PLoS ONE: Forbedret Invasion af metastatisk kræftceller via ekstracellulær matrix Interface

Abstrakt

Kræft celle invasion er en vigtig del af metastaser og er ansvarlig for omfattende celle diffusion ind i og større ødelæggelse af væv. Celler udviser komplekse invasion modes, herunder en række kollektive adfærd. Dette fænomen resulterer i den strukturelle heterogenitet af den ekstracellulære matrix (ECM) i væv. Her har vi systematisk undersøgt de miljømæssige heterogenitet lette tumor celle invasion via en kombination af

in vitro

celle migration eksperimenter og computersimuleringer. Specifikt konstruerede vi en ECM mikromiljø i en mikrofabrikeret biochip og oprettet en tredimensional (3D) tragtlignende matrigel grænseflade indeni. Scanning elektronmikroskopi viste, at grænsefladen var på de indvendige fejl i nanoskala molekylære anisotropisk orientering og variationer de lokaliserede strukturelle tæthed i matrigel. Vores resultater, især korrelation af den kollektive migration mønster med de geometriske funktioner i tragten-lignende interface, viser, at denne heterogene

in vitro

ECM struktur stærkt guider og fremmer aggressiv celle invasion i den stive matrigel plads. En cellulær automat model blev foreslået baseret på vores eksperimentelle observationer, og den tilhørende kvantitativ analyse viste, at celleinvasion blev initieret og styret af flere mekanismer, herunder mikromiljø heterogenitet, langtrækkende celle-celle homotype og gradient-driven retningsbestemt cellulære migration. Vores arbejde viser mulighederne for at anlægge en kompleks og heterogen

in vitro

3D ECM mikromiljø, der efterligner

in vivo

miljø. Desuden vores resultater viser, at ECM heterogenitet er vigtigt at kontrollere kollektive celle invasive adfærd og dermed bestemme metastaser effektivitet

Henvisning:. Zhu J, Liang L, Jiao Y, Liu L, på vegne af den amerikanske og Kina Fysisk Sciences-Oncology Alliance (2015) Øget invasion af metastatisk kræftceller via ekstracellulær matrix interface. PLoS ONE 10 (2): e0118058. doi: 10,1371 /journal.pone.0118058

Academic Redaktør: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korea, Republik

Modtaget: 12 oktober, 2014 Accepteret: 3 Jan 2015; Publiceret: 23 feb 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Forfatterne anerkender støtte fra National Key Basic Research Program i Kina (Grant 2013CB837200) og National Science Foundation of China (Grant 11.474.345). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den mest livstruende fase af metastase opstår, når tumorceller spredes fra vævet af oprindelse og begynder at vokse i andre organer. I det første kritiske trin, kaldet invasion, metastatiske celler udtrykker metalloproteinaser på deres overflader, fremme basalmembran fordøjelse og flytte ind i det omgivende ekstracellulære matrix (ECM) [1-2]. ECM spiller en vigtig rolle i processen med cancercelleinvasion, som en fysisk stillads for celle bevægelse og også som medium for celle signal kommunikation [3]. I væv, kræftceller udtrykker matrixmetalloproteinaser (MMP’er), der nedbryder ECM på forkant, generere lokale stier og hjælpe de migrerende celler at invadere frit [4-6].

In vivo

, invasive celle histologiske mønstre varierer fra enkelt celle invasion til kollektiv celle invasion, selv inden for samme væv. Mønstre spænder fra celle acini, snore, kirtler, ark, klynger og andre [7-8]. Vigtigere, forskellige mønstre føre til forskellige virkningsgrader på kollektiv celle invasion og bestemme den samlede sværhedsgrad af sygdom og patientens overlevelse. Derfor er det vigtigt at forstå karakteren af ​​de invasive mønstre og de faktorer, der påvirker dem.

De kollektive invasive celle adfærd og mønstre er stærkt påvirket af den heterogenitet ECM mikro-strukturer. På molekylært niveau er koncentrationen ECM protein og ECM komponenter bestemme ECM sub-micron struktur og mekaniske egenskaber [9-14]. På vævet skalaen, er den strukturelle heterogenitet og anisotropi af indfødte væv primært forårsaget af de komplekse lokaliserede ECM mikromiljøer og deres størrelse, tæthed og orientering. Disse fysiske egenskaber, såvel som de specifikke kemiske miljøer, der består af oxygen, ernæring og vækstfaktorer, varierer meget fra væv og væv grænsefladerne [15]. Alle disse ECM variationer indflydelse enkelt celle polaritet og gruppe kollektivt celle adfærd under invasionen og føre til flere celle invasion mønstre, der i sidste ende vil forme ECM landskabet og bestemmer hastigheden af ​​metastaser.

På grund af kompleksiteten af ​​ECM heterogenitet

in vivo

, dens indflydelse på kollektive celle adfærd er blevet beskrevet, men ikke kvantificeret [7].

In vitro

, undersøgelser har stødt flaskehalse på grund af vanskeligheder med at konstruere ECM rumlige orientering og strukturelle mangler. Derfor har nogle modellering og teoretiske analyser blevet rapporteret [6, 16]. For eksempel Boyden-assayet er en almindeligt accepteret metode til at teste cancercelleinvasion potentiale i tre dimensioner. Men kammeret kun giver et homogent ECM miljø, som afviger fra den heterogene væv miljø [17-18].

For yderligere at udforske celle invasion, har nye tilgange modelleret den komplekse mikromiljø med en højere grad af lighed til

in vivo

tilstand ved hjælp mikrofluid teknologi kombineret med optisk billeddannelse. Denne enhed tilbyder en tredimensionel (3D) platform for cellekultur og invasion, der ligner det

in vivo

mikromiljø. Sammenlignet med konventionelle todimensionale metoder, såsom scratch assays, denne enhed tilvejebringer større specificitet og mere nøjagtigt efterligner 3D-miljø for celle undersøgelse [19-20]. I dette manuskript rapporterer vi vores nylige fremskridt på konstruktion af en 3D matrigel-baserede ECM miljø til at undersøge de invasive adfærd af den metastatiske MDA-MB-231 breast cancer cellelinie. Desuden har vi med succes konstrueret en kunstig matrigel grænseflade i 3D rummet. Den heterogenitet Matrigel strukturer i høj grad bestemt af de kollektive celle adfærd, cellens morfologi og invasion effektivitet. Specielt blev den kollektive cellulære mønster migration kraftigt koblet med de geometriske forhold ved tragtlignende interface. Desuden foreslår vi en cellulær automat model [21-35] for at udlede de mulige mekanismer, der førte til den observerede kollektive invasion adfærd. Vores synergi af eksperimentelle og beregningsmæssige undersøgelser viste, at ECM heterogenitet og cellesignalering, sammen med en kemisk gradient, spille væsentlige roller i fastlæggelsen cancercelleinvasion.

Resultater

Heterogen matrigel grænseflade

Matrigel er en temperaturafhængig gel sædvanligvis opbevaret ved 4 ° C. Den rutineprocedure til fremstilling matrigel som

in vitro

ECM er at lagre gelen ved 37 ° C. Gelen så danner homogene strukturer med ensartet tæthed. For at oprette en heterogen matrigel struktur, der kunne simulere uhomogen

in vivo

ECM mikromiljø, blev en rumlig matrigel sektion forberedt, hærdet og derefter sluttede med en anden matrigel sektion, der derefter blev helbredt. To Matrigel sektioner af identisk koncentration men hærdes på forskellige tidspunkter oprettet en grænseflade på deres grænse. Fig. 1 er en scanning elektronmikroskopi (SEM) billede, der viser detaljerne i de fælles strukturer mikro-skala. Den øvre sektion, matrigel I, blev fremstillet og derefter forenet med den nedre sektion, der blev fremstillet 30 minutter efter den øvre sektion. Begge Matrigel sektioner havde mesh strukturer med lignende tætheder. Men de dannede en synlig lodret grænseflade ved samlingen, som angivet med hvide pile. Grænsefladen havde to karakteristika. Første, de strukturer havde bittesmå hulrum i området fra 100 ~ 300 nm, hvilket fører til lavere lokaliseret densitet. For det andet molekylerne havde horisontale polarisationer langs grænsefladen, hvilket indikerer, at masken strukturer de to sektioner ikke overlapper hinanden. Senere forsøg viste og analyseret funktionen af ​​denne grænseflade ved bestemmelse invasive adfærd af metastatiske cancerceller.

Grænsefladen har en vandret molekylær orientering og reduceret lokaliseret densitet, der producerede defekter inde i gelen.

mikrofluid setup for celle 3D invasion

for at analysere, hvordan den matrigel interfacet påvirket metastatisk celle invasion i 3D-rum, vi designet og fabrikeret en mikrofluid chip (fig. 2A). De stiplede linjer skitsere den kubiske form polydimethylsiloxan (PDMS) chip. Chippen besad to runde kamre forbundet med et cylindrisk hul tunnel fyldt med hærdet 100% matrigel. Proteinkoncentrationen var ca. 10 mg /ml, hvilket er 3-4 gange højere end den almindeligt anvendte kollagen I fra glyse (3-4 mg /ml) (354.236, Dow Corning, MI, U. S. A). Føtalt bovint serum (FBS) er en almindeligt anvendt vækstfaktor for cancercellevækst. I cancercelleinvasion

in vivo

, metastatiske celler følger normalt vækstfaktor lokkemiddel gradient. Fartøjet er rigere i ernæring og vækstfaktorer end væv, og disse faktorer danner et forløb, der styrer retningen af ​​celle invasion. Derfor eksperimentet dannede en FBS forløb, der efterlignede den

in vivo

mikromiljø for at lede celle invasion. RPMI-medium med 1,0% FBS blev placeret i den venstre kammer, og RPMI-medium med 10% FBS blev placeret i et andet kammer. Fig. 2B viser, at en FBS gradient udviklet inde i matrigel hvor medierne med forskellige FBS-koncentrationer blev påført ved de to ender af matrigel ved 100% koncentration. Metastatiske MDA-MB-231 brystcancerceller blev podet på overfladen af ​​matrigel i kammeret indeholdende medium med 1,0% FBS. Hvert kammer blev fyldt med 180 pi medium at sikre jævn trykforskelle mellem de to kamre. I de første 24 timer blev cellekammeret fyldt med 10% FBS-medium for at sikre normal vækst af MDA-MB-231-celler. Efter 24 timer blev mediet ændret til 1,0% FBS-medium, og FBS gradienten blev etableret. For at teste etablering og stabilitet af gradienten, fluorescerende dextran-rhodamin (70 kDa molekylvægt protein, Invitrogen) i en koncentration på 0,025 mg /ml blev anvendt til at simulere etableringen af ​​FBS gradient [36-37]. Molekylvægten af ​​dextran-rhodamin ligner okseserumalbumin på 66,5 kDa. En omvendt mikroskop (Ti-E, Nikon) med EMCCD (Flash 4.0, Hamamatsu) blev anvendt til at fange de fluorescerende signaler i matrigel. Chippen med matrigel inde blev anbragt inde i en tilpasset på scenen levende celler inkubator ved 37,0 ° C, 5,0% CO

2 og 80,0% fugtighed, en normal celle inkubation miljø. Micro-Manager softwarestyret mikroskop for at erhverve time-lapse billeder af de fluorescerende dextran-rhodamin distributioner inde i matrigel hver 10 min i 48 timer. Fig. 3C viser dextran-rhodamin fordeling 48 timer efter gradienten blev etableret. En synlig gradient blev etableret i gelen. Denne time-lapse billeddannelse blev senere kvantitativt analyseret af ImageJ software. De midlede grå værdier blev opnået og analyseret fra billederne, som repræsenterer dextran-rhodamin fluorescensintensiteter på bestemte steder. Disse værdier blev derefter normaliseret og plottet med adresser og tid til grafen ved Origin software, som er vist i fig. 3D. En serie af dextran-rhodamin diffusions billeder blev taget med 10 minutters intervaller. Hvert billede blev normaliseret med den maksimale og minimale fås fra hvert billede i serien [38]. De gradientprofiler blev analyseret ved midling en vandret rektangel langs gelen regionen og plottet mod deres position i kanalen. Fig. 2D viser, at den simulerede FBS gradienten blev etableret inden for 3 timer og opretholdt i op til 48 timer. Gradienten test viste, at matrigel kunne etablere en lineær og stabil gradient. Derudover, når medium med eller uden FBS blev anvendt samtidigt til de to sider, en effektiv gradient dannet i matrigel zone.

(A) Diagram skitse af PDMS chip. Den vandrette cylinder kanal mellem de to kamre er fyldt med matrigel (rød). Den venstre kammer er fyldt med mediet med 1,0% FBS, mens højre kammer er fyldt med mediet med 10,0% FBS. (B) Mediet med 10,0% FBS og 1,0% FBS etableret en FBS gradient langs klemt matrigel. (C) Fluorescerende billede af matrigel zone. Den blå linje angiver matrigel. Den venstre side med den nedre grå værdi på viser den RPMI 1640 medium uden dextran-rhodamin, og retten zone med større grå værdi repræsenterer RPMI 1640 medium med dextran-rhodamin. Den matrigel zone har en gradvist aftagende grå farve, som angiver etablering af en dextran-rhodamin gradient. (D) Kvantitativ analyse af dextranen-rhodamin gradient i tids- og rum-afhængige etablering i matrigel. Gradienten blev etableret i 3 timer og forblev stabil efter 9-48 timer.

(A) MDA-MB-231-celler fastgjort til matrigel sidefladen væg ved 0 timer. Den røde linje viser den forreste del af cellegruppe. (B) MDA-MB-231 celleinvasion i matrigel ved 96 timer. celler og matrigel fordøjelse den forårsagede gel krympning sammenlignet med cellens foran ved 0 timer. (C) få celler i fig. 3B strakt ud og udviste svag invasion ind i matrigel, som de hvide pile angiver, hvilket indikerer at MDA-MB-231-celler ikke kunne invadere ind i stive matrigel af 100% koncentration.

Invasion adfærd MDA -MB-231-celler i et homogent ECM miljø

Dernæst indflydelse af den heterogene matrigel interface på kollektiv celleinvasion blev analyseret. Til sammenligning kontrolforsøg analyseret celleinvasion i en homogen ECM mikromiljø. Fig. 3A viser det forbindende cylindret kanal fyldt med homogen matrigel ved 100% koncentration. Ved 0 timer, MDA-MB-231-celler fastgjort ensartet på den venstre side af matrigel. Begge kamre blev fyldt med 10% FBS-medium, som har sikret cellebinding og normal vækst. Efter 24 timer blev mediet i venstre kammer erstattet med medium indeholdende 1,0% FBS. I fig. 3B, den sorte skygge langs matrigel overfladen, at celletallet steget betydeligt på grund af hurtig celleproliferation. Efter 96 timer blev matrigel deformeret, og MDA-MB-231-celle front (røde linjer) bevæges fremad til højre som de fast til matrigel overflade. Den matrigel deformation var forårsaget af de MMP’er udskilles af MDA-MB-231-celler, som nedbryder matrigel [39], og den kraft af interaktionen mellem MDA-MB-231 celler og matrigel mikrostruktur [40-42]. Førstnævnte repræsenterer en kemisk handling, mens sidstnævnte er en fysisk proces. Selvom de konvergerende kræfter var signifikante og forårsagede matrigel deformation, cellerne ikke åbenbart kollektivt invadere matrigel 3D strukturer. Fig. 3C viser forstørret snit af cellen front i fig. 3B. Billedet viser celleinvasion i 3D matrigel 520 um over bunden af ​​kanalen. De blå pile angiver, at MDA-MB-231-celler kun lidt invaderede matrigel. Som vist kun få celler ved fronten dannede elliptiske former i matrigel, der repræsenterer deres små invasioner. De fleste af cellerne bag disse celler viste kompakt vækst. Overordnet kunne MDA-MB-231-celler ikke invadere matrigel, sandsynligvis på grund af stivheden af ​​100% matrigel. Denne kontrolforsøg bekræftede, at cellerne kun kunne udvise intensiv vækst på gelen overflade, uden 3D invasive adfærd, hvis den stive gel havde en ensartet tæthed.

Konstruktion af en heterogen ECM mikromiljø med en matrigel grænseflade

Forrige kontrolforsøg viste, at metastatiske MDA-MB-231-celler var knap nok i stand til at invadere ECM-lignende matrigel på grund af sin stivhed. For yderligere at undersøge de kollektive celle invasive adfærd i ECM med en heterogen mikromiljø, genereret vi en rumlig matrigel fælles struktur i gelen kanal. Fig. 4A viser, at den cylindret matrigel kanal var fyldt med to sektioner af gelerne: matrigel I (rød) og matrigel II (blå). Specifikt matrigel II blev indsat i matrigel I og dannede en tragtlignende 3D struktur. Under fremstillingen blev den cylinderformede kanal først injiceret med 8 um af 100% matrigel. Derefter blev chippen vippes 30 ° ~ 45 ° grader til niveauet platform i 30 minutter, idet gelen hærdet (fig. 4B). Da matrigel ikke havde størknet i dette tidsrum, og det bløde matrigel klæbet stærkt til PDMS kanal, tyngdekraft kørte gelen til den højre ende, hvilket skaber en tragt-lignende struktur indtil fuldt størknet. På dette tidspunkt tyngdekraften kombineret med gel vedhæftning spillede en vigtig rolle i dannelsen af ​​3D morfologi matrigel I. Endelig blev yderligere 3 pi 100% matrigel II tilsat til hulrummet. Chippen blev derefter anbragt inden i et niveau inkubator til fuldstændig gelering. Således matrigel I og II kombineret og dannede en tragt-lignende interface, som vist i fig. 4B. Disse to sektioner havde identisk gel densitet, men grænsefladen havde strukturelle forskelle. Som vist ved SEM i fig. 1, den lokale densitet og gel molekyle orientering varierede fra de ensartede sektioner. De fysiske egenskaber af grænsefladen var derfor forskellig fra den homogene matrigel. Variationerne også ført til ændringer i de optiske egenskaber, herunder refleksion indeks. Figur C viser lys-felt billede afbildet af inverteret mikroskop. Den tragtlignende 3D interface er klart synlig i kanalen, som angivet ved de røde pile.

(A) tegneserie, der viser, at den heterogene matrigel er sammensat af matrigel I (rød) og matrigel II (blå). De to sektioner danner en tragtlignende 3D interface. (B) Den øverste indsatte viser fremstillingen matrigel gelstruktur. Efter matrigel I i kanalen geleret i 30 minutter, blev chippen vippes 30 ° -45 °. Den matrigel jeg dannede en tragt struktur på grund af tyngdekraften og gel vedhæftning. Derefter matrigel II blev injiceret i hulrummet. Den nedre indsatte viser grænsefladen fra sidebillede. (C) De røde pile angiver gel grænsefladen i eksperimentet.

Matrigel-interface-guidede kollektiv MDA-MB-231-celle invasion

MDA-MB-231 celler blev læsset på den venstre side af den heterogene matrigel med grænseflader og dyrket i 48 timer (fig. 5D). Proceduren var nøjagtig den samme som for den i fig kontrolforsøg. 3. I fig. 5D, skyggen er grænsen af ​​matrigel kanal og runde pool og er forårsaget af lysafgivende af PDMS væg. Brændplan billedet er på kammeret substrat. Skyggen til venstre er det medium kammer, hvor MDA-MB-231 celler tidligere var indlæst og havde slået sig ned og spredt på underlaget. Den højre side er den matrigel zone, hvor celler påsat venstre væg. De fleste celler på den lodrette matrigel overflade forblev i Shadowed område og er ikke synlige i billedet. Nederste højre farve billede viser, at efter MDA-MB-231-celler var bundet til matrigel side i 48 timer, et par celler strakt ud og begyndte invaderer den indre matrigel strengt efter grænsefladen. De celler, som ikke havde nogen kontakt med grænsefladen i rummet ikke invadere, svarende til kontroleksperimentet. Disse resultater indikerer, at cellerne havde mechanotransduction respons på strukturen og kunne fornemme og følge grænsefladen. Interfacet spiller en vigtig rolle i at vejlede celleinvasion, som ikke kunne forekomme i homogen stiv matrigel. Som SEM viser ECM fibriller havde polariseringer og mangler i den grænseflade, muligvis guidet celle retningsbestemt invasion. Desuden kunne de heterogene fysiske begrænser og spændinger inducerer anker receptor omfordeling i cellemembranen. Således resulterede mekanisk strækning af membranerne kan styre pseudopodia udvidelser og motivere celleinvasion langs grænsefladen. At tydeliggøre denne proces ovenstående skematiske forklarer celleinvasion efter den rumlige matrigel interface.

(A-C) tegnefilm forklarer de forskellige faser af kollektiv celleinvasion. (D) viser, at MDA-MB-231-celler fornemmede grænsefladen og begyndte invaderer matrigel på 48 timer; (B) MDA-MB-231 cellers invasive grene øget efter matrigel grænseflade ved 96 timer. Nogle grene link og danne et netværk, som angivet ved den røde cirkel. (C) Efter den delvise grænseflade var fyldt med cellerne de grænsebroer cellerne undslap fra grænsefladen indespærring og produceret finger-lignende invasioner i homogene matrigel, hvilket bekræfter den stærke invasion af MDA-MB-231 celler i heterogene gel plads.

Efter 96 timer blev celleinvasion blev mere tydelig, som det er vist i fig. 5E. Flere MDA-MB-231-celler, der danner de enkelte grene, begyndte invaderer matrigel langs grænsefladen, både fra siden og fra neden. Cellerne invaderet langs siden interface, afslører, at invasionen stadig nøje fulgt grænsefladen ved høje hastigheder. Ud over grænsefladen indflydelse, cellen signal også spillet en afgørende rolle i at accelerere celle invasion. Celle kommunikation hjalp 3D invaderende celler danner et netværk og forbinde med andre invaderende grene, som angivet ved cirklen skitseret med røde linjer. Denne tilslutning hjalp cellerne danner en stor gruppe og invadere gelen plads kollektivt. Samtidigt FBS gradient også bidraget og førte celler til at invadere mod højre side [43-44].

Med gavn for grænsefladen vejledning, MDA-MB-231 celler hurtigt invaderede matrigel. Ved 192 timer, MDA-MB-231-celler præsenterede stærke kollektive invasive adfærd og invasion mønstre i gelen. Fig. 5F viser, at celleinvasion gruppe dannet i to sektioner af matrigel. Tidlige-indtrængende celler, som dannede invaderende grene langs grænsefladen fortsat invadere, proliferere og fletning indtil de forbindes, og dannede en celle plan 350 um i længden og 100 um i bredden, som angivet ved den sorte pil. Denne celle flyet var begrænset af grænsefladen panel. Derefter blev en tæt klynge af celler opstod ved dens forreste og fortsatte med at udvikle sig til en langstrakt form, der invaderet i ECM forude. Vi henviser til denne aflange celle klynge som en celle “finger”. Fingeren invaderede vandret mod højre af gelen, hvilket indikerer, at cellerne var undsluppet fra indespærring af matrigel interface og invaderet i matrigel I afsnittet. Med andre ord, cellerne ikke længere invaderede gelen langs grænsefladen, men direkte i den homogene matrigel miljø. Den sorte stiplede linje repræsenterer foran tragten interface og viser cellen finger genereret før cellerne fyldte grænsefladen. Grænsen af ​​cellerne i fingeren er ikke synlig, hvilket indikerer, at cellen gruppe havde meget kompakte strukturer med stærke celle-celle vejkryds. Sammenlignet med den celleinvasion adfærd i kontroleksperimentet, hvor kun nogle få celler viste svag og korte afstande invasion på den celle gruppen foran, den massive finger invasion indebærer, at MDA-MB-231-celler havde stærke signaler kommunikation med hinanden der dominerede deres kollektive adfærd, hvilket kan forklare, hvorfor cellen gruppen her kunne invadere 100% matrigel plads, i modsætning til kontrolgruppen i matrigel med samme tæthed. Derudover FBS gradient i høj grad bidraget og instrueret invasionen finger mod højre [45].

Discussion

Generelt invasionen proces af metastatiske MDA-MB-231-celler i matrigel med en tragtlignende 3D grænseflade kunne anses for at have tre faser. I 1

st fase, cellerne invaderede matrigel i et par vandløb, primært styret af den buede grænseflade overflade (48 timer). I 2

nd fase, flere celle strømme optrådte ved grænsefladen. På dette stadium, signalering celle domineret, så invaderede vandløb til at kommunikere med andre og formular celle netværk. Under 3

rd fase (192 timer), cellenetværket forvandlet til en kontinuerligt invaderende cellegruppe der genererede finger form og kollektivt invaderet foran. Samtidigt FBS kemiske gradient og cellesignalering var de dominerende faktorer dirigerer celleinvasion til højre i den stive og homogen matrigel plads.

For at teoretisk analysere kollektive celle invasion i en heterogen matrigel mikromiljø, foreslog vi følgende mekanismer, der kan fremkalde de vigtigste træk ved den 3-fasede invasion opførsel observeret her: (i) mikro-miljø heterogenitet; (Ii) langtrækkende homotypisk tiltrækning gennem celle-celle kommunikation (primært kemisk i naturen); og (iii) gradient-drevne retningsbestemt cellulære migration. For yderligere at verificere disse mekanismer og få en dybere forståelse af, hvordan de er koblet, vi udtænkt en cellulær automat (CA) model [22-35], der indarbejdet de nævnte mekanismer til

kvalitativt

simulere den kollektive cellulære migration i en heterogent miljø. Vi bemærker, at selvom selve systemet er i tre dimensioner, anvendte vi en todimensional (2D) model. Dette skyldes, at vores tidligere undersøgelser har vist, at 2D CA modeller er tilstrækkelige til kvalitativt reproducere de kollektive cellulære dynamik i invasive solide tumorer [46-48] og hvilende maligne tumorer [49].

Efter tidligere undersøgelser [46- 49], blev en rektangulær simulering domæne (med et aspektforhold på 2) opdelt i adskilte polygoner vha voronoi tessellation forbundet med en uordnet pakning af cirkulære skiver (fig. 6). Emballagen blev genereret via tilfældig sekventiel tilsætning af 80.000 hard cirkulære diske [46]. Den lineære størrelse af simuleringen domæne var 4000 um x 2000 um. Således er den gennemsnitlige lineære størrelse af hver voronoi polygon var ca. 10 um, svarer til den typiske størrelse af en celle. I vores simulering, kan en voronoi polygon være optaget af ECM makromolekyler, en celle eller et hulrum. Hver ECM forbundet Voronoï polygon besad en effektiv ECM tæthed værdi

ρ

, og for et tomrum-space polygon,

ρ = 0

. Vi bemærker, at denne densitetsværdi er en simulering parameter, der er proportional med men generelt forskellig fra den faktiske ECM massefylde (dvs. antal /masse af ECM makromolekyler pr volumenenhed /område)

Højre panel:. Associeret voronoi tessellation af flyet i polygoner.

for at efterligne den heterogene mikromiljø observeret i forsøgene, vi overvejet to ECM regioner med forskellige tætheder, dvs., en blød region med

ρ

b

og et hårdt region med

ρ

h

Vi brugte en Gauss kurve at tilnærme grænsen af ​​de to regioner. Voronoi polygoner på grænsefladen af ​​to ECM regioner havde en meget lavere densitet

ρ

b

end bulk ECM regioner på grund af eventuelle defekter ved grænsefladen. De densitetsværdier er tilvejebragt i tabel 1. Desuden blev et ensartet kemisk gradient påført langs den horisontale retning implicit indarbejdet i vores model, som er forspændt migrationen af ​​cellerne langs den horisontale retning (som beskrevet nedenfor). Vi bemærker, at i almindelighed, en gradient prolife er langt mere kompleks end en ensartet én. Men denne tilnærmelse var tilstrækkeligt til vores kvalitative undersøgelse.

I begyndelsen af ​​simulationen, celler frigivet og kan komme ind i simuleringen domænet fra den venstre side af domænet. Simulation tid derefter diskretiseres i timer. Når du indtaster simuleringen domæne, en celle indtager en voronoi polygon og nedbryder ECM makromolekyler oprindeligt i polygonen. På hvert tidsskridt, hver celle kontrolleres for migration. Når en celle vandrer, det springer fra den aktuelle Voronoï polygon til en nærliggende Voronoï polygon med en sandsynlighed

P

m

, som er en vigtig simulation parameter, der afhænger af ECM tæthed af den nærliggende polygon, retningen af ​​kemiske gradient og positionerne af andre celler. Konkret er følgende CA regler anvendes til bestemmelse

P

m

:

ECM tæthed

: Efter tidligere undersøgelser [46-49 ], vi antog, at det er lettere for celler til at migrere i blødt ECM end hårde ECM. Således mener vi, sandsynligheden for, at en celle springer ind i en voronoi polygon

j

med

ρ

j

at være proportional med

e

-ρj

, dvs.

P

m

~ e

–

ρj

kemisk gradient

: Vi fandt, at migration retning af en celle er påvirket af den kemiske gradient. Denne regel blev gennemført ved indførelse af en højere migration sandsynlighed hvis migrationen retning var mere på linje med hældning retning. Antag en celle oprindelig indtager en voronoi polygon

i

, sandsynligheden for, at cellen springer til en nærliggende Voronoï polygon j er derefter proportional med e

(

r

ij

∇

c

), dvs., P

m

~

e

(

r

ij

∇

c

), hvor

r

ij

betegner forskydningsvektoren peger fra polygon

jeg

til

j

og ∇

c

er den anvendte kemiske gradient, som er valgt til at være den enhedsvektor langs den horisontale retning

Homotype attraktion

:. Vi Overvej at retningen af ​​migration også påvirkes af andre celler gennem celle-celle-kommunikation, der kunne være kemisk karakter. Uden at komme ind detaljerne i celle-celle kommunikation involveret i den observerede kollektive adfærd, som kræver omfattende undersøgelser sub-cellulære niveau, vi kun implementeret den samlede virkning af en sådan kommunikation i vores model, dvs. homotype attraktion. Denne tiltrækning indebærer, at celler migrerer mod hinanden og blev gennemført som følger: Antag en celle oprindelig indtager en voronoi polygon

Jeg

, vi konstruere en cirkel med radius

R

c centreret ved polygon

jeg

, hvor

R

c er effektive rækkevidde af celle-celle kommunikation. Derefter er positionerne for alle cellerne i indflydelse cirkel gennemsnit, hvilket giver positionen af ​​en effektiv centrum for tiltrækning. Lad vektor r

ic

betegne forskydning fra polygon

jeg

til den gennemsnitlige celle position (dvs. centrum for tiltrækning).