PLoS ONE: Signaling Networks associeret med AKT Aktivering i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC): Nye indsigter om rolle Phosphatydil-inositol-3 kinase

Abstrakt

Afvigende aktivering af PI3K /AKT signalering repræsenterer en af ​​de mest almindelige molekylære ændringer i lungekræft, selvom det relative bidrag af de enkelte komponenter i kaskade til NSCLC udvikling stadig dårligt defineret. I dette håndskrift har vi undersøgt forholdet mellem ekspression og genetiske ændringer af komponenterne i PI3K /AKT pathway [KRAS, den katalytiske underenhed af PI3K (p110α), PTEN, Akt1- og AKT2] og aktiveringen af ​​AKT i 107 kirurgisk resektion NSCLCs og har analyseret de eksisterende relationer med klinisk-patologisk funktioner. Expression analyse blev udført ved immunhistokemi på Tissue microarrays (TMA); mutation blev udført ved DNA-sekventering; kopi nummer variation blev bestemt ved FISH. Vi rapporterer, at aktivering af PI3K /AKT-vejen i italienske NSCLC patienter er forbundet med høj kvalitet (G3-G4 sammenlignet med G1-G2, n = 83; p 0,05) og mere fremskreden sygdom (TNM stadie III vs. fase I og II n = 26; p 0,05). Desuden fandt vi, at PTEN tab (41/104, 39%) og overekspression af p110α (27/92, 29%) udgør den hyppigste aberration observeret i NSCLCs. Mindre hyppige molekylære læsioner bestod overekspression af AKT2 (18/83, 22%) eller Akt1 (17/96, 18%), og KRAS mutation (7/63, 11%). Vores resultater indikerer, at blandt alle gener, blev kun p110α overekspression signifikant associeret til AKT aktivering i NSCLCs (p = 0,02). Manipulation af p110α udtryk i lungekræft celler, der bærer et aktivt PI3K allel (NCI-H460) effektivt reduceret proliferation af NSCLC celler

in vitro

og tumorvækst

in vivo

. Endelig RNA profilering af lungeepitelceller (BEAS-2B), der udtrykker en mutant allel af PIK3 (E545K) identificeret et netværk af transkriptionsfaktorer, såsom MYC, FOS og HMGA1, ikke tidligere kendt for at være associeret med afvigende PI3K signalering i lungekræft.

Henvisning: Scrima M, De Marco C, Fabiani F, Franco R, Pirozzi G, Rocco G, et al. (2012) Signaling Networks associeret med AKT Aktivering i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC): Nye indsigter om rolle Phosphatydil-inositol-3-kinase. PLoS ONE 7 (2): e30427. doi: 10,1371 /journal.pone.0030427

Redaktør: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Italien

Modtaget: Juli 25, 2011; Accepteret: 16. december 2011; Publiceret: 17 feb 2012

Copyright: © 2012 Scrima et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) til GV og AW og ved EU (IP: CRESCENDO, kontrakt n.er LSHM-CT-2005 til 018.652), Ministero dell’Università e della Ricerca (PRIN, Grant n.er 2008CJ4SYW_004) til AW De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræftdødsfald i verden [1], [2]. Epithelial lungecancer er klassificeret i to hovedgrupper: småcellet lungecancer (SCLC) (ca. 15% af alle lungekræfttilfælde) og ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) (ca. 85% af alle lungekræfttilfælde) [3] . NSCLC omfatter pladecellekræft (SCC), adenocarcinom (ADC), og store celle lungecancer (LCC) [3]. Trods fremskridt i tidlig påvisning og standard behandling er NSCLC ofte diagnosticeret på et fremskredent stadium og patienter har ofte dårlig prognose, med fem-års overlevelse mindre end 15% [4], [5]. Af denne grund en bedre forståelse af de molekylære oprindelse af sygdommen vil bidrage til at forbedre terapeutisk behandling af lungecancerpatienter.

Nylige undersøgelser har vist, at phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaleringskaskade ofte overaktivt i human kræft [6] – [8] spiller en afgørende rolle både i initiering og progression af NSCLC [9], [10]. Den PI3K pathway regulerer cellulære funktioner, såsom spredning, overlevelse, motilitet og angiogenese, der er afgørende for væksten og /eller vedligeholdelse af tumorer [11], [12]. Endepunktet af PI3K pathway er AKT, en serin /threoninproteinkinase, der medierer de fleste signaler funneled gennem PI3K pathway. AKT aktiveres ved rekruttering til cellemembranen via binding af sit PH domæne til 3′-fosforylerede phosphatidylinositoler genereret af PI3K og efterfølgende phosphorylering på T308 og S473 [12], [13]. Omvendt lipid phosphatase PTEN dæmper AKT aktivering ved dephosphorylere 3′-stillingen af ​​phosphatidylinositoler [14].

Aberrant AKT aktivering bidrager til lunge carcinogenese [9], [10]. Hyperaktivering af AKT detekteres i de fleste NSCLC cellelinier [15] – [17], og i 30-75% NSCLCs [18] – [22] og fremmer resistens mod kemoterapi og strålebehandling [16]. AKT aktivering i kræft øjeblikket evalueret under anvendelse phospho-specifikke antistoffer mod S473 i immunohistokemiske analyser af tumorprøver. Selvom phosphorylering af AKT på S473 er ​​blevet korreleret med dårlige kliniske resultater i mange tumortyper, resulterer i lungekræft tilsyneladende uforenelige [7] – [10], blev forbundet med enten dårlig eller god prognose [20] – [22]. AKT kan aktiveres gennem flere mekanismer, som hidrører fra særskilte og ofte gensidigt eksklusive begivenheder, der omfatter aktiverende mutationer (KRAS, PIK3CA eller Akt1), forøget ekspression (PIK3CA, Akt1, AKT2) eller tab af PTEN [10]. Men den relative bidrag af de enkelte komponenter i PI3K vej til AKT aktivering i NSCLCs er stadig uklart. I dette manuskript har vi undersøgt sammenhængen mellem de genetiske ændringer til stede i disse gener og aktiveringen af ​​AKT i NSCLC.

Materialer og metoder

Etik Statement

Patient periodisering var udføres i henhold til intern Review Board i INT Fondazione Pascale (Napoli, Italien) (CEI 556/10 af 2010/12/03). Undersøgelsen blev godkendt af interne Review Board i AOU Mater Domini /University Magna Graecia (Catanzaro, Italien) i mødet den 16/3/2011. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere i undersøgelsen. Alt dyr arbejde blev udført i overensstemmelse med de relevante italienske retningslinjer og blev godkendt af den interne udvalg for Animal Study (CESA) af Institut for Genetic Research “Gaetano Salvatore den 7. april

th 2008 (CESA 10-08).

patienter

Arkiv materiale fra 107 patienter diagnosticeret med NSCLC [3] blev opnået fra INT Fondazione Pascale (Napoli, Italien). Median alder var 64 år gammel (interval 28-82). Blandt patienter med kliniske data, kvinderne var 18 og mænd 83. etape var kendt for 81 patienter: 67 patienter havde stadie I-II-sygdom og 14 havde stadie III-IV sygdom. Grade var kendt for 83 patienter: 35 tilfælde var G1-G2 og 48 var G3-G4. Se tabel S1, tabel S2 og tabel S3 for mere detaljerede kliniske karakteristika for alle patienter.

TMA objektglas blev deparaffineret, opvarmet i en trykkoger med 1 mM EDTA, pH 8,0 i 10 min, og inkuberet med pepsin ved 37 ° C i 30 minutter. Objektglassene blev derefter dehydreret i stigende ethanol-koncentrationer, og derefter lufttørret. Proberne blev denatureret ved 96 ° C i 5 minutter, og hybridisering blev påført på hvert objektglas og inkuberes ved 75 ° C i 1 min. Efter inkubation natten over ved 37 ° C i et fugtigt kammer blev objektglassene vasket med 0,4 x SSC og 0,3% NP40 i 2 min ved 75 ° C, lufttørret i mørke, modfarvet med DAPI, og et dækglas blev påført.

Tissue Microarray (TMA) og Immunhistokemi

TMA’er blev bygget i samarbejde med enhed for Immunfarvning på Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas (Madrid, Spanien) i henhold til etablerede metoder [23] ved hjælp af en Tissue arrayer ( Beecher Instruments, Gene Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD). Immunfarvning blev udført under anvendelse af avidin-biotin-peroxidase metode (LSAB kit, DAKO, Glostrup, Danmark) som beskrevet tidligere [24]. Antistoffer anvendt til immunfarvning blev udvalgt efter i forvejen offentliggjorte arbejde [25] – [29]. Anti-pS473 (# 9277), anti-Akt1 (# 2938), anti-AKT2 (# 4057), anti-PIK3CA (# 4249), anti PTEN (# 9559) var alle fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

anti-Akt1- og anti-Akt2 har vist sig at være isoform-specifikke antistoffer i tidligere arbejde [25]. Desuden ved anvendelse af NCI-H460-celler forstyrret for Akt1 eller Akt2 henholdsvis vi bekræftet, at anti-Akt1- antistof genkender kun Akt1 isoform og den anti-Akt2 antistof genkender kun Akt2 isoform (fig S1A).

immunhistokemisk resultat af Pakt og PTEN anvendes i dette arbejde blev udvalgt på grundlag af de almindeligt fastlagte kriterier findes i litteraturen [28], [30], [31]: Pakt blev scoret som positiv, når 10% af tumorceller var positive med stærke eller diffus immunopositivitet. PTEN ekspression blev klassificeret som (+), når farvning blev påvist i 50% af cellerne, (+/-), når farvning blev påvist i 25-50% af cellerne og (-) ved farvning blev påvist i 0-25% af celler. Til statistisk analyse PTEN udtryk blev anset tabt, når prøverne blev klassificeret som (-).

Også for Immunofarvningen snesevis af Akt1, AKT2 og PIK3CA, udvalgte vi kriterierne i tidligere rapporter [27], [28], [32]. Tumor prøver blev inddelt i fire grupper efter procentdelen af ​​positive celler: (-) omfattede fuldstændig negative prøver; (+) Omfattede prøver med op til 10% af positive celler; (++) Omfattede prøver med 11-50% af positive celler; og (+++) omfattede prøver med 50% af positive celler. Af statistiske grunde blev tumorer klassificeres i en lav ekspression gruppen omfattende (-) og (+) og en høj ekspression gruppe, der omfatter (++) og (+++)

For hver immunhistokemisk runde a. negativ kontrol er blevet medtaget, ved at erstatte det primære antistof med opløsningsmiddel ved den samme mængde af den pågældende med det primære antistof resuspenderet i det. Alle kontroller gav tilfredsstillende resultater. Stained TMA sektioner blev evalueret af to ekspertgrupper patologer (RF, GB) ved hjælp af ensartede kriterier. Uoverensstemmelser blev løst gennem samtidige kontrol og diskussion af resultaterne. Uoverensstemmelser mellem to kerner fra den samme sag blev løst gennem en fælles analyse af de to kerner.

Fluorescens in situ-hybridisering (FISH)

FISH-analyse blev udført på TMAs. BAC-kloner blev konstrueret efter Ensembl database (www.ensembl.org). BAC kloner dækker Akt1 genet var RP11-982M15, RP11-477I4 og RP11-556J09. Kontrol BAC sonder, der dækker kromosom region 14q11 var RP11-324B11. BAC kloner dækker AKT2 genet var RP11-36B02, RP11-688J23, RP11-725P04. Kontrol BAC sonder, der dækker kromosom region 19p13.1 var RP11-737I1, RP11-520G3. BAC kloner dækker PIK3CA genet var RP11-360P21 og RP11-245C23. Kontrol BAC sonder, der dækker kromosom region 3p14.1 var RP11-175F9 og RP11-15B21. Alle BAC-kloner blev mærket med dUTP-Sprectrum Orange (Vysis Inc., DownersGrove, IL, USA). Alle Kontrol prober mærket med dUTP-Sprectrum Green (Vysis Inc., DownersGrove, IL, USA).

To forskellige efterforskere, der ikke havde forudgående kendskab til de genetiske, kliniske og IHC resultater evalueres FISH-analyse. Alle fisk blev scoret i gennemsnit 130 (60-210) kerner.

Til vurdering af antal kopier af de gener, der koder Akt1, AKT2 og PIK3CA, et gen-til-kontrol-forhold på 1,0 blev klassificeret som disomi ; forhold mellem 1,0 og 2,0 blev betragtet gen lavt niveau gevinster; nøgletal 2,0 blev betragtet som høj polysomy og /eller genamplifikation [33], [34]

Derfor blev tumorer inddelt i forskellige klasser: disomi, trisomi (3 kopier af kromosomer i 40%. af celler), lav polysomy (≥ 3 kopier af kromosomer i 40% af celler), høj polysomy (≥ 4 kopier af kromosomer i ≥40% af celler), og gen-amplifikation (tilstedeværelse af genklynger med et forhold mellem gen -til-kromosom ≥2 per celle i ≥40% af celler eller tilstedeværelsen af ​​små eller nonenumerable klynger af genet signal). Dette tillod klassificering af patienter i to grupper: FISH-negativ (disomi og gevinster) og FISH-positive (høj polysomy og /eller genamplifikation)

PCR, RT-PCR og

mutation analyse

Total RNA og genomisk DNA blev fremstillet som beskrevet [35], [36]. Q-RT-PCR og Q-PCR blev udført ved anvendelse Power SYBR Green PCR Master Mix i et ABI Prism 7300 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA’er blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved anvendelse QuantiTect Reverse Trascription (Qiagen, Holland, Venlo). Normalisering blev udført til GAPDH mRNA-indhold. De relative mængder af mRNA eller DNA blev beregnet ved den sammenlignende tærskelcyklus (CT) metode Livak og Schmittgen [37]. Mutationsanalyse for PIK3CA hjælp LightCycler blev udført med DNA Master /Hybridiseringsprober kit (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Tyskland). Direkte sekventering blev udført under anvendelse af BigDye v3.03 cyklus-sekventeringskit (Applied Biosystems) i et kapillær automatisk sequencer (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Protokoller og primere til Q-PCR, Q-RT-PCR og sekventering KRAS (exon 2 og 3) og PIK3CA (exons 9 og 20) er rapporteret i bilag S1.

Antistoffer og Western Blot

Western blot-analyse blev udført ved standardmetoder [38]. Hele celleekstrakter blev fremstillet ved at homogenisere celler i NP-40 lysisbuffer (10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1% NP-40) indeholdende proteaseinhibitorer. Lysater blev klaret ved centrifugering og proteiner blev separeret ved SDS-PAGE. Antistoffer anvendt var fra cellesignalering Teknologi: anti-Akt1 (# 2938); anti-S473 (# 9277), anti-PIK3CA (# 4249).

Cellelinjer

NCI-H460 blev købt fra ATCC-LGC Promochem (South West London, UK) og vedligeholdes i RPMI1640 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum og 100 U /ml penicillin-streptomycin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). BEAS-2B celler blev købt fra Cambrex (Milano, Italien) og dyrkes som foreslået af producenten [39].

Virus generation og Infektion

For at generere p110α kodning lentivirus, cDNA koder for human p110α (Addgene, Cambridge, MA, USA) blev klonet i pENTR1A vektor (Invitrogen) og rekombineres i pLenti6.2 /C-Lumio ™ /V5-DEST Vektor ved at gøre brug af Gateway Technology (Invitrogen). pLenti vektor blev anvendt til at generere lentivirale partikler i HEK293T emballage celler som beskrevet [40]. Transducerede BEAS-2B-celler undergik tre runder af infektion og blev udvalgt i medium indeholdende 5 ug /ml blasticidin (Invitrogen). The Human PIK3CA (NM_006218), Akt1 (NM_005163) og AKT2 (NM_001626) MISSION shRNA sæt (Sigma-Aldrich, St.Luis, MO) og Mission ikke-target kontrol transduktion virus (SHC002V) blev anvendt til at generere lentivirale partikler i HEK293T pakkeceller [40]. Efter transfektion blev supernatanterne opsamlet ved 8 timers intervaller, filtreret og anvendt til tre runder af transduktion af NCI-H460-celler i nærvær af 8 ug /ml polybren (Sigma).

In vitro proliferationsassay

Celler proliferation blev analyseret ved MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma] reduktion. Celler blev udpladet i 96-brønds fladbundede mikrotiterplader (200 pi cellesuspensioner, 2 × 10

3 /brønd i NCI-H460) og inkuberet med MTT substrat (5 mg /ml) i 4 timer. Hver 24 timer blev dyrkningsmediet fjernet, og vandfri 2-propanol blev tilsat. Den optiske densitet blev målt ved 570 nm.

tumorigen assays

Celler (1 x 10

6) blev suspenderet i 100 ml 10% FBS og 100 ml Matrigel (BD Biosciences, NJ , USA) og subkutant injiceret i den højre flanke af 6 uger gamle athymiske nøgne mus (Charles River, Tyskland) i triplikater. Hver 7 dage tumorstørrelse blev målt med en skydelære.

RNA profilering analyse

RNA-koncentrationen blev bestemt med en NanoDrop (NanoDrop, Wilmington, Delaware, USA) spektrofotometer og dets kvalitet blev vurderet med en Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italien). For hver prøve blev 500 ng af total RNA syntetiseret til biotinyleret cRNA ved anvendelse af Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, TX). Syntesen blev udført ifølge producentens anvisninger. cRNA-koncentration og kvaliteten blev vurderet som beskrevet ovenfor. Fra hver prøve blev tekniske gentagelser produceret og 750 ng cRNA blev hybridiseret i 18 timer på mennesker HT-12_V3_0_R1 Expression BeadChips (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) i henhold til protokollen tilvejebragt af producenten. Hybridiserede chips blev vasket og farvet med streptavidin-konjugeret Cy3 (GE Healthcare Milano, Italien). BeadChips blev tørret og scannet med en Illumina BeadArray Reader (Illumina Inc.)

Mikroarrays dataanalyse:. RNA profilering, gener ‘karakterisering, berigede stier og bibliografiske netværk opdagelse

Expression filer blev normaliseret og analyseret ved anvendelse GeneSpring 10,1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Differentielt udtrykte (DEGS) gener mellem BEAS-2B og BEAS-PI3K-CA-celler blev udvalgt på grundlag af folden ændring (forholdet mellem ekspressionsniveauerne i de to tilstande) og den statistiske signifikans. Vi filtreret listerne ved hjælp fold ændre 1.5 og T-test (

s

-værdi (0,01) som tærskel. Listen degs (komponeret af 2126 probesets) blev anvendt til at vurdere den funktionelle adfærd i form af biologiske processer og . Molekylær Funktion, Udvikling Funktion og sygdom og lidelse vilkår graden af ​​berigelse blev statistisk evalueret for at afgøre, om en observeret niveau af anmærkning for en gruppe af gener er signifikant især for hver valgperiode, en

q

. – værdi blev beregnet af hypergeometrisk test (

s

≤0.05) og korrigeret ved hjælp Falsk Discovery Rate (FDR) [41]. de vilkår med en

q

-værdien over tærskelværdien betydning blev derefter valgt som repræsentant. Pathway og netværksanalyse blev udført ved hjælp Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems).

datasættet blev brudt for væsentlige veje med IPA bibliotek af kanoniske veje, og netværk blev genereret ved hjælp af IPA som grafisk repræsentation af de molekylære forhold mellem gener og genprodukter. Betydningen af ​​sammenhængen mellem listen over DEGS og Canonical Pathway blev målt ved hjælp af en Fishers eksakte test for at beregne en

s

-værdi (

s

≤0.05). Fishers eksakte test resultater blev også korrigeret for multipel testning ved hjælp FDR.

I netværk, er gener eller genprodukter repræsenteret som knuder, og det biologiske forhold mellem to knuder er repræsenteret som en kant (linje). Alle kanter er støttes af mindst én reference fra litteraturen, fra en lærebog eller fra kanonisk information lagret i IPA Knowledge Base. Menneske, mus, rotte og orthologer af et gen lagres som separate objekter, men er repræsenteret som en enkelt knudepunkt i netværket. Netværket bygningens algoritme bestemmer en statistisk score for hvert netværk. Dette gøres ved at sammenligne antallet af fokus gener, der bidrager til et givet netværk i forhold til det samlede antal forekomster af disse gener i alle netværk eller veje, der er lagret i IPA Knowledge Base. Intensiteten af ​​gener (node) farve i netværkene angiver graden af ​​nedregulering (grøn) eller opregulering (rød) af genekspression. Nodes vises ved hjælp af forskellige former, der repræsenterer den funktionelle klasse af genprodukter.

Resultater

AKT aktivering i NSCLCs

Som en udlæsning af PI3K /AKT-signalering i NSCLC vi bestemt phosphorylering status rest S473 af Akt1- (Pakt). Pakt blev evalueret på TMA’er indeholder duplikerede centrale biopsier af 107 NSCLCs. Som kontroller blev anvendt 45 matchede normale prøver. Patienternes klinisk-patologiske karakteristika er beskrevet i Materialer og metoder og opsummeret i tabel S1, S2 og S3. De opnåede fra Pakt farvning i NSCLC Resultaterne er sammenfattet i tabel 1. Pakt farvning var knap påviselige i de epitelceller fra normal alveolær epitel og fra øvre luftveje (39 ud af 45 prøver) (se figur S1). I modsætning hertil blev der observeret AKT aktivering i 60 ud af 97 i NSCLC analyseres (tabel 1). Positiv Pakt farvning var betydeligt højere i de carcinom prøver end enten normal alveolær eller bronkial epitel (P 0,001; Chi square test). Pakt farvning blev observeret i 23/37 SCC og 30/44 ADC’er (figur 1A og B, henholdsvis). Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem Pakt farvning og karakteren eller den fase af sygdommen (tabel 2): ​​Pakt farvning blev betydeligt mere repræsenteret i patienter med kvaliteter G3-G4 sammenlignet med patienter med karakterer G1-G2 (p 0,05) og i patienter med TNM stadie III sammenlignet med patienter med stadie II-sygdom (p 0,05). Se tabel S4 og S5 til distribution af patienter i SCC og ADC’er. Disse resultater viser, at efter aftale med arbejde i andre befolkningsgrupper, i italiensk NSCLC patienter AKT aktivering forekommer i tumorvæv og korrelerer med en mere avanceret stadium af sygdommen [20] – [22]. Se også tabel S9 og S10 for en detaljeret, patient-by-patient, liste over Pakt positivitet

A, venstre:. SCC negativ for Pakt phosphorylering; højre: SCC positive for pS473 phosphorylering. B, venstre: ADC negativ for Pakt phosphorylering; højre: ADC positive for pS473 phosphorylering. Forstørrelse 10 × og 40 × henholdsvis Vejviser

Mekanismer for AKT aktivering i NSCLCs:. Immunhistokemi

For at undersøge de molekylære mekanismer, der fører til AKT aktivering i italienske patienter påvirket af NSCLC vi foretaget en omfattende analyse af udtrykket, og /eller den genetiske status Akt1- og AKT2 og deres nærmeste regulatorer (KRAS, PIK3CA og PTEN). Af de 107 sager til stede på TMA’er 96 kunne være ordentligt analyseret for Akt1, 83 for AKT2, 104 for PTEN og 92 for PIK3CA.

Se materialer og metoder for de evalueringskriterier, der anvendes til Akt1. Kort fortalt prøver defineret (-) var helt negative for Akt1; prøver definerede (+) indeholdt op til 10% af positive celler; prøver defineret (++) omfattede 11-50% af positive celler; prøver definerede (+++) omfattede 50% af positive celler. Figur S2 viser repræsentative farvninger af (+), (++) eller (+++) Akt1 ekspression i SCC og ADCs. Tumorer blev klassificeret i en lav ekspression gruppen omfattende (-) og (+) og en høj ekspression gruppe, der omfatter (++) og (+++). Analyse af TMA’er 258,1 og 258,2 viste at Akt1 var overudtrykt i 17/96 NSCLC tilfælde (~19%) (figur 2), med SCC’er og ADCs viser lignende resultater: 7/37 Akt1- positive tumorer var SCC’er (19%) og 7/44 Akt1 positive tumorer var ADCs (16%). Se figur 2A og B, hhv. . Ni ud af 15 (60%) NSCLCs overekspression Akt1 viste AKT aktivering (tabel 3)

A, venstre: SCC negativ for Akt1 udtryk; højre: SCC positive for Akt1 ekspression. B, venstre: ADC negative for Akt1 ekspression; højre: ADC positive for Akt1 ekspression. Forstørrelse 10 × og 40 × hhv. C. tofarvet fluorescens in situ hybridiseringsanalyse af Akt1- genkopital. FISH-analyse af Akt1- (røde signaler) og centromer af kromosom 14 (grønne signaler). Venstre, NSCLC prøve med diploide celler; ret, NSCLC prøve med flere klynger pletter af røde signaler af Akt1 med 2 centromerfusioner signaler (gen forstærkning). Original forstørrelse 100 ×.

Vi analyserede derefter udtryk for AKT2 i NSCLCs. Se materialer og metoder til vurdering af AKT2 farvning. Prøver defineret (-) var helt negative for AKT2; prøver defineret (+) var med op til 10% af positive celler; prøver defineret (++) omfattede 11-50% af positive celler; og prøver defineret (+++) omfattede 50% af positive celler. Figur S3 viser repræsentative farvninger af (+), (++) eller (+++) AKT2 ekspression i SCC og ADCs. Tumorer blev klassificeret i en lav ekspression gruppen omfattende (-) og (+) og en høj ekspression gruppe, der omfatter (++) og (+++). AKT2 blev overudtrykt i 18/83 NSCLCs (-22%) (figur 3). Ved forskel med Akt1 blev AKT2 overekspression observeret hyppigere i SCC (10/31 VKF, 32%, 4/33 ADC’er, 12%). Se figur 3A og B, hhv. Desuden er de fleste Akt2 positive tumorer (12/17, 71%) viste AKT aktivering (tabel 3)

A, venstre:. SCC negativ for AKT2 udtryk; højre: SCC positive for AKT2 ekspression. B, venstre: ADC negative for AKT2 ekspression; højre: ADC positive for AKT2 ekspression. Forstørrelse 10 × og 40 × hhv. C. tofarvet fluorescens in situ hybridiseringsanalyse af AKT2 genkopital. FISH-analyse af AKT2 (røde signaler) og kromosomområde 19p13.1 (grønne signaler). Venstre, NSCLC prøve med diploide celler; ret, NSCLC prøve med flere klynger pletter af røde signaler af AKT2 med 2 kromosomområde 19p13.1 signaler (gen forstærkning). Original forstørrelse 100 ×

Patienter påløbne for denne undersøgelse var allerede blevet karakteriseret for PTEN udtryk [38]:. Komplet tab fandt sted i 41 af 104 (39%) NSCLCs og delvis nedregulering blev observeret i 41 yderligere tilfælde. PTEN tab blev observeret hyppigere i SCC (22/40, 55%) end i ADC’er (14/51, 27%) (se figur S5). Men når korreleret med AKT aktivering, tab eller reduktion af indholdet af PTEN protein blev ikke forbundet med AKT aktivering (n = 95; p = 0,832). (Tabel 3)

Endelig har vi analyseret ekspression af den katalytiske underenhed af PI3K, p110α. evalueringskriterier er rapporteret i materialer og metoder. Prøver defineret (-) var helt negative for p110α; prøver defineret (+) indeholdt op til 10% af p110α positive celler; prøver defineret (++) omfattede 11-50% af p110α positive celler; og prøver definerede (+++) omfattede 50% af p110α positive celler. Figur S4 viser repræsentative farvninger af (+), (++) eller (+++) Akt1 ekspression i SCC og ADCs. Tumorer blev klassificeret i en lav ekspression gruppen omfattende (-) og (+) og en høj ekspression gruppe, der omfatter (++) og (+++). Vi observerede p110α overekspression i ~29% af NSCLCs (27/92): 12 ud af 34 var SCC’er (35%) og 12 ud af 43 var ADCs (28%) (figur 4A og 4B). Ved forskel med andre gener i vejen, der er blevet analyseret, fandt vi, at NSCLCs med overudtrykt p110α præsenteret betydeligt aktiveret AKT (18 ud af 26; p = 0,02) (tabel 3)

A, venstre:. SCC negative for PIK3CA udtryk; højre: SCC positive for PIK3CA ekspression. B, venstre: ADC negativ for PIK3CA udtryk; højre: ADC positive for PI3KCA ekspression. Forstørrelse 10 × og 40 × hhv. C. tofarvet fluorescens in situ hybridiseringsanalyse af PIK3CA genkopital. FISH-analyse af PIK3CA (røde signaler) og kromosomområde 3p14.1 (grønne signaler). Venstre, NSCLC prøve med diploide celler; ret, NSCLC prøve med flere klynger pletter af røde signaler af PIK3CA med 2 kromosomområde 3p14.1 signaler (gen forstærkning). Original forstørrelse 100 ×.

Især fra den integrerede analyse af TMA’er fandt vi, at AKT aktivering blev observeret hyppigere i tumorer viser afvigende ekspression af mere end et enkelt gen i PI3K pathway (PTEN tab eller overekspression af Akt1-, AKT2, p110α henholdsvis). Faktisk blev AKT aktivering detekteret i 15-64% af tumorer viser aberration i et enkelt gen, 44-89% af tumorer med afvigende ekspression af to gener, 67-100% af tumorer med afvigende ekspression af tre gener og 100% af tumorer med afvigende ekspression af alle fire gener. Omvendt afvigende ekspression af medlemmerne af PI3K pathway var mindre udbredt i tumorer, der viser manglende aktivering af AKT signalering (se tabel 4)

Mekanismer af protein overekspression:. FISH-analyse

FISH analyse i NSCLCs blev udført i Akt1, AKT2 og PIK3CA at bestemme de molekylære mekanismer i overekspression af de tilsvarende proteiner. Se materialer og metoder til klassificering af tumorer ved FISH. Vi fandt 20/82 NSCLC (24%) med kopiantal gevinst af Akt1- genet ved kromosom 14, hvoraf 16 var høj polysomy ( 4 kopier) og 4 fokal amplifikation (SCC-11, SCC-12, SCC-14 og SCC-21) (figur 2C). Forventeligt, flere Akt1 FISH-positive NSCLCs (12 ud af 20 tilfælde, 60%) viste moderat eller høj Akt1 udtryk. Se tabel S9 og S10 for en detaljeret liste over genetiske ændringer detekteret i enkelte SCC og ADC patienter. I tilfælde af AKT2, vi observerede 24/73 NSCLCs (31%) med kopital forstærkning af genet på kromosom 19, hvoraf 23 patienter havde høj polysomy og 1 patient havde fokal amplifikation (SCC-11). Se figur 3C for et repræsentativt eksempel. Men betydningen af ​​AKT2 forstærkning i lungekræft fortsat uklart, siden 13/24 (54%) tilfælde af Akt2 FISH-positive tumorer ikke viste øget ekspression af det tilsvarende protein.

FISH-analyse med kromosom 3q26. 32 prober afslørede tilstedeværelsen af ​​en stigning i PIK3CA genkopiantallet i 19 tilfælde (~26%), som alle præsenterede høj polysomy, med 7 tilfælde viser også fokal amplifikation (ADC-5, SCC-4, SCC-14, SCC-16, SCC-19, SCC-30, SCC-34) (figur 4C). De fleste af NSCLCs med øget kopi antal PIK3CA (13 ud af 19 tilfælde, 68%) viste moderat eller høj ekspression af p110α.

Men ikke alle FISH-positive NSCLCs resulterede i aktiveringen af ​​AKT-signalering. Som vist i tabel S6, S7 og S8, 11/18, 10/19 og 14/23 sager, der blev FISH-positive for PIK3CA, Akt1 og AKT2 resulterede positiv for Pakt, henholdsvis.

Mekanismer af AKT aktivering : mutation analyse af PIK3CA og KRAS

Patienter påløbne for denne undersøgelse var allerede blevet analyseret for Akt1 mutationer [24]. Patient SCC-29 præsenteret en somatisk mutation i genet, der koder Akt1 resulterer i en glutaminsyre til lysin substitution ved aminosyre 17 (E17K) [24]. Tumoren fra denne patient viste øget AKT udtryk og aktivitet. Ligeledes missense mutationer i PIK3CA er sjældent rapporteret [42] – [45]. Vi fandt en GAG1633 → AAG substitution, der fører til aminosyreændring E545K i én SCC (SCC-6) (figur 5A og B). Omvendt viste 7 NSCLCs mutationer i KRAS: G12A (GGT → GCT) (n = 1); G12C (GGT → TGT) (n = 4); G12V (GGT → GTT) (n = 1); G13C (GGC → TGC) (n = 1) (figur 5C). KRAS-mutationer blev påvist primært i ADCs (6 af 32; 19%) som beskrevet [46], [47]. Fem ud af syv tilfælde med mutationer i KRAS viste signifikant AKT aktivering (figur 5D).

A. Mutationsdetektion i exonerne 9 og 20 i PIK3CA fra NSCLC.