PLoS ONE: Evaluering Baculovirus som en vektor for human prostatacancer Gene Therapy

Abstrakt

Genterapi er en attraktiv strategi for non-invasiv behandling af prostatacancer, hvor aktuelle kliniske tiltag viser begrænset effekt. Her, vi evaluere brugen af ​​insektvirus, baculovirus (BV), som et hidtil ukendt vektor til human prostatacancer genterapi. Da prostatatumorer repræsenterer et heterogent miljø, en terapeutisk fremgangsmåde, der opnår langsigtet regression skal kunne målrette multiple transformerede cellepopulationer. Endvidere ville diskrimination i målretningen af ​​maligne sammenlignet med ikke-maligne celler har værdi i at minimere bivirkninger. Vi anvendte en række prostatakræft modeller til at analysere potentialet for BV at nå disse mål.

In vitro

, både traditionelle prostata cellelinjer samt primære epitel eller stromale celler fra patientens prostata biopsier, i to eller tre-dimensionelle kulturer, blev anvendt. Vi har også evalueret BV

in vivo

i murine prostata kræft xenograftmodeller. BV var i stand til fortrinsvis at transducere invasive maligne prostata cancer cellelinjer i forhold til fase kræft tidligt og ikke-maligne prøver, en begrænsning, der ikke var en funktion af nuklear import. Af mere klinisk relevans, blev primære patient-afledte prostatacancerceller også effektivt transduceres af BV, med robuste satser observeret i epitelceller fra basal fænotype, der udtrykte BV-kodede transgener hurtigere end epitelceller af en mere differentieret, luminale fænotype. Maksimal transduktionsevne blev observeret i stromale celler. BV var i stand til at trænge gennem tre-dimensionelle strukturer, herunder

in vitro

sfæroider og

in vivo

ortotopisk xenografter. BV vektorer indeholdende en nitroreduktase transgen i et gen-rettet enzym prodrug terapi fremgangsmåde var i stand til effektivt at dræbe maligne prostata mål efter indgivelse af pro-drug, CB1954. Således BV er stand til at transducere en stor del af prostata celletyper i en heterogen 3-D prostata tumor, kan lette celledød under anvendelse af et pro-drug tilgang, og viser lovende som en vektor til behandling af prostatacancer.

Henvisning: Swift SL, Rivera GC, Dussupt V, Leadley RM, Hudson LC, MA de Ridder C, et al. (2013) Evaluering Baculovirus som vektor for human prostatacancer Gene Therapy. PLoS ONE 8 (6): e65557. doi: 10,1371 /journal.pone.0065557

Redaktør: Rui Medeiros, IPO, Inst Port Oncology, Portugal

Modtaget: 1. februar, 2013; Accepteret: April 26, 2013; Udgivet: 6 Juni 2013

Copyright: © 2013 Swift et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev udført i henhold til EU-finansierede samarbejdsprojekter: Prostata initiativ for Gene Therapy ‘PIG’ (RP5), Baculogenes (FP6) og Gene Therapy: En integreret tilgang til Neoplastisk Treatment ‘Giant’ (FP6), med yderligere støtte fra Yorkshire Cancer Research . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i det Forenede Kongerige, er mere end 40.000 nye tilfælde af prostatakræft diagnosticeres hvert år, og 11.000 patienter dør som en direkte følge af denne sygdom (Kilde: Kontoret for National Statistics). Den humane prostatakirtel er en heterogent miljø, primært sammensat af epitel- og stromale celletyper. Epitel segmentet består af et dobbeltlag af celler: en kontinuerlig basal lag af udifferentierede celler, der er i kontakt med basalmembranen, overlejret med differentierede sekretoriske luminale celler [1]. Det basale epitel lag repræsenterer den mest proliferative kammer [2]. Mens hovedparten af ​​de fleste prostatatumorer omfatter celler af epitelial oprindelse [3], flere celletyper har kapacitet til at bidrage til malignitet og skal udryddes for at opnå en effektiv klinisk resultat.

Typisk scenen af prostata sygdom og reaktionsevne tumoren til androgener er to vigtige faktorer, at direkte behandlingsstrategier. Mens lokaliserede prostatatumorer kan kirurgisk resektion via radikal prostatektomi, er dette ofte ledsaget af uønskede bivirkninger. En alternativ fremgangsmåde, androgen ablation terapi, fjerner levering af androgener, som mange prostatatumorer afhængige for vækst og overlevelse; imidlertid en gentagelse af mere aggressive kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) er et fælles resultat. Da CRPC er i sidste ende modstandsdygtig over for strålebehandling og kemoterapi, nye strategier er afgørende for at give forbedrede resultater for patienter med prostatacancer. Genterapi er en mulig løsning, og ville ideelt set være placeret til at målrette både primære og sekundære prostata tumorer efter systemisk administration.

Mens mange forskellige vektorer er blevet evalueret for sikkerhed og effekt i forsøg med genterapi [4] brug af ikke-menneskelige, ikke-sygdomsfremkaldende vira, såsom baculovirus,

Autographa californica

Multiple nucleopolyhedrovirus (

Ac

MNPV), er et relativt dublerede område. BV er et dobbeltstrenget DNA-virus, der naturligt inficerer insekter værter, og selvom BV effektivt kan transducere pattedyrceller, produktiv replikation er ikke mulig på grund af kravet om insekt-specifikt cellulært maskineri [5], [6]. Som genterapivektor, BV har flere iboende fordele. Hovedparten af ​​den menneskelige befolkning har nogen tidligere eksponering for BV og er således immunologisk naive. The BV capsid er stand til at ekspandere til at rumme store transgene inserts, og den naturlige tropisme af baculovirus let modificeres. BV er i stand til at transducere både aktivt-opdeling og hvilende pattedyrceller, en funktion, der har særlig relevans i behandling af prostatacancer, en langsomt voksende tumor [7]. Tilstedeværelsen af ​​baculovirus, selv ved en høj multiplicitet af infektion (MOI), ikke er toksisk og ikke påvirker cellevækst og differentiering potentiale [8], [9]. Endelig har omfattende langsigtede sikkerhedsstudier, gennemført i 1960’erne, da baculovirus dukket op som et vigtigt perspektiv som en biologisk insekticid, bevist baculovirus uskadelige for mennesker [10].

evne BV til at levere funktionelt bæredygtig transgen ekspression i pattedyrceller blev først påvist i 1995 [11]. Siden da

Ac

MNPV har vist sig i stand til at transducere en lang række af mammale celletyper, herunder humane primære neuroner [12], lever [11], mesenkymale stamceller [13] og embryonale stamceller [9] . Mens de tidligste forsøg på at opnå BV genoverførsel

in vivo

mislykkedes på grund af vektor inaktivering ved serumkomponenter, såsom komplement [14], effektiv baculovirus transduktion kan opnås i nærvær af kemikalie- eller protein- baserede komplement-hæmmere, enten som co-inokulum [15], [16], [17] eller incorporations i BV kuvert protein [17], [18], [19]. BV er blevet brugt som en præklinisk genterapi vektor

in vivo

[12], [20], [21], [22], [23], og i forbindelse med kræft har med held behandlet murine gastrisk xenografter [24].

Her vurderer vi BV som en genterapivektor til behandling af human prostatacancer. Vi beskriver anvendelsen af ​​BV til fortrinsvis at transducere og levere både reporter og celle-dødelige gener til maligne prostata prøver af cellelinien og patient oprindelse, udover tredimensionale kulturer og

in vivo

murine tumorer, med høj effektivitet.

Materialer og metoder

Insect Cell Linje Vedligeholdelse

Sf21 og Sf9- (Invitrogen) cellelinier (isoleret fra det æggestokkene væv af faldet hær orm,

Spodoptera frugiperda

) blev opretholdt i spinner hængende omrører kolber ved 27 ° C i Graces medium tilsat 10% føtalt kalveserum (PAA Laboratories) og 0,1% (vol /vol) Pluronic® F-68 (Invitrogen). Monolagskulturer blev opretholdt i fravær af Pluronic.

humant prostataspecifikt cellelinie Vedligeholdelse

LNCaP (androgen-sensitive, veldifferentierede prostatacancerceller afledt fra en lymfeknude metastase) og PC-3 (androgen-uafhængige og dårligt differentierede prostatacancerceller afledt fra en knoglemetastaser) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). PC346C (androgen-sensitive, godt differentierede prostatacancerceller afledt fra en primær prostata tumor) blev etableret i Erasmus Medical Centre, Holland [25]. P4E6 (epitelceller afledt fra en veldifferentieret primær prostatatumor udødeliggjort ved transfektion med HPV E6), PNT1A og PNT2C2 (ikke-malign prostata celler fra forskellige patienter, henholdsvis udødeliggjorte ved transfektion med SV40) blev etableret i vores laboratorium [26] , [27]. Alle celler blev håndteret under god laboratoriepraksis betingelser i definerede passage vinduer, blev månedlige certificeret fri for mycoplasma og blev genotype (ved hjælp af ATCC-godkendte Powerplex 1.2-system, Promega) for at sikre ægtheden. Cellerne blev rutinemæssigt passeret under tidligere beskrevne betingelser [28].

primær cellekultur

Patient prostata væv blev taget med informeret og skriftligt samtykke og godkendelse fra York Research etiske komité fra patienter, der gennemgår transuretral resektion i prostata, cystektomi eller radikal prostatektomi. Epitelceller blev isoleret som tidligere [29] beskrevet og udvalgt til α

2β

1

hi udtryk ved hjælp hurtig tilslutning til type I collagen-coatede plader (BD Biosciences). Celler blev co-dyrket på kollagen I plastvarer med bestrålede STO murine feederceller indtil vækst blev veletableret i KSFM suppleret med 5 ng /ml EGF, 50 ug /ml oksehypofyseekstrakt og 2 mM L-glutamin (KSFMsup). For at inducere differentiering blev celler dyrket i en 50:50 (v /v) blanding af DMEM og Hams F12 suppleret med 10% FCS, 10 nM DHT og 2 mM L-glutamin (DH10) i 4-6 dage. Isolerede stromaceller blev opformeret i T25-kolber i RPMI suppleret med 10% FCS og 2 mM L-Glutamin.

Baculovirus Fremstilling

rekombinant baculovirus vektorer blev konstrueret ved anvendelse af BacVector 1000 kit (Novagen), i henhold til producentens anvisninger, med specialfremstillede pBAC64: CMV-EGFPCAT, pBAC64: CMV-EGFP eller pBAC64: CMV-NTR-EGFP transfer plasmider. Disse plasmider har rygraden i pBAC4X-1 (Novagen) med insertioner af den

polh

promotor og

GP64 Salg genkodende sekvenser fra pBACsurf-1 (Novagen) og cytomegalovirus (CMV) umiddelbare tidlige promotor, der driver transskription af EGFP, en EGFPCAT fusionsprotein (BD Biosciences Clontech) eller mNitroreductase (NTR) -IRES-EGFP ekspressionskassetter. Rekombinante vira underkastedes tre runder af plaque oprensning og højtiter lagrene blev dyrket ved infektion af Sf21 insektceller ved MOI = 0,1 plak-dannende enheder (PFU) per celle og høst virus supernatant efter 5 dage. Virusholdige cellesupernatant blev koncentreret ved ultracentrifugering ved 24.000 rpm i 90 minutter ved 4 ° C under anvendelse af en Beckman SW28 rotor og yderligere oprenset ved ultracentrifugering gennem en sucrosegradient ved 24.000 rpm i en Beckman SW41 rotor. Viruspartikler blev vasket og resuspenderet i PBS (ca. 1/500 startvolumen) og titreret under anvendelse af plaque assay på Sf9-celler. Partiklen: PFU-forholdet var generelt i området fra 100-300 [30], [31], [32]. For transduktion af prostataceller, blev virus fortyndet i serumfrit medium passende for hver celletype, medmindre andet er angivet.

konfokalmikroskopi Analyse af Monolag og dobbeltlag

For både monolags- og dobbeltlag konfokale eksperimenter blev celler podet på 8-brønds kammerobjektglas med et dækglas base (Lab-Tek) med en initial densitet på 2-5 x 10

4 celler per brønd (præ-coatet med 0,1 mg /ml poly-L-lysin for LNCaP-celler). For at generere en dobbeltlag blev mediet ændres hver 2 dage, indtil en dobbelt lag af epitelial vækst er opnået. BV-[CMV-EGFPCAT] eller BV-[CMV-EGFP] partikler blev tilsat ved 500 PFU /celle for et bestemt tidsrum, hvorefter celler blev vasket for at fjerne ubundet virus og straks fikseret i 4% (vægt /volumen) paraformaldehyd . Celler blev permeabiliseres i 0,5% (vol /vol) Triton-X 100 (Sigma) eller 70% EtOH, derefter blokeret i 10% serum. Den BV capsidprotein, vp39, blev opdaget ved hjælp af en primær monoklonalt antistof (P10C6), høflighed af Dr. L.E. Volkman, University of California, Berkeley, USA [33], og en ged anti-mus Alexa Fluor 568 sekundært antistof (Invitrogen). I dobbeltlagede eksperimenter blev antistof-fortyndinger fremstillet i 0,1% (w /v) fraktion V BSA (Sigma) støtte penetration i basale lag, mens i monolag eksperimenter blev antistof-fortyndinger fremstillet i PBS. Til analyse af primær celledifferentiering, blev HMWCK (Dako) antistof tilsættes sammen med efterfølgende påføring af et sekundært ged anti-mus Alexa 568-antistof (Invitrogen). Et andet primært antistof (CK18-FITC (Sigma)) blev derefter påført. Vectashield indeholdende DAPI (Vector Lab) blev tilsat før visualisere celler under fluorescens under anvendelse af et Zeiss LSM 510 meta konfokalt mikroskop.

flowcytometri

Celler blev udpladet med en tæthed på 0,2-1 x 10

5 pr brønd af en 48-brønds plade og inkuberet ved 37 ° C natten over. Celler blev vasket en gang i PBS før tilsætning af virus fortyndet i serumfrit medium passende for hver celletype. Efter den ønskede længde af tid, blev virus aspireret, cellerne blev vasket en gang i serumfrit medium og overlagt i serumholdigt vækstmedium. Celler blev frigjort under anvendelse af Trypsin:. EDTA og resuspenderet i 0,02% (vægt /volumen) EDTA, med et minimum på 10.000 singlet begivenheder talt ved anvendelse en cyan ™ ADP flowcytometer

PC346C Sfæroide Transduktion

spontant dannede sfæroider blev høstet fra overfladen af ​​en T25 kolbe indeholdende PC346C celler og inkuberet i 10 minutter ved 37 ° C i komplet dyrkningsmedium indeholdende BV-[CMV-EGFP] i en koncentration på 8,6 × 10

9 PFU /ml . Sfæroiderne blev fortyndet i 2,5 ml medium og genudpladet i en T12.5 kolbe. Fluorescerende billeder blev taget med et Nikon Eclipse TE300-mikroskop på tre dage efter infektion.

ortotopisk Xenografter

Tumorer blev oprettet ved injektion af 1 × 10

6 PC346C celler ortotopisk i dorsolaterale prostata af athymiske nøgne mus (NMRI nu /nu, Taconic M BA /S, Ry, Danmark) som beskrevet tidligere [34], i overensstemmelse med etiske procedurer og under godkendelse fra Erasmus Experimental Animal center etiske komité. Tumorvækst blev overvåget ved transrektal ultrasonografi ved anvendelse af en tilpasset intravaskulær ultralyd-system [35]. Ved tumor størrelser mellem 80 og 120 mg, to doser (3 × 10

7 eller 1 x 10

8 pfu) af BV-[CMV-EGFP] blev administreret intratumoralt under bedøvelse. Dyr blev aflivet 3 dage senere, tumorer høstedes, fikseret i 2 timer i 2% (vægt /volumen) paraformaldehyd i PBS, skåret på en Vibratome (Campden Instruments, Loughborough, UK) i 70 um tykke snit og monteret på objektglas i Vectashield (Vector Lab). EGFP-ekspression blev visualiseret ved konfokal mikroskopi (Carl Zeiss, Benelux).

Evaluering af cellelevedygtighed ved MTS Assay

Celler blev udpladet ved en tæthed på 1 x 10

4 celler per brønd i en plade med 96 og fastgøres natten. BV-[CMV-NTR-EGFP] blev tilsat til tredobbelte brønde på MOI = 500 i 4 timer, vasket og inkuberet i yderligere 20 timer før tilsætning af CB1954 (20 uM for alle delprøver og cellelinjer med undtagelse af PC-3, for hvilke 40 pM blev anvendt). Efter yderligere 48 h for cellelinier eller 30 timer for primære celler, blev cellelevedygtighed målt ved anvendelse af CellTiter 96® Aqueous Assay Reagent (Promega) i overensstemmelse med producentens instruktioner og pladerne aflæst under anvendelse af en BMG Labtech POLARstar OPTIMA pladelæser. Andelen af ​​døde celler blev beregnet ved at sammenligne med levedygtige celler i en utransducerede brønd. Et duplikat af brønde blev brugt til flowcytometri som beskrevet ovenfor for at bestemme hyppigheden af ​​positivt transducerede celler.

Resultater

BV Transduktion er mest effektive i maligne Prostata cellelinjer sammenlignet med ikke-maligne Controls

for at bestemme kapaciteten af ​​BV til forskelligt transducere maligne vs non-maligne prostata mål, vi evaluerede modtagelighed et panel af etablerede humane prostata cellelinjer til BV transduktion. Celler blev inkuberet med et rekombinant BV vektor modificeret til at bære en EGFPCAT transgen (BV-[CMV-EGFPCAT]) under anvendelse af en fast MOI på 500 og en inkubationstid på 48 timer. Maligne cellelinier med høj metastatisk potentiale, herunder LNCaP, PC3 og PC346C, var stærkt transduceret (~ 80% EGFP-positive celler), medens ikke-maligne cellelinier PNT1A og PNT2C2 blev mindst transduceret (op til 10% EGFP-positive celler) (Figur 1A). P4E6, en cellelinie afledt af en indledt, men tidlig fase tumor, var i det mellemliggende område og med omtrent 20% EGFP-positive celler (figur 1A). Således frekvensen af ​​celler positivt transducerede af BV korreleret med malignitet og metastatisk potentiale.

(A) Procentdel af EGFP-positive celler efter transduktion af et panel af høj kvalitet ondartet (rød), lav kvalitet maligne (black ) eller ikke-maligne (blå) prostata cellelinier med BV-[CMV-EGFPCAT] ved MOI = 500 i 48 timer. Fejlsøjler skildre – /+ en standardafvigelse. (B) Relative ekspressionsniveauer af EGFP følgende transduktion med BV-[CMV-EGFPCAT] ved en mættende MOI (500 for LNCaP, PC3 og PNT1A, 1000 for PNT2C2). Procentdelen af ​​EGFP-positive celler blev normaliseret til de niveauer, der er opnået efter 48 timers inkubation i nærvær af virus for hver celletype (sat til 1). Ondartede cellelinier: PC3 (▴), LNCaP (▪); Ikke-Ondartede cellelinier: PNT2C2 (♦), PNT1A (▾). Fejlsøjler skildre – /+ en standardafvigelse. (C) Konfokal mikroskopi billeder (enkelt skive eller Z-stack) af BV-transducerede LNCaP, PC3 eller PNT1A celler ved 8 timer efter transduktion (MOI = 500). Rød fluorescens indikerer BV capsid (anti-vp39), nuklear farvning i blåt (DAPI) og BV-drevne EGFP udtryk i grøn.

For at undersøge de optimale transduktion betingelser for stærkt modtagelige (LNCaP, PC- 3) versus mindre modtagelige (PNT1A og PNT2C2) prostata cellelinjer, analyserede vi både MOI krævet for at opnå transduktion mætning og kinetikken for transduktion på dette MOI. Cellerne blev inkuberet i 1 time i nærværelse af stigende doser af BV-[CMV-EGFPCAT], og andelen af ​​EGFP-positive celler blev analyseret efter 24 timer. Den MOI der kræves for at opnå den maksimale hyppighed af transducerede celler var 500 PFU pr celle for LNCaP, PC3 og PNT1A, og 1000 PFU pr celle for PNT2C2 (data ikke vist). Ved hjælp af disse mættende MOI blev kinetikken for transduktion undersøgt over tid. Ondartede prostata cellelinjer (LNCaP og PC-3) viste en hurtig og effektiv optagelse af BV-[CMV-EGFPCAT], som kun kræver korte inkubationstid (~45 eller -90 min, henholdsvis) for at nå op på 50% af de registrerede niveauer på 48 h (figur 1B). Omvendt ikke-maligne prostata-cellelinier (PNT1A og PNT2C2) kræves udvidede inkubationstider (~ 10 h eller ~8 h, henholdsvis) for at opnå 50% af niveauerne efter 48 timer (figur 1b).

One fortolkning af disse forskelle i transduktion er, at kerneimport af BV capsidet er defekt i nogle celletyper (gennemgået af [36]). At evaluere denne hypotese i vores prostata cellelinje modeller, blev den subcellulære lokalisering af BV capsider undersøgt ved anvendelse af konfokal mikroskopi i 8 timer efter transduktion i de stærkt modtagelige malign LNCaP og PC-3-cellelinier og den mindre modtagelige ikke-malign PNT1A cellelinie . BV capsider blev observeret i kernen af ​​alle tre celletyper (figur 1C), og visuel analyse af flere synsfelter afslørede ingen forskelle i niveauet af lokalisering nukleare capsid. Imidlertid PC-3-celler havde en højere grad af overfladebundet BV, hvorimod PNT1A celler havde en højere grad af BV i cytoplasmaet (figur 1C).

Celler af Basal (Udifferentieret) Fænotype transduceres lettere end Luminal (Differentieret) Celler i Primary prostata epithelial Cultures

for at udvide vores vurdering af BV i en mere biologisk relevant situation vi ansat primære patient biopsi-afledte prostata epitelial cellekulturer. Da hovedparten af ​​humane prostata tumorer omfatter celler af epitelial oprindelse, med både udifferentieret (basal) og godt-opdelte (luminale) fænotyper til stede, vi fastslået, om BV var i stand til at målrette både epitelial cellepopulationer på forskellige stadier af differentiering. Primær prostata epitelceller afledt af tre patientgrupper tumorbiopsier (Gleason score 6, 7 og 8/9) blev dyrket under to forskellige forhold: i KSFMsup medium til at opretholde celler i en basal tilstand, eller i DH10 medium at inducere differentiering, baseret på arbejde af [37]. Ændringer i differentiering status under disse distinkte dyrkningsbetingelser blev bekræftet ved immunofluorescent analyse af klassiske differentiering markører (basale markører: cytokeratiner (CK) 1, 5, 10 og 14; luminale markør: CK18), baseret på arbejde af [38] (Supplerende figur 1). På en per-patient grundlag blev celler dyrket i KSFMsup eller DH10 inkuberet med BV-[CMV-EGFPCAT] for at øge længder af tid og analyseret ved flowcytometri på 48 t. Epitheldifferentiering reducerede transduktion frekvenser samlet når cellerne blev inkuberet med virus for mindre end 10 h: for eksempel i celler, der stammer fra en Gleason 6 tumor, det maksimale niveau for infektion opnået i basal (KSFMsup) celler ved 4 h (45,33 ± 3,55 %) var betydeligt højere end toppen af ​​infektion i luminal (DH10) celler (21,69 ± 1,78%) ved 8 h (figur 2A). Over længere perioder af BV inkubation, forskellen i transduktion niveauer mellem KSFMsup- og DH10-dyrkede celler blev mindre udtalt, men forblev lavere i differentierede (DH10) cellepopulationer (figur 2A).

(A) Procentdel af EGFP-positive celler ved 48 timer efter transduktion med BV-[CMV-EGFPCAT] ved MOI = 500 til forøgelse tidsrum i tre primære maligne prostata epitelceller prøver (Gleason 6, 7 eller 8/9), som opbevares i en basal tilstand ved dyrkning i KSFMsup (▪), eller dyrkes i differentiere betingelser i DH10 (▴). Fejlsøjler skildre – /+ en standardafvigelse. (B) Lokalisering af BV capsider i primære epitelceller fra en Gleason 8/9 tumor dyrkes i et dobbeltlag, enten 1 time eller 16 timer efter inkubation med BV-[CMV-EGFPCAT] ved MOI = 250. Red fluorescens indikerer BV capsider detekteret med anti-vp39, er DAPI farvning nukleare vist i blåt og BV-drevne EGFP udtryk i grønt. Konfokale billeder af det øverste lag af celler (luminal-lignende; til en gennemsnitlig z-afstand på 14,58 um fra den ventrale position) og nedre lag (basal-lignende; til en gennemsnitlig z-afstand på 6,47 um fra den ventrale position) er vist. (C) Frekvens (normaliseret til håne = 1%) eller betyde fluorescens intensiteten af ​​EGFP-positive primære stromaceller afledt af ondartede eller godartede biopsier 24 timer efter transduktion med BV-[CMV-EGFPCAT] ved MOI = 500.

for yderligere at undersøge den hurtige transduktion af basale epitelceller med BV, anvendte vi en

in vitro

celle dobbeltlag model, der efterligner den cellulære struktur af prostata. Dobbeltlaget omfattede et konfluent lag af basale epitelceller (CK1 /5/10/14 +) overlejret med en ufuldkommen øvre lag af celler med en mere differentieret, luminal fænotype (CK18 +) [28], [38]. Primære maligne prostata-epitelceller afledt fra en Gleason score 7 tumor fik lov til at danne et dobbeltlag, derefter inkuberet med BV-[CMV-EGFPCAT] i 1 time eller 16 timer og fremkaldes med konfokal mikroskopi. Efter inkubation med BV i 1 time, blev viruscapsider visualiseret i det basale lag i en punktformet farvningsmønster, men blev ikke observeret i den luminale lag (figur 2B). Efter en længere periode med inkubation (16 timer), blev påvist virus capsider i både basal og luminale lag:. Dog betydelige områder i den luminale lag forblev uden viruscapsider (figur 2B)

BV hurtigt kan og effektiv transduktion Primær prostata stromacellers

Epithelial og stromale befolkninger repræsenterer de to store cellulære komponenter i prostata tumorer. Mens epitelceller typisk omfatte størstedelen af ​​den maligne cellepopulation, er stromaceller blevet impliceret i en reciprok feedback-loop, der understøtter vækst og opretholdelse af tumorceller [39], [40]. Dette antyder, at en vellykket prostatakræft behandling bør omfatte målrettede udryddelse af malignitet-associerede stromale rum. Vi har derfor undersøgt evnen hos BV til at transducere celler af stromal oprindelse. Stromaceller afledt af maligne eller ikke-maligne primære prostata biopsier blev inkuberet med BV-[CMV-EGFPCAT] for 1, 16 eller 24 timer og analyseret ved flowcytometri. Efter 1 time blev ca. 30% af cellerne transduceres af BV, medens efter 16 h inkubation blev hver stromal celle positivt transduceres af BV (figur 2C). Ingen forskel blev observeret i hyppigheden af ​​positivt transducerede stromaceller baseret på malignitet; dog på en per-celle basis, stromaceller afledt af maligne prostata biopsiprøver udviste en større gennemsnitlige fluorescensintensitet end de afledt fra godartede biopsiprøver på tidlige tidspunkter (figur 2C). Stromaceller var derfor meget modtagelige for BV transduktion.

BV kan Succesfuld transducere 3-D Prostata Sfæroider og ortotop Xenografter

Det er blevet foreslået, at en effektiv genterapi vektor skal kunne trænge gennem flere cellelag for at opnå et klinisk relevant respons i behandlingen af ​​faste tumorer. For at karakterisere evne BV at migrere gennem cellelag, vi ansat både

in vitro

og

in vivo

tredimensionelle kulturer. For

in vitro

modellering, hule sfæroider af maligne PC346C prostata celler, som omfattede en “shell” af 2-3 cellelag og spontant løsrevet fra monolag under rutinemæssig kultur, blev inkuberet med BV-[CMV-EGFP] . På 72 timer efter inkubation blev der observeret en meget effektiv mønster af celle transduktion, med penetration af BV gennem alle cellelag (figur 3A).

(A) PC346C sfæroider transduceret med BV-[CMV-EGFP] (eller mock transduceret) ved 3 dage efter infektion. (B) PC346C tumorer høstet fra xenotransplanterede mus ved 3 dage efter infektion med BV på 3 × 10

7 (en repræsentant viste billede) eller 1 x 10

8 (to repræsentative viste billeder) pfu pr podning. Rød fluorescens viser cellekerner (Hoescht), mens BV-drevet EGFP-ekspression er vist i grøn. Pile angiver stedet for intratumoral BV injektion.

For i

n vivo

modellering, murine prostatakræft xenograftmodeller, genereres gennem ortotopisk injektion af PC346C cellelinje i dorsolaterale prostata af athymiske nøgne mus blev injiceret intratumoralt med BV-[CMV-EGFP] ved to forskellige koncentrationer (3 × 10

7 eller 1 × 10

8 pfu). Efter 72 timer blev tumorer resekteret og analyseret ved fluorescensmikroskopi. BV blev observeret med held trænge ind i tumoren, og migrere væk fra den oprindelige injektionsstedet. Dette var særlig tydeligt efter administration af den højere dosis af virus (figur 3B). Selv i tre-dimensionelle kulturer, BV var i stand til at opnå et højt niveau af celle transduktion.

Ondartede Prostata Celler kan effektivt dræbt Brug BV Vektorer i en nitroreduktase-baserede GDEPT Approach

for at teste evnen af ​​BV at opnå en celle-dødelig udgang, anvendte vi et gen-rettet enzym prodrug terapi (GDEPT) tilgang fokuseret på bakteriel

nitroreduktase

(NTR), som omdanner pro- drug CB1954 (5- (aziridin-1-yl) -2,4-dinitrobenzamide) til en kraftigt virkende DNA tværbindingsmiddel [41]. Derfor konstruerede vi en BV bærer en ekspressionskassette, hvor den stærke mammal CMV-promotoren kørte ekspression af mNTR-IRES-EGFP (BV-[CMV-NTR-EGFP]). Et panel af maligne og ikke-maligne prostata-cellelinier blev transduceret med BV-[CMV-NTR-EGFP], og cellelevedygtighed blev evalueret efter indgivelse af pro-drug, CB1954. Andelen af ​​ikke-levedygtige celler, som målt ved MTS-assay efter 48 timer, var signifikant højere i maligne prøver med høj metastatisk potentiale (PC346C, PC3 og LNCaP) sammenlignet med ikke-maligne prøver (PNT1A og PNT2C2) (P 0,001) (figur 4A). Debuterende maligne prøver (P4E6) faldt i den mellemliggende vifte af levedygtighed. Endvidere blev cellernes levedygtighed efter pro-drug administration direkte relateret til graden af ​​BV transduktion (figur 4A). Denne analyse blev forlænget til primære patient-afledt epithelial cellekulturer. Tre maligne og to ikke-maligne prøver blev transduceret med BV-[CMV-NTR-EGFP] og behandles med CB1954. Ved 30 h post-pro-drug administration, celledød i disse kulturer varierede fra 10% til 50%, uanset sygdomsstatus (figur 4B).

(A) Procentdel af ikke-levedygtige celler ved 48 timer post-transduktion med BV-[CMV-NTR-EGFP] (MOI = 500) og behandling med CB1954 i et panel af prostatacellelinjer, vist i forhold til hyppigheden af ​​transducerede celler og korrigeret for ubehandlede kontroller. Ondartede cellelinjer: PC346C (♦), PC3 (▴), LNCaP (▪), P4E6 (×); Ikke-maligne cellelinjer: PNT1A (+), PNT2C2 (•). Statistik repræsenterer t-test mellem PC346C /PC-3 /LNCaP vs. PNT1A /PNT2C2. (B) Procentdel af ikke-levedygtige celler ved 30 timer efter transduktion med BV-[CMV-NTR-EGFP] og behandling med CB1954 i individuelle primære prostata epitelial celleprøver (n = 3 maligne og n = 2 ikke-maligne), korrigeret for ubehandlede kontroller.

diskussion

Flere modeller af sygdom har vist, at baculovirus har et stort potentiale som en ny vektor til genterapi. Her har vi undersøgt dens anvendelighed til behandling af human prostatacancer. BV var i stand til effektivt at transducere en række prostata celler fra flere kilder, herunder

in vitro

og

in vivo

modeller. BV demonstrerede forskellen transduktion af maligne sammenlignet med ikke-maligne prostata celler, en observation, der optrådte uafhængigt af væksthastighed, eftersom cellelinier pågældende udviste lignende proliferative kapacitet (fordoblingstider: PNT2C2 (39 h), LNCaP (34 h) PC- 3 (30-34 h) og PNT1a (30 h) [26], [42], [43]). Selvom en primær mammal cellulær receptor for BV fastgørelse fortsat er ukendt, vi spekulere at malignitet-associeret opregulering af heparansulfat-modificerede proteoglycaner (HSPGs) på tumorcelleoverfladen [44], [45], som vides at være involveret i BV binding [16], [46], spiller en rolle i dette resultat.