision Autostainer (Lab Vision, Fremont, USA) under anvendelse af et biotin-streptavidin-peroxidase påvisningssystem med diaminobenzidin som chromogen (ChemMate ™ Detection Kit, DakoCytomation). Slides blev hæmatoxylin modfarvet. TMA indeholdt kerneprøver af normal bronchiolær mucosa og lungevæv. Specificitet af ID2 antistof var kontrol ved anvendelse af oprenset ID2-protein som negativ kontrol til at blokere binding af ID2 antistoffer til tumorceller (fig S1).

To uafhængige observatører (JR, CB) evalueret både lokaliseringen og intensiteten af den ID2 farvning. Denne evaluering blev blindet til de kliniske data. Både nukleare og cytoplasmatiske farvning snesevis af tumorceller blev etableret ved at gange farvningsintensitet skaleret fra 0 til 3 (null = 0, svag = 1, moderat = 2, og stærk = 3) ved procentdelen af ​​positive celler (0 = 10%; 1 = 10-25%; 2 = 26-50%, 3 = 51-75%, 4 = 75%). Global udtryk for ID2 i tumorceller blev opnået ved tilsætning af nukleare og cytoplasmatiske farvning scoringer.

Statistisk analyse

Multiple komponent analyse (MCA) blev udført på data indsamlet fra 62 patienter, der bruger SPAD software . Denne metode er en beskrivende multivariat analyse, der giver mulighed for hurtig identifikation af statistiske relationer mellem variabler. Kort fortalt de forskellige kategorier, dvs. ID2 udtryk og klinisk-patologiske træk, var placeret i flerdimensionale rum. For at observere afstande mellem punkter, blev de projiceret på et fly af to ortogonale faktorer,

F

1 og

F

to. Disse ‘første’ faktorer blev valgt til at være de mest repræsentative for den globale varians af data. Fordi placeringen af ​​kategorier af aktive variable (nukleare, cytoplasmatisk og global udtryk for ID2) og placeringen af ​​observationer (fase, lymfeknude status, tumor status, histologiske typer, kvalitet af differentiering, genre, og rygning status) er beregnet i på samme måde, kan de placeres på den samme graf (bemærkninger erstattes af tyngdepunkter). DEMOD metode (SPAD software), svarende til chi-square test, blev også brugt til at supplere MCA til at analysere sammenhængen mellem de aktive variabler (nukleare, cytoplasmatisk, og global udtryk for ID2) og de illustrative variabler (klinisk-patologiske funktioner).

Samlet overlevelse blev beregnet fra tidspunktet for histologi diagnose til datoen for død på grund af enhver årsag. Den samlede overlevelsesrate blev analyseret i henhold til Kaplan-Meier-metoden, og forskellene i overlevelsesrater blev vurderet ved log-rank test (MedCalc softwareversion 7.3.0.1). Multivariat analyse af prognostiske faktorer blev udført ved hjælp af Cox proportional hazard model (MedCalc).

Støtte Information

Figur S1.

Immunohistokemisk analyse af paraffinindlejret human NSCLC anvendelse af kanin polyklonalt antistof mod ID2. IHC blev udført med antistof alene (A og C) eller efter neutralisering af antistof ved præinkubering med 2 ug /ml renset ID2 protein (ID2 rekombinant protein P01, Abnova, Taiwan), natten over ved 4 ° C, (B og D).

doi: 10.1371 /journal.pone.0004158.s001

(9.11 MB TIF)

Tak

Vi er taknemmelige til A De Muret (Département d’Anatomie Pathologique, CHRU de Tours, Frankrig) og professor P Dumont (Département de Chirurgie thoracique, CHRU de Tours, Frankrig) for at levere de lunge prøver.