PLoS ONE: Rolle Chaperone Mediated Autophagy (CMA) i nedbrydningen af ​​fejlfoldet N-RU Protein i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Cells

Abstrakt

Nuklear receptor co-repressor (N-RU ) spiller vigtig rolle i transkriptionel kontrol medieret af flere tumor suppressor proteiner. For nylig rapporterede vi en rolle fejlfoldet-konformation afhængig tab (MCDL) N-RU i aktiveringen af ​​onkogene overlevelse vej hos akut promyelocytisk leukæmi (APL). Da N-RU spiller vigtig rolle i cellulær homeostase i forskellige væv, derfor, vi hypotese, at en APL som MCDL af N-RU også kan være involveret i andre malignitet. Faktisk vores indledende screening af N-RU status i forskellige leukæmi og solid tumorceller afslørede en APL som MCDL af N-RU i primære og sekundære tumorceller afledt af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Den specifikke N-RU tab NSCLC celle kunne blokeres af Kaletra, et klinisk kvalitet proteasehæmmer og ved genistein, en inhibitor af N-RU misfoldning tidligere karakteriserede ved os. Den misfoldet N-RU præsenteret i NSCLC-celler var forbundet med amplifikation af ER stress og blev underkastet nedbrydning med NSCLC cellespecifik afvigende proteaseaktivitet. I NSCLC-celler, blev misfoldet N-RU fundet at være associeret med Hsc70, en molekylær chaperone involveret i chaperone medieret autophagy (CMA). Genetisk og kemisk hæmning af Lamp2A, en hastighedsbegrænsende faktor på CMA, betydeligt blokeret tabet af N-RU i NSCLC celler, hvilket tyder på en afgørende rolle, CMA i N-RU nedbrydning. Disse resultater identificerer en vigtig rolle CMA-induceret nedbrydning af fejlfoldet N-RU i neutralisering af ER stress og foreslå en mulig rolle af fejlfoldet N-RU-protein i aktiveringen af ​​onkogene overlevelse vej hos NSCLC-celler.

Henvisning: Ali AB, Nin DS, Tam J, Khan M (2011) rolle Chaperone Mediated Autophagy (CMA) i nedbrydningen af ​​fejlfoldet N-RU Protein i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) Cells. PLoS ONE 6 (9): e25268. doi: 10,1371 /journal.pone.0025268

Redaktør: Michael Sherman, Boston University Medical School, USA

Modtaget: 25. maj 2011; Accepteret: August 30, 2011; Udgivet: 23 September, 2011

Copyright: © 2011 Ali et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud SSCC-04-06 og NMRC /1213/2009 til MK fra Singapore Stem Cell Consortium og National Medical Research Council of Singapore. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Transkriptionelle faktorer og deres beslægtede co-faktorer er de vigtigste regulatorer af udvikling af epitelceller og er blandt de hyppigste mål for onkogen fornærmelse i forskellige menneskelige maligniteter inklusive Lungekræft [1] – [4]. Transkriptionel kontrol bibringes af nuklear receptor co-repressor (N-RU) spiller vigtig rolle i væksten undertrykkende funktion af adskillige tumor suppressor proteiner [5], [6]. Deregulering af N-RU transkriptionel kontrol på grund af en misfoldet konformationsafhængig tab (MCDL) N-RU er blevet impliceret i patogenesen af ​​akut promyelocytisk leukæmi (APL) [7], [8]. Interessant, nogle af de transkriptionsfaktorer og co-faktorer, der oprindeligt blev identificeret som de regulatorer af normal hæmatopoiese blev også fundet at være involveret i reguleringen af ​​normal vækst og udvikling af lunge epitelceller [2] – [4]. Disse fund foreslået, at en betydelig overlapning også kan eksistere i mekanismen bag de blodkræftsygdomme og lungekræft. Lungekræft er den hyppigste årsag til cancerrelateret mortalitet og morbiditet hos mennesker i hele verden. Med en 5-års overlevelse på kun 15%, er det betragtes som en af ​​de mest dødelige kræftformer hos mennesker. Baseret på nuværende tidspunkt kendte histo-patologiske kriterier, er lungekræft groft opdeles i to store undertyper: ikke-småcellet lungecancer [9], [10] og småcellet lungecancer (SCLC) [11]. NSCLC, som består af 80% af alle lungekræfttilfælde i human, er yderligere opdelt i adenocarcinomer, planocellulært karcinom, adenosquamøst carcinomer, og store celle carcinomer [12]. Trods den førende årsag til human mortalitet og mobilitet, er meget lidt kendt om den mekanisme ligger til grund for malign vækst og transformation af celler, der danner størstedelen af ​​tumormassen i lungekræft. Dette skyldes til dels en manglende klar forståelse af onkogene overlevelse mekanisme, der opretholder væksten af ​​maligne celler i næringsstof forarmet og stressende mikromiljø bredt præsenteret i den faste masse af Lungekræft væv.

Nuklear receptor co-repressor (N-RU) er en vigtig komponent i et multi-protein repressor kompleks afgørende for funktionen af ​​mange transkriptionsfaktorer og tumor suppressor proteiner [13] – [16]. Da transkriptionel kontrol bibringes af faktorer som N-RU menes at være involveret i reguleringen af ​​normal vækst og udvikling af celler i forskellige væv undertyper vi derfor en hypotese, at en APL som MCDL af N-RU også kan være forbundet med onkogene vækst i andre humane tumorer. For at teste denne hypotese analyserede vi N-RU status i tumorceller afledt af større human leukæmi og faste tumorer og observeres en selektiv misfoldet konformation afhængig tab af N-RU i flere tumorcellelinier og primære humane cancer væv hidrørende fra NSCLC. I NSCLC-celler, blev misfoldet N-RU fundet at være associeret med Hsc70, en molekylær chaperone involveret i chaperone medieret autophagy (CMA). Genetisk og kemisk hæmning af CMA førte til stabilisering N-RU i NSCLC celler, hvilket tyder på en afgørende rolle, CMA i N-RU tab. Disse resultater illustrerer en mulig rolle af autophagic nedbrydning af fejlfoldet N-RU i neutralisering af ER stress samt i overlevelse og vækst af NSCLC-celler.

Materialer og metoder Salg

Cellelinier og reagenser

Alle lungekræft cellelinier anvendt i dette studie blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC) og blev opretholdt i anbefalet af ATCC medium. Genistein, chloroquin og nikotin blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO, USA), mens Kaletra var fra Abbott Laboratories (IL, USA). N-RU (C-20), PDI og HSC-70-antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mod Lamp-2A (Abcam Inc., MA, USA) og β-actin (Sigma, St. Louis, MO, USA) blev indkøbt fra respektive kilder. Rekombinant flag-tagged N-RU blev fremstillet ud fra 293T-celler [17] transficeret med N-RU ekspressionsplasmidet (forbundet med to tandem flag sekvens) under anvendelse af Fugene 6 (Roche, Basel, Schweiz). N-RU og kontrol siRNA duplex tidligere beskrevet [18], [19] blev syntetiseret med mindre modifikation i N-RU-sekvens (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland) og blev transficeret under anvendelse oligofectamine reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ).

primær humane lunge tumor prøver og væv arrays

Ti histologisk bekræftede primære humane NSCLC prøver blev opnået fra vævet repository af Rigshospitalet-National University of Singapore (NUH-NUS) med godkendelse af National University of Singapore-Institutional Review Board (NUS-IRB). Disse prøver blev lynfrosset inden for 40 minutter (i gennemsnit) af kirurgisk resektion og opbevaret ved -80 ° C. Human lungekræft vævsarray BC04012 blev indkøbt fra Biomax (US Biomax Inc, Maryland, USA) og farvet med N-RU (C-20) antistof under anvendelse ABC-farvning systemet (Santa Cruz, CA, USA) ifølge producentens retningslinier.

Semi-kvantitative og real time PCR assay

Totalt RNA blev isoleret med RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Tyskland). Fra hver prøve blev 2 ug af RNA omdannes til cDNA ved oligo (dT)

18-primet revers transkription under anvendelse af SuperScript II RT First-Strand kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) som beskrevet af producenten. CDNA’et blev underkastet semi-kvantitativ PCR-analyse under anvendelse Accuprime Taq polymerase systemet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anbefalinger. Tidstro PCR-analyse blev udført under anvendelse af TaqMan ° Gene Expression Assay System (Applied Biosystems, CA, USA) og C

t-værdier blev registreret under anvendelse af ABI Prism 7300 Real Time PCR-system (Applied Biosystems, CA, USA) .

Analyse af real-time PCR data

data blev analyseret ved anvendelse af sammenlignende C

t metode, hvor cellelinien SAEC blev anvendt som kontrolprøve og HPRT-genet blev anvendt som det endogene gen kontrol. Data blev repræsenteret i et søjlediagram plottet på log-skala med en base på 10. N-RU ekspressionsniveau i forskellige cellelinjer blev beregnet i forhold til den N-RU niveau i SAEC [20] -celler som blev sat til 0. data repræsenteret er gennemsnittet opnået fra 3 uafhængige eksperimenter.

In-vitro N-RU spaltningsbestemmelse

Rå celleekstrakter indeholdende aktive proteaser blev opnået ved inkubering, lungecancerceller eller kryo-konserverede human primær lunge cancervæv i RSB buffer [10 mM Tris (pH 8,0), 10 mM NaCl, 3 mM MgCb

2, 0,1% NP-40] ved 4 ° C i 10 minutter og kerner blev derefter fjernet ved centrifugering. Supernatanterne blev høstet og proteinindholdet blev efterfølgende bestemt. N-RU-substrat blev fremstillet ved transfektion af 293T celler med Flag-tagget N-RU plasmid. Optimeret spaltning blev udført i 300 mM NaCl, 50 mM Tris (pH 8,0), ved 37 ° C for forskellige tidsvarighed. Reaktionen blev afsluttet ved opvarmning til 50 ° C i SDS-prøvebuffer, og proteiner blev løst med SDS-PAGE og overført til PVDF-membran til Western blotting.

Immunopræcipitation

To fremgangsmåder blev udformet til detektere den fysiske interaktion mellem N-RU og Hsc70. I en fremgangsmåde blev protease depleteret HPLC fraktionerer af H2170-celler inkuberet med flag-tagged N-RU i IP buffer [40 mM Tris-HCI (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 0,75 mM MgCl

2, 0,25% NP-40] i 5 minutter under rotation ved 4 ° C. Anti-FLAG M2 affinitet gelperler (Sigma) blev tilsat og yderligere inkuberet i 2 timer med rotation ved 4 ° C. I anden fremgangsmåde blev køretøj eller Kaletra-behandlede H2170 celler (ved 5 uM i 96 timer) sonikeret i lysepuffer [150 mM NaCl, 0,5% NP40, 1 mM EDTA, 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM NaF, 1 mM Na

2VO

4, 20 mM β-glycerolphosphat, 1,5 mg /ml IAA, protease inhibitor cocktail] i 10 s. Lysaterne blev klaret ved centrifugering og efterfølgende inkuberet med Hsc70 eller kontrol antistoffer i 2,5 timer med rotation ved 4 ° C. Protein G-perler blev derefter tilsat efterfulgt af 1,5 timer rotation ved 4 ° C. Immunpræcipitater blev opløst på SDS-PAGE-gel og N-RU og Hsc70 blev detekteret ved western blotting.

immunofluorescenstest farvning

Celler blev smurt på objektglas under anvendelse af cytospin centrifugering, fikseret med 4% paraformaldehyd og permeabiliserede under anvendelse af 0,2% Triton X-100 i PBS ved 4 ° C. De fikserede celler blev efterfølgende farvet med relevante primære antistoffer, efterfulgt af FITC- eller rhodamin-konjugeret sekundære antistoffer (Invitrogen-Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA). DNA blev farvet med DAPI (Invitrogen-Molecular Probes) og fluorescenssignaler blev taget med konfokal mikroskopi.

proteinopløselighed assay

N-RU opløselighed assay blev udført som beskrevet tidligere med nogle ændringer [8 ]. Kort fortalt blev cellerne sonikeret kortvarigt i cellelyse-buffer [50 mM Tris (pH 8,0), 5 mM MgC

2, 100 mM NaCl, 0,5% NP-40 og protease inhibitor cocktail] og holdt på is i 30 minutter. De opløselige og uopløselige fraktioner blev adskilt ved centrifugering ved 15.000 rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Den uopløselige fraktion blev behandlet med DNase I i 30 minutter ved 37 ° C. De opløselige og uopløselige fraktioner blev derefter opløst på SDS-PAGE og farvet med anti-N-RU (C-20).

lysosomal optagelse assay

Lysosomer blev isoleret fra H2170 celler under anvendelse lysosomet Berigelse Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Den lysosomale optagelse assay under anvendelse af FLAG-mærket N-RU som substrat, blev udført i det væsentlige som beskrevet andetsteds [21]. Salg

Resultater Salg

Post-transkriptionel tab af N-RU i tumorceller afledt af NSCLC

Analyse af N-RU status i forskellige lungecancer-celler afslørede et tilsyneladende tab af N-RU på proteinniveauet i flere tumorcellelinier afledt fra NSCLC, men ikke i DMS-79; en cellelinie afledt af SCLC (fig. 1A, Støtte Information S1). Et lignende mønster af N-RU tab blev også observeret i normale små luftvejs-epitelceller (SAEC) efter behandling med nikotin, det kræftfremkaldende stof bredt forbundet med lungecancer (fig. 1B). N-RU tab observeret i NSCLC celler var sandsynligvis en post-transkriptionel begivenhed siden niveau af N-RU udskrift, som bestemt ved real-time PCR, blev ikke signifikant nedreguleret i forhold til niveauet i DMS-79 eller SAEC celler (fig. 1C). Identiske mønster af N-RU tab på proteinniveau blev også observeret i ni ud af ti histologisk bekræftet humane primære NSCLC celler, hvilket antyder, at N-RU tab ikke var et eksklusivt arrangement begrænset til NSCLC cellelinjer (fig. 1D, Støtte Information S1) . N-RU tab observeret i H2170-celler kunne blokeres af Kaletra, et klinisk kvalitet HIV-protease-inhibitor og en dokumenteret inhibitor af væksten af ​​NSCLC-celler (fig. 1E) [22]. N-RU tab blev også blokeret af genistein (fig. 1F), en inhibitor af N-RU misfoldning tidligere karakteriserede af os [23]. Disse fund antydede, at tabet af fejlfoldet N-RU kunne kausalt forbundet med vækst og overlevelse af NSCLC celler

A B, niveau og integritet fuld længde N-RU-protein i forskellige lungecancer-celler blev bestemt ved western blotting assay. Niveau af β-actin blev bestemt som eksperimentel kontrol. DMS-79 er afledt af SCLC mens rester af cellerne er afledt af NSCLC. B, niveau af fuld længde N-RU-protein i SAEC behandlet med nikotin i 48 timer på en dosisafhængig måde, blev bestemt. C, niveau af N-RU udskrift i cellelinjer, der anvendes i figur 1 A B blev kvantificeret ved real time PCR. Identiteten af ​​celler anvendt i figur 1A C er præsenteret i Støtte Information S1. D, niveau af fuld længde N-RU protein i ti histologisk bekræftet humane primære NSCLC celler blev bestemt i western blotting assay med N-RU-antistof. Identiteten af ​​humane prøver præsenteres i Støtte Information S1. E og F, Level af intakt N-RU protein i H2170 celler behandlet med Kaletra (E) eller genistein (F) blev bestemt blev bestemt i western blotting assay.

Stabilisering af N-RU af genistein foreslog, at specifik N-RU tab NSCLC celle blev sandsynligvis udløst af sin misfoldning som tidligere observeret i APL. For at bekræfte dette blev kropsbygning af N-RU protein stabiliseret af Kaletra eller genistein bestemt. I nativ konformation, er N-RU begrænset til kernen og forbliver opløselig i buffer indeholdende organisk detergent; mens i fejlfoldet kropsbygning, N-RU bliver uopløselige og translokeres til endoplasmatisk reticulum [7], [8]. Vi brugte disse kriterier til at afgøre, om N-RU, der blev udsat for nedbrydning i NSCLC celler fejlfoldet. En væsentlig del af N-RU stabiliseret med Kaletra blev fundet i den uopløselige fraktion af H2170-celler, hvilket antyder, at H2170-celler rummede et misfoldet N-RU-proteinet (fig. 2A). På den anden side, N-RU stabiliseret af genistein var stort set detergent opløselig, hvilket antyder, at genistein kan redde den native N-RU konformation (fig. 2B). En stor del af N-RU i normale små luftvejs-epitelceller (SAEC) blev fundet i opløselig fraktion, mens i SCLC afledte celler DSM-79, N-RU var stort set uopløseligt (fig. 2C). I overensstemmelse med konstateringen af ​​opløselighed assay, N-RU viste en overvejende cytosolisk fordeling i flere NSCLC afledte celler (fig. 2D, rødt signal) og histologisk bekræftet menneskelige primære NSCLC vævssnit (Fig. 2E, paneler 2-6). I modsætning hertil blev N-RU hovedsagelig lokaliseret i kernen i humane normale lunge epiteliale celler (Fig. 2E, panel 1), SAEC celler (fig. 2F, venstre paneler). Den nukleare N-RU fundet i SAEC celler translokeres til ER efter nikotin behandling, hvilket antyder, at nikotin kan udløse N-RU misfoldning (fig. 2F, højre paneler). Kollektivt, disse fund foreslog, at N-Regionsudvalget, der blev udsat for nedbrydning i NSCLC celler var sandsynligvis en fejlfoldet protein

A, B C, Opløselighed (S) /uopløselighed (I) N-RU eller β-actin i Kaletra (A) eller genistein (B) behandles H2170 celler, såvel som i DMS-79 eller SAEC celler (C) blev bestemt ved proteinopløselighed assay. D, Subcellulær fordeling af N-RU (rød signal) i NSCLC (H2170, H1299, H358, H596, H650, H1869 og H1666) og SCLC (DMS-79) celler blev bestemt ved immunofluorescenstest assay udført med N-RU-antistof. DNA (blå signal) blev farvet med DAPI. E, Subcellulær fordeling af N-RU i histologisk bekræftet humane primære NSCLC vævssnit (panel 2-6) og normalt humant lungevæv sektion (felt 1) blev bestemt ved hjælp af immunhistokemisk (IHC) assay udført med N-RU-antistof. Den brunlige farvning i cytosolen påpeget af sort pil repræsenterer den N-RU signal (paneler 2-6). N-RU-farvning i normalt lungevæv sektion er synlig som sorte prikker overlappende kernen (felt 1). Det andet panel viser et tværsnit, der indeholder både cancervæv (venstre halvdel) og normal lungevæv (højre halvdel) side om side. F, Subcellulær fordeling af N-RU og PDI i SAEC celler behandlet med køretøj eller nikotin i 48 timer blev bestemt ved konfokalmikroskopi.

specifik N-RU tab NSCLC celle er knyttet til endoplasmatiske reticulum (ER ) stress

i APL, N-RU tab var et resultat af cellebeskyttende UPR, som blev medieret af APL cellespecifik afvigende proteaseaktivitet, som til sidst beskyttet APL celler fra eR stress-induceret apoptose [7]. For at undersøge om N-RU tab i NSCLC celler også blev lettet af tilsvarende afvigende protease aktivitet, blev en optimeret N-RU spaltningsbestemmelse udføres. I dette assay blev FLAG-mærket N-RU ektopisk udtrykt i 293T-celler inkuberet med ekstraktet af H2170-celler, en NSCLC afledt cellelinie, som udviste N-RU tab eller DMS-79-celler, en SCLC afledt cellelinie, der ikke udviser nogen N-RU tab, og niveauet af N-RU fordøjet under denne inkubering blev bestemt gennem western blotting assay. Flag-tagget N-RU inkuberet med ekstraktet af H2170-celler blev spaltet på en tidsafhængig måde, og en spaltet N-RU fragment på 100 kDa blev dannet (fig. 3A, bane 6-8), medens N-RU-Flag inkuberet med ekstraktet af DMS-79-celler blev ikke spaltet (fig. 3A, bane 2-4). Interessant nok blev den N-RU spaltende aktivitet præsenteres i H2170-celler fuldstændigt deaktiveres ved kogning, hvilket antyder, at aktiviteten kan være en varmelabil protease (fig. 3A, bane 9). Som observeret med NSCLC afledt H2170 celler, ekstrakter af to humane primære NSCLC-celler, i hvilke ingen fuld længde N-RU blev påvist, indeholdt aktivitet, fuldstændigt fordøjet flaget-mærkede N-RU-protein (fig. 3B). Identiske varme-labilt N-RU spaltning aktivitet blev også fundet i tre andre repræsentative NSCLC celler HLF-a, H23 og H1650 (fig. 3C).

A, H2170 celler havnen N-RU spaltende aktivitet. Behandling af Flag-mærket N-RU inkuberet med ekstrakter af DMS-79 (bane 2-5) eller H2170 (bane 6-9) celler for varigheden som nævnt blev bestemt ved western blotting assay udført med Flag antistof. Ekstrakten indlæst i bane mærket som “kogt” blev opvarmet ved 100 ° C i 10 minutter forud for inkubering. Lige volumen af ​​puffer mangler celleekstrakt blev anvendt i bane mærket som “buffer”. Pilen markerer position spaltede 100 kDa N-RU fragment. B, Processing Flag-tagget N-RU inkuberet med ekstrakter af tre første humane primære NSCLC celler (supplerende tabel 2) blev bestemt ved Western blotting med Flag-antistof. C, N-RU spaltningsbestemmelse, anvendelse af ekstrakter af NSCLC-celler HLF-a, H23 eller H1650, blev udført i det væsentlige som beskrevet i teksten i figur 2A. D, niveau af ER stress i forskellige lunge kræftceller blev analyseret ved bestemmelse af GRP-78 og PDI (basal og HMW: højmolekylære). E, N-RU lokaliseret til ER blev visualiseret ved farvning H2170-celler med N-RU (rød) og PDI (grøn) antistoffer. DNA blev farvet med DAPI (blå). F, niveau af PDI i H2170 eller DMS-79 celler udsat for forvrænge eller N-RU siRNA blev bestemt ved western blotting (øvre panel). N-RU knock-down effektivitet i hvert undersæt af celler blev bekræftet ved RT-PCR-assay (lavere paneler). G, niveau af PDI transkript i SAEC celler behandlet med nikotin i 48 timer blev bestemt ved RT-PCR-analyse.

Desuden teste om specifik N-RU tab NSCLC celle var forbundet til ER stress som observeret i APL, blev niveauet af eR stress tværs NSCLC-celler sammenlignet med den af ​​DMS-79-celler ved måling af niveauerne af GRP78 og PDI proteiner, to bona fide markører for eR stress [24], [25]. Niveauer af GRP78 og PDI, både normal og høj molekylvægt (HMW) variant specifikt fundet i celler, der undergår ER stress, var signifikant højere i alle NSCLC-celler, der udviste N-RU tab, hvorimod disse to proteiner var næsten ikke-detekterbar i DMS-79 celler (fig. 3D). En mulig rolle af fejlfoldet N-RU i amplifikation af ER stress blev foreslået af co-lokalisering af N-RU og PDI i H2170 celler (fig. 3e), og ved reduktionen af ​​PDI niveau efter N-RU knockdown (Fig . 3F). Desuden behandling af SAEC celler med nikotin ved en koncentration, der udløste N-RU tab førte til opregulering PDI niveau, hvilket antyder, at nikotin-fremkaldt N-RU tab kunne også være knyttet til ER stress (fig. 3G). Disse resultater tilsammen foreslået en sammenhæng mellem N-RU tab og amplificeringen af ​​ER stress i NSCLC-celler. Det foreslås også, at nedbrydning af fejlfoldet N-RU kan have bidraget til dæmpningen af ​​ER stress og eventuelle beskyttelse af NSCLC celler fra ER stress-induceret apoptose som tidligere fundet i APL.

fejlfoldet N-RU nedbrydes gennem chaperone medieret autophagy

for at få yderligere indsigt i den mekanisme, der ligger til grund tabet af N-RU og til at forstå den funktionelle konsekvens af N-RU tab, besluttede vi at identificere de proteiner, der kan have forbindelse med fejlfoldet N-RU protein før dens nedbrydning. For at nå dette mål, blev en specielt designet co-immunopræcipitationsassay udført ved hjælp af protease-udtømte cytosolisk ekstrakt af H2170 celler og flag-mærket N-RU ektopisk udtrykt i 293T-celler. Flag-tagget N-RU inkuberet med protease-depleteret cytosolisk ekstrakt af H2170-celler blev immunopræcipiteret med flag antistof og identiteten af ​​proteiner associeret med N-RU blev bestemt ved massespektrometri (MS) efter deres adskillelse i SDS-PAGE. Interessant, ud af flere proteiner co-udfældet med flag-tagged N-RU, blev en identificeret som Hsc70 (figur 4A.), En molekylær chaperone afgørende for translokationen af ​​specifikke CMA substrater til lysosomerne [26] – [28]. For at teste direkte sammenhæng mellem N-RU og Hsc70 en alikvot af protease-fattige cytosolisk ekstrakt af H2170-celler blev inkuberet med ekstraktet af 293T-celler transficeret med FLAG-mærket N-RU plasmid, og niveauet af Hsc70 udfældet med N-RU blev bestemt i western blotting assay. Signifikant mængde Hsc70 protein (fig. 4B, øvre panel) blev co-præcipiteret sammen med Flag-tagget N-RU (fig. 4B, nedre panel) udfældes ved Flag-antistof. Sammenhængen mellem N-RU og hsc70 proteiner blev yderligere bekræftet i samarbejde immunopræcipitationsassay udført med ekstrakter af køretøj eller Kaletra behandlet H2170 celler (fig. 4C). Desuden er der i indirekte immunofluorescenstest assay, blev der observeret en betydelig co-lokalisering mellem N-RU og Hsc70, yderligere tyder på deres in vivo forening i H2170 celler (Fig. 4D).

A, kolonne renset cytosoliske ekstrakter af H2170 celler blev inkuberet med flag-tagged N-RU ektopisk udtrykt i 293T-celler. N-RU blev immunfældet med anti-flag antistof og proteiner co-udfældet med N-RU blev opløst i SDS-PAGE, udskåret og deres identitet blev bestemt ved MS. B var sammenslutningen mellem Flag-tagget N-RU og Hsc70 bekræftet i co-immunpræcipitationsassay væsentlige udført som beskrevet i legenden om figur 4A. Efter påvisning af co-præcipiteret Hsc70 med Hsc70 antistof (øverste panel) blev membranen igen probet med flag antistof for at kvantificere mængden af ​​udfældet N-RU protein (nederste panel). I “Input” baner blev en alikvot af hele celleekstrakt indlæst. C, Hsc70 blev immunpræcipiteret fra ekstrakter af køretøj eller 5 uM Kaletra behandlet H2170 celler og niveauet af co-udfældet N-RU blev bestemt med N-RU-antistof (øverste panel). Membranen blev igen probet med Hsc70 antistof (nederste panel). I “Input” baner blev en alikvot af hele celleekstrakt indlæst. D, N-RU (rød) og Hsc70 (grøn) fordeling i H2170 celler bestemmes ved immunofluorescenstest analyse ved hjælp af konfokal mikroskopi. Intensiteten af ​​gule signaler betegner graden af ​​co-lokalisering af to proteiner. DNA blev mærket med DAPI (blå).

De fleste af de kendte substrater for CMA indeholde en lysosomalt målrettet motiv biokemisk relateret til KFERQ [21], [29]. Dette motiv består af en Q flankeret på begge sider af fire aminosyrer bestående af en basisk, en sur, en voluminøs hydrofob, og en gentagen basisk eller voluminøs hydrofob aminosyre. En analyse af N-RU peptidsekvens afslørede tilstedeværelsen af ​​et næsten identisk lysosomalt målrettet motiv bestående af QEIFR pentapeptid, hvilket antyder, at N-RU kan være et substrat af CMA (fig. 5A). I CMA, hsc70 første forbinder med sin fejlfoldet last i cytosole og derefter Hsc70-cargo kompleks transporteres til lysosomet [29], [30]. Leveret til den lysosomale membran ved Hsc70 er de fejlfoldede lastproteiner omplantes til den lysosomale hulrum ved hjælp af Lamp2A, et hastighedsbegrænsende faktor på CMA [26] – [28]. For at bevise, at N-RU blev nedbrudt gennem Lamp2A-medierede lysosomale vej, blev virkningen af ​​Lamp2A ablation på niveauet af N-RU-protein bestemmes. N-RU tab blev vendte markant (fig. 5B, øvre paneler) efter Lamp2A ablation med en effektiv anti-Lamp2A siRNA (Fig. 5B, lavere paneler), hvilket antyder en vigtig rolle af Lamp2A i tab af N-RU-protein. Desuden behandling af H2170-celler med chloroquin, en kemisk inhibitor af lysosomal funktion [31], signifikant blokeret tabet af N-RU-protein (fig. 5C).

A, N-RU indeholder en konsensus lysosomalt målrettet motiv. Den lysosomalt målrettet motiv i N-RU peptidsekvensen er fremhævet i understreget fed. B, Lamp2A ablation blokeret N-RU tab i H2170-celler. N-RU niveau i H2170-celler eksponeret for monoklonalt anti-Lamp2A eller kontrol siRNA i 72 timer blev bestemt med N-RU-antistof (øverste panel) efter bekræfter Lamp2A ablation ved RT-PCR-analyse (nederste panel). C, Kemisk inhibering af lysosomal funktion stabiliserede N-RU. Niveau af N-RU i H2170-celler behandlet i 72 timer med vehikel eller 25 uM chloroquin, en selektiv inhibitor af lysosomal funktion, blev bestemt med N-RU-antistof. D, Flag-tagget N-RU blev inkuberet med oprenset lysosomale eller ikke-lysosomale fraktioner af H2170 (venstre) eller DMS-79 (højre) celler og niveauet af N-RU nedbrydning blev bestemt med flag antistof. Niveau af Lamp2, et lysosomalt protein, blev bestemt til at demonstrere renheden af ​​hver fraktion. E, N-RU optages af chymostatin behandlede lysosomer blev beskyttet mod proteinase K-fordøjelse. Flag-tagget N-RU eller Hsc70 inkuberet med lysosomer isoleret fra H2170-celler forbehandlet med chymostatin blev underkastet proteinase K-fordøjelse og relative beskyttet N-RU eller Hsc70 blev bestemt med flag eller Hsc70 antistof. Lamp2 niveau blev bestemt til at kvantificere mængden af ​​lysosomer i hver prøve.

For yderligere at bevise, at lysosomer var kilden til N-RU spaltende aktivitet præsenteres i NSCLC celler, fordøjelse af Flag-mærket N-RU inkuberet med ekstraktet af lysosomale eller ikke-lysosomale fraktioner af H2170-celler blev bestemt. Flag-tagget N-RU inkuberet med ekstraktet af lysosomale del af H2170-celler blev fordøjet fuldstændigt mens Flag-tagget N-RU inkuberet med ikke-lysosomale fraktioner var ikke (fig. 5D, venstre panel), hvilket antyder, at N-RU spaltende aktivitet blev sandsynligvis lokaliseret i lysosomerne. Under identiske assay tilstand, Flag-tagget N-RU inkuberet med den lysosomale del af DMS-79-celler blev ikke spaltet (fig. 5D, højre panel). For at bevise, at N-RU er faktisk et substrat af CMA blev et lysosomal optagelse assay, i hvilket CMA substrater optages af chymostatin-behandlede lysosomer ville være beskyttet mod proteinase K-fordøjelse, udført [21]. Flag-tagget N-RU eller Hsc70, en kendt CMA substrat, blev inkuberet med proteinase K og lysosomer isolaed fra chymostatin behandlet H1270 celler, og niveauet af N-RU eller hsc70 proteiner beskyttet mod proteinase K-fordøjelse blev bestemt ved western blotting. En væsentlig del af Flag-mærket N-RU samt Hsc70 blev beskyttet mod proteinase K-fordøjelse, når de inkuberes med chymostatin behandlet lysosomer, hvilket tyder på, at N-RU, ligesom Hsc70, kan omplantes til lysosomale hulrum (fig. 5E).

på baggrund af de data, der er beskrevet hidtil i denne rapport, den potentielle rolle for CMA-induceret nedbrydning af fejlfoldet N-RU protein i overlevelse og vækst af NSCLC celler er illustreret gennem en skematisk model (fig. 6). Denne model fremhæver, hvordan N-RU tab kunne muligvis bidrage til overlevelse og vækst af NSCLC celler gennem en dobbelt mekanisme. Nedbrydning af misfoldet N-RU-protein på den ene side, kan indirekte bidrage til overlevelsen af ​​NSCLC-celler ved at neutralisere ER stress forårsaget af intracellulær akkumulering af fejlfoldet N-RU-protein. Samtidig kan tab af N-RU funktion på grund af misfoldning føre til aktivering af onkogene overlevelse veje, der normalt undertrykkes af et nativt foldet og funktionelt N-RU-protein. Desuden kunne misfoldet N-RU og dets nedbrudte fragmenter også direkte aktivere forskellige onkogen mekanisme forbundet med væksten og overlevelsen af ​​NSCLC-celler. Således CMA-induceret nedbrydning af fejlfoldet N-RU kan bidrage til vækst og transformation af NSCLC celler gennem en kombination af tab og gevinst på funktion mekanismer.

Denne model viser, hvordan CMA-induceret nedbrydning af fejlfoldet N- Regionsudvalget kunne bidrage til overlevelse og vækst af NSCLC celler gennem tabet af normale funktion og forstærkning af afvigende funktion mekanisme.

diskussion

N-RU ustabilitet eller misfoldning observeret i NSCLC