PLoS ONE: thiazol Antibiotika Target FoxM1 og inducere apoptose i humane cancerceller

Abstrakte

Forkhead box M1 (FoxM1) onkogenisk transskription faktor repræsenterer et attraktivt terapeutisk mål i kampen mod kræft, fordi det er overudtrykt i et flertal af humane tumorer. For nylig, ved hjælp af et cellebaseret assaysystem identificerede vi thiazol antibiotikum Siomycin A som en inhibitor af FoxM1 transkriptionsaktivitet. Her rapporterer vi, at strukturelt ligner thiazol antibiotikum, thiostrepton også inhiberer den transkriptionelle aktivitet af FoxM1. Endvidere fandt vi, at disse thiopeptider ikke inhiberede den transkriptionelle aktivitet af andre medlemmer af Forkhead familien eller nogle ikke-beslægtede transkriptionsfaktorer. Yderligere forsøg viste, at thiazol antibiotika inhiberer også FoxM1 ekspression, men ikke ekspressionen af ​​andre medlemmer af Forkhead boksen familien. Desuden fandt vi, at de thiazolderivater antibiotika effektivt hæmmede væksten og inducerede potent apoptose i humane cancercellelinier af forskellig oprindelse. Thiopeptid-induceret apoptose korreleret med undertrykkelse af FoxM1 ekspression, mens overekspression af FoxM1 delvist beskyttede cancerceller fra thiazol antibiotikum-medieret celledød. Disse data tyder på, at Siomycin A og thiostrepton specifikt kan målrette FoxM1 at inducere apoptose i cancerceller og FoxM1 hæmmere /thiazol- antibiotika kan potentielt udvikles som nye anticancer lægemidler mod menneskelig neoplasi

Henvisning:. Bhat UG, Halasi M, Gartel AL (2009) thiazol Antibiotika Target FoxM1 og inducere apoptose i humane cancerceller. PLoS ONE 4 (5): e5592. doi: 10,1371 /journal.pone.0005592

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: Marts 20, 2009; Accepteret: 14. april 2009. I Udgivet: 18 maj, 2009

Copyright: © 2009 Bhat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud 1RO1CA1294414-01A1 og 1R21CA134615-01 og IDPH Billet til Cure Research Grant til ALG. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Forkhead box M1 (FoxM1) [1], en transkriptionsfaktor af Forkhead familien [2] er et af de vigtigste positive regulatorer af cellecyklus. Både ekspressionen og den transkriptionelle aktivitet af FoxM1 er forbundet med den proliferative tilstand af celler [1]. Det udtrykkes i alle væv fra fostre og i prolifererende celler af epitelial og mesenchymal oprindelse [3], [4]. FoxM1 spiller en rolle i udviklingen af ​​nervesystemet [5], og den er nødvendig for hepatoblast differentiering mod biliære epiteliale cellelinier [6], og for embryonisk udvikling af den pulmonale vaskulatur [7]. FoxM1 ekspression induceres også under lunge og lever vævsregenerering og reparation. Den transkriptionelle aktivitet af FoxM1 afhænger onkogene Ras-MAPK og Sonic Hedgehog pathways [8], [9]. FoxM1 transkriptionelt opregulerer target gener involveret i cellecyklus progression og det er kritisk for G1 /S og G2 /M overgang, og også for udførelsen af ​​det mitotiske programmet, fordi FoxM1-udtømte celler undlader at rykke ud profasen fase af mitose [10] .

Mens FoxM1 er en af ​​de mest overudtrykte gener i humane solide tumorer (revideret i [11], [12]), er dens udtryk slået fra i terminalt differentierede, ikke-delende celler [1]. FoxM1 er overudtrykt i hepatocellulære karcinomer [13], bugspytkirtelcarcinomer [14], brystkræft [15], [16], ikke-småcellet karcinom [17], anaplastisk astrocytomer og glioblastomer [18], basalcellekarcinomer [9] og intrahepatiske cholangiocarcinomas [19]. Da funktionen af ​​FoxM1 inhiberes af flere tumorsuppressorer, såsom p19-ARF, pRb, p16 og p53 og aktiveres af flere onkogene signalveje, kan FoxM1 klassificeres som et proto-onkogen. Inhibering af FoxM1 ekspression af små interfererende RNA’er [20], [21] eller af et peptid indeholdende aminosyrer 24-46 af p19

ARF [22], [23] reduceres forankringsuafhængig cellevækst in vitro og forsinket levertumor vækst i mus. Tilsvarende undertrykkelse af FoxM1 i bugspytkirtelkræftceller efter RNA-interferens førte til inhibering af deres metastatiske potentiale [24]. Disse undersøgelser har vist, at FoxM1 er afgørende for kræftcellen levedygtighed og dets hæmning kan hæmme udviklingen af ​​kræft, hvilket tyder på, at målrette FoxM1 af små molekyler kunne repræsentere en ny strategi for udvikling af nye lægemidler mod cancer [25], [26], [27] , [28].

Tidligere anvendelse af en celle-baseret screening system udviklet af vores laboratorium, identificerede vi et thiopeptid, Siomycin a (NSC-285.116) som en potent inhibitor af FoxM1 [25]. Desuden viste vi, at Siomycin A og en anden lignende thiazol antibiotikum, thiostrepton, som allerede er blevet godkendt af FDA til brug dyr, hæmmer FoxM1 og inducere apoptose i melanom celler [26], [29]. Her viste vi, at thiazolderivater antibiotika, Siomycin A og thiostrepton hæmmer FoxM1 transkriptionel aktivitet og udtryk. Vi fandt også en direkte sammenhæng mellem undertrykkelse af FoxM1 udtryk og induktion af apoptose ved de thiopeptider i forskellige humane kræftceller. Desuden har vi konstateret, at FoxM1 kunne beskytte mod celledød induceret af thiazol- antibiotika, hvilket tyder på, at disse stoffer delvist kan udøve deres anticancer aktivitet via undertrykkelse af FoxM1.

Resultater

For nylig, vi opnåede bevis for, at en anden thiazol antibiotikum, thiostrepton, der strukturelt afviger fra Siomycin A ved kun 2 rester (fig. 1A) besidder anti-cancer [30] og anti-FoxM1 egenskaber [29] ligner Siomycin A. til bedømmelse af virkningerne af thiostrepton på FoxM1 transkriptionel aktivitet og også at undersøge, hvordan thiazol- antibiotika påvirker den transkriptionelle aktivitet af andre medlemmer af Forkhead familien udviklede vi C3-Luc2.3-FoxO1 cellelinie. C3-Luc2.3-FoxO1 celler er et derivat af U2OS osteosarkomceller med en doxycyclin-inducerbar FoxM1-GFP-fusionsproteinet [25], en tamoxifen-inducerbar konstitutivt aktiv FoxO1 (AAA) -er fusionsproteinet og en FoxM1 /FoxO1-afhængige ildflueluciferase. I dette system, var vi i stand til selektivt at inducere enten FoxM1 transkriptionsaktivitet ved tilsætning af doxycyklin eller FoxO1 transkriptionsaktivitet ved tilsætning af tamoxifen. For det første at teste, hvordan thiostrepton påvirker FoxM1 transkriptionel aktivitet sammenlignet med Siomycin A, blev celler behandlet med en kombination af doxycyclin og thiazol antibiotika og 16 timer senere blev luciferaseaktiviteten målt. Vi fandt, at undertrykkelsen af ​​FoxM1 transkriptionel aktivitet ved thiostrepton er sammenlignelig med den for Siomycin A (fig. 1B), hvilket indikerer, at begge thiazol- antibiotika inhiberer FoxM1 transkriptionsaktivitet. Dernæst at bestemme, om de thiazolderivater antibiotika inhiberer den transkriptionelle aktivitet af andre Forkhead familiemedlemmer såsom FoxO1 [31], behandlede vi den C3-Luc2.3-FoxO1 cellelinje med en kombination af tamoxifen og thiopeptider. Vi fandt, at tilsætning af tamoxifen førte til induktionen af ​​FoxO1-afhængig luciferaseaktivitet, men behandlingen med thiazol- antibiotika ikke reducere denne værdi (fig. 1B). Eftersom alle medlemmer af Forkhead familien deler en konserveret Forkhead /winged-helix DNA-bindende domæne, der er ansvarlig for binding til konsensus sites, vore data tyder på, at thiopeptider ikke målretter dette domæne, og de kan have en negativ regulering kun FoxM1, men ikke andre Forkhead familiemedlemmer

(A) den kemiske struktur af thiazol antibiotikum, thiostrepton, der adskiller sig fra Siomycin A ved kun to rester (thiostrepton-R1-R2:. Isoleucin-alanin; Siomycin- R1-R2: valine- dehydroalanin). (B) Luciferase assays efter behandling af C3-Luc2.3-FoxO1 cellelinje med kombinationen af ​​enten 1 ug /ml doxycyclin (Doxy) eller 300 nM tamoxifen (Tam) og 3 pM Siomycin A (Sio) eller thiostrepton ( Tio), afslørede henholdsvis at thiostrepton er også en negativ regulator af FoxM1 transkriptionel aktivitet og thiazol antibiotika hæmmer FoxM1 transskriptionel aktivitet blandt Forkhead familiemedlemmer. (C) thiazol antibiotika nedreguleret FoxM1 protein niveauer, men ikke FoxA1, FoxO1 og FoxO3a niveauer som påvist ved immunoblotting. (D) Den HCT116-p53RE-Luc cellelinie, som stabilt udtrykker ildflueluciferase under kontrol af multiple p53 responselementer behandlet med den angivne koncentration af Siomycin A eller thiostrepton. Efter behandling natten over luciferaseaktiviteten blev målt. (E) SW480 coloncancercellelinie blev transient transficeret med TCF /Lef-afhængig TOPFlash og kontrollen FOPFlash konstruktionerne. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 3 uM Siomycin A eller thiostrepton. Den næste dag luciferaseaktiviteten blev målt. (F) A549 lungecancerceller blev transient transficeret med GLI-afhængige GLIBS-Luc, kontrol- miniTK reporterkonstruktioner og GLI ekspressionsplasmid. Celler blev behandlet med den angivne koncentration af thiopeptider 24 timer efter transfektion og luciferaseaktiviteten blev målt den følgende dag. Barer i B, D-F er repræsentative middelværdier af tredobbeltforsøg +/- SD.

I vores tidligere rapporter fandt vi uventet, at Siomycin A ikke kun nedreguleret FoxM1 transkriptionel aktivitet, men det reducerede også mRNA og proteinniveauer af FoxM1 [25], [29]. I denne undersøgelse viste vi, at thiostrepton nedregulerer også FoxM1 protein niveauer i et lignende omfang Siomycin A (Fig. 1C). Desuden fandt vi, at de thiazolderivater antibiotika ikke faldt protein niveauer af andre medlemmer af Forkhead familien såsom FoxA1, FoxO1 og FoxO3a (fig. 1C), hvilket yderligere støtter ideen om, at thiazol antibiotikum Siomycin A og thiostrepton er specifikke inhibitorer af FoxM1. For yderligere at udforske potentialet specificiteten af ​​antibiotika til FoxM1-afhængig transskription, vi testede, hvordan Siomycin A og thiostrepton påvirke transkriptionelle aktivitet af andre transkriptionsfaktorer såsom p53, Tcf /Lef og GLI. Til dette formål HCT116-p53RE-Luc cellelinie (med vildtype p53 og multiple p53 responselementer opstrøms for luciferasegenet), SW480 coloncancercellelinie (transient transficeret med TCF /Lef-afhængige TOPFlash konstruere [32] ; en gave fra Dr. Randall Moon) og A549 lunge kræftceller (forbigående transficeret med GLI-afhængige GLIBS-Luc reporter konstruktion og GLI ekspressionsplasmid, gaver fra Dr. David Robbins) blev behandlet med Siomycin a eller thiostrepton og luciferase aktivitet blev målt 16 timer efter behandling. Vi fandt, at behandling med antibiotika reducerede ikke p53, Tcf /Lef eller GLI- afhængig transskription (fig. 1D-F). viste imidlertid, vores yderligere forsøg, at de thiazol- antibiotika også påvirke NF-kB-aktivitet, men ikke aktiviteten af ​​andre studerede transkriptionsfaktorer (data ikke vist).

For at vurdere anticancer potentiale thiazol- antibiotika, vi analyserede deres virkninger på humane kræftceller af forskellig oprindelse, der havde forhøjet udtryk niveau af FoxM1. Først undersøgte vi, om den ydre eller indre apoptosecyklus er involveret i thiopeptidet apoptose. Vi behandlede caspase-8 deficiente og rekonstituerede NB7 neuroblastom-cellelinier med antibiotika i 24 timer (Fig. 2A). Vi fandt, at caspase-8 deficiente NB7 celler, som ikke kan undergå extrinsiske apoptose var næsten lige så følsomme over for thiopeptider rekonstituerede NB7 celler med aktiv caspase-8, hvilket antyder, at thiopeptidet apoptose især involverer den indre apoptotiske vej.

(A) Behandling af caspase-8 deficiente og rekonstituerede NB7 neuroblastomcellelinier med thiazol- antibiotika afslørede, at thiopeptid-induceret apoptose især involverer den indre apoptotiske vej. (B) Leukæmi kræft cellelinier CEM [IC

50 /iM: Sio-0,73 (0,08); Thio-1,47 (0,1)], HL60 [IC

50 /uM: Sio-0,68 (0,06); Thio-1,78 (0,4)], og U937 [IC

50 /uM: Sio-0,53 (0,1); Thio-0,73 (0,3)], og leverkræft cellelinjer Hep-3B [IC

50 /iM: Sio-3,6 (1,3); Thio-2,3 (0,8)], Huh7 [IC

50 /iM: Sio-2,3 (0,5); Thio-1,8 (0,2)], og SK-Hep [IC

50 /uM: Sio-3,7 (0,4); Thio-6,0 (1,4)], viste følsomhed i lav mikromolære område til de thiazolderivater antibiotika som bestemt ved væksten inhiberingsassays. (C-D) Siomycin A og thiostrepton hæmmer FoxM1 udtryk og fremkalde potent apoptose i leukæmi og lever kræftceller.

For at kvantitativt vurdere graden af ​​følsomhed forskellige human cancer cellelinjer til thiazol- antibiotika Siomycin A og thiostrepton udførte vi vækst inhiberingsassays på forskellige leukæmi (CEM, HL60, U937) og lever (Hep-3B, Huh7, SK-Hep) cancerceller. Disse cancercellelinier blev behandlet med forskellige koncentrationer af antibiotika i 48 timer og omfanget af vækstinhibering blev bestemt ved at tælle antallet af levende celler (fig. 2B). Alle cellelinier viste IC

50’erne i det lave mikromolære område, hvilket antyder, at disse humane cancerceller er temmelig følsomme over for thiopeptider. Derudover har vi vurderet den apoptotiske respons på Siomycin A og thiostrepton i disse humane cancerceller ved immunoblotting for kløvet caspase-3. Vi fandt, at både Siomycin A og thiostrepton undertrykke FoxM1 proteinekspression, og inducerer apoptose i disse leukæmi og leverkræft celler (Fig. 2C, D). Disse data understøtter endvidere vores konklusion, at thiazol antibiotika ikke kun modvirke transaktiveringsfunktion evne FoxM1, men de hæmmer også dens udtryk på grund af FoxM1 positiv spiral [33]. Desuden observerede vi direkte sammenhæng mellem FoxM1 undertrykkelse og caspase-3 spaltning (kendetegnende for apoptose) efter behandling med disse forbindelser. Den tætte forbindelse mellem FoxM1 undertrykkelse og induktion af apoptose tyder på, at thiopeptider kan udøve deres proapoptotiske aktivitet i det mindste delvist gennem hæmning af FoxM1 i humane cancerceller.

For at undersøge potentielle rolle FoxM1 i thiopeptidet-medierede apoptose, behandlede vi U2OS osteosarcomceller med 10 uM Siomycin A og høstet cellerne på forskellige tidspunkter (fig. 3A). Vi fandt en betydelig nedgang i FoxM1 proteinekspression så tidligt som 18 timer, der var korreleret med fremkomsten af ​​robuste spaltede caspase-3 bands. Vi har også observeret korrelation mellem stærkere nedregulering af FoxM1 og mere intens apoptose efter 24 timers behandling med thiostrepton i nærværelse af den velkendte translationel inhibitor cyclohexamid (Chx) sammenlignet med individuel behandling med lægemidlerne, hvilket igen indikerer at suppression af FoxM1 kan være påkrævet for thiopeptidet-induceret apoptose (fig. 3B). For yderligere at undersøge den rolle, FoxM1 i thiopeptidet-medieret apoptose vi udnyttet C3-cellelinjen [25]. FoxM1 blev induceret ved tilsætning af doxycyclin og den følgende dag blev cellerne behandlet med thiostrepton og cyclohexamid i 24 timer (fig. 3C). Vi observerede, at ekspressionen af ​​endogene FoxM1 faldt i en tidsafhængig måde efter behandling, mens niveauerne af exogene FoxM1 ikke blev påvirket (fig. 3C). Vi fandt også, at overekspression af FoxM1 beskyttet mod celledød induceret af thiostrepton som detekteret ved immunoblotting for spaltet caspase-3 (fig. 3C). Disse data understøtter den opfattelse, at nedregulering af FoxM1 kan bidrage til thiopeptidet apoptose. Ligeledes fandt vi, at C3 celler, der overudtrykker FoxM1 var resistente over for behandling med Siomycin A som analyseret ved immunoblotting for spaltet caspase-3 (fig. 3D). Yderligere eksperimenter viste, at overekspression af FoxM1 beskytter også mod Siomycin A-induceret apoptose i nærvær af cyclohexamid (fig. 3E). Tilsammen alle disse data, at der kan kræves nedregulering af FoxM1 af Siomycin A og thiostrepton for thiopeptidet apoptose.

(A) Immunblotanalyse efter behandling med Siomycin A afslørede tæt sammenhæng mellem nedregulering af FoxM1 og induktion af apoptose. (B) Efter behandling med thiostrepton, thiopeptidet-induceret apoptose og hæmning af FoxM1 proteinekspression er mere fremtrædende i nærvær af cyclohexamid (Chx) som vist ved immunoblotting for FoxM1 og spaltes caspase-3. (C) Ekspression af endogene FoxM1 faldt i en tidsafhængig måde i nærvær af thiostrepton og Chx, mens niveauerne af exogene FoxM1 ikke blev påvirket. Overekspression af FoxM1 beskyttet mod celledød induceret af thiostrepton som detekteret ved immunoblotting for spaltet caspase-3. (D) FoxM1 overudtrykker celler var resistente over for behandling med stigende mængde Siomycin A som analyseret ved immunoblotting for spaltet caspase-3. (E) Immunblotanalyse viste, at overekspression af FoxM1 også beskyttet mod Siomycin A-induceret apoptose i nærværelse af Chx.

Discussion

Vi har tidligere rapporteret, at thiazol antibiotika Siomycin A [ ,,,0],25] og thiostrepton [29] inhibere FoxM1 og inducere apoptose i humane cancerceller. I denne undersøgelse har vi påvist, at de thiazolderivater antibiotika inhiberer FoxM1 transkriptionel aktivitet, de også nedregulerer FoxM1 ekspression og inducerer celledød i neuroblastom, leukæmi og lever cancerceller. Det er kendt, at de thiazolderivater antibiotika udfører deres antibakterielle aktivitet ved at inhibere bakteriel translation via interaktion med 23S ribosomalt RNA, men at de ikke blokerer eukaryot proteinsyntese [34]. Den præcise mekanisme for inhibering af FoxM1 transkriptionsaktivitet er endnu ikke klarlagt, men det er ikke relateret til deres evne til at inhibere proteinsyntese. Interessant, vi også fundet, at thiazol antibiotika undertrykke ikke kun den transkriptionelle aktivitet, men også ekspressionen af ​​FoxM1 (fig. 1, 2), hvilket antyder, at FoxM1 positivt kan regulere sin egen transkription [33].

Her vi fandt, at thiazol antibiotika-induceret apoptose i cancerceller af forskellig oprindelse blev korreleret med nedregulering af FoxM1 (fig. 2, 3). De thiopeptider hæmmede cellevækst med lignende IC

50 og celledød med sammenlignelige koncentrationer i så forskellige celletyper som neuroblastom, leukæmi og hepatoma (fig. 2). Da vi allerede rapporteret, at Siomycin A og thiostrepton mål FoxM1, hæmme cellevækst og inducere apoptose i melanom celler [29], disse data bekræfter endvidere, at thiazolderivater antibiotika kan påvirke en lang række humane cancerceller. Desuden viste vi, at overekspression af FoxM1 kunne beskytte kræftceller mod thiopeptid-medieret apoptose (fig. 3C, D, E). Da thiazol antibiotika undertrykke ekspressionen og aktiviteten af ​​FoxM1 og samtidig FoxM1 overekspression beskytter kræftceller fra Siomycin A og thiostrepton toksicitet, kan FoxM1 være en gyldig mål for thiazol antibiotika-induceret apoptose. For nylig, Kwok et. al. viste, at thiostrepton undertrykker FoxM1 ekspression og inducerer apoptose i brystcancerceller [35]. Disse data understøtter yderligere vores nuværende resultater og resultaterne fra vores tidligere publikationer, thiazol antibiotika, Siomycin A [25], og thiostrepton [29] inducere apoptose og undertrykke FoxM1 udtryk i humane cancerceller. Men denne gruppe ikke linke undertrykkelse af FoxM1 udtryk for hæmning af dens transkriptionsaktivitet af thiostrepton [35]. Desuden hævder de, at kun konstitutivt aktiv, men ikke vildtype FoxM1 kan hæmme thiostrepton antiproliferativ aktivitet [35]. er behov for yderligere forsøg for at løse disse forskelle.

Sammenfattende vi demonstreret, at thiazolderivater antibiotika Siomycin A og thiostrepton er potente hæmmere af FoxM1 transkriptionel aktivitet og udtryk. Derudover har de inducerer programmeret celledød i humane cancerceller med forskellig oprindelse. Graden af ​​apoptose induceret af thiopeptider korrelerer med undertrykkelse af FoxM1, mens overekspression af vildtype FoxM1 delvist beskyttede cancerceller fra thiopeptid-induceret apoptose. Disse data antyder, at inhibering af FoxM1 af Siomycin A og thiostrepton til en vis grad er ansvarlig for celledød induceret af thiazol- antibiotika. Forsøgene, der er beskrevet i dette manuskript støtte vores tidligere rapporter [25], [26], [27], [29], at FoxM1 er et passende mål for lægemidler mod cancer, og at thiazol antibiotika kunne repræsentere lovende alternativer til tiden brugt mod kræft behandlinger.

Materialer og metoder

Cellelinjer, medier og kemiske forbindelser

U2OS osteosarcomceller; C3-celler [22], en U2OS klon C3-cellelinie med doxycyclin-inducerbar FoxM1-GFP-fusionsproteinet; U2OS afledt C3-Luc2.3-FoxO1 osteosarkom, stabilt udtrykker doxycyclin-inducerbare FoxM1-GFP [25], den tamoxifen-inducerbare FoxO1 (AAA) -er fusionsproteinet og ildflueluciferase under kontrol af flere FoxM1 /FoxO1 responsive elementer; HCT116-p53RE-Luc colon, stabilt udtrykker ildflueluciferase under kontrol af en promotor med flere p53 responselementer (p53RE); A549 lung og Huh7, Hep3B og SK-Hep leverkræft cellelinier blev dyrket i DMEM-medium (Invitrogen). SW480 colon, caspase-8 mangelfuld og rekonstitueret NB7 neuroblastom (generøse gaver fra Dr. Jill M. Lahti, St. Jude Children Research Hospital, Memphis), CEM, HL60 og U937 leukæmi cancer cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen) . I alle tilfælde blev mediet suppleret med 10% føtalt bovint serum (Atlanta Biologicals) og 1% penicillin-streptomycin (GIBCO) og cellelinierne blev holdt ved 37 ° C i 5% CO

2. Thiazol antibiotika Siomycin A (NCI) og thiostrepton (Sigma) blev opløst i DMSO (dimethylsulfoxid), tamoxifen (Sigma) i ethanol, doxycyclin (Clontech) i PBS og cyclohexamid (Sigma) i DMSO.

Konstruktioner og transfektioner

Super8xTOPFlash og kontrol Super8xFOPFlash reporter plasmider var generøse gaver fra Dr. Randall T Moon (University of Washington, Seattle, WA). Den SRαGLI1 Ekspressionsplasmidet og GLI-BS-Luc, miniTK reporterkonstruktioner var venlige gaver fra Dr. David J. Robbins (Dartmouth Medical School, Hanover, NH). Forbigående transfektioner blev udført ved hjælp af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Immunblotanalyse

Kræftceller af forskellig oprindelse behandles som anført blev høstet og lyseret ved hjælp af IP-buffer ( 20 mM HEPES, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM Na4P2O7, 1 mM natrium othrovanadate, 0,2 mM PMSF tilsat proteaseinhibitortablet (Roche Applied Sciences)) . Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bio-Rad Protein Assay-reagens (Bio-Rad). Isolerede proteiner blev separeret på 8% eller 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membran (Millipore). Immunoblotting blev udført som beskrevet i 34, 35 med antistoffer specifikke for FoxM1 (en gave fra Dr. Costas lab), FoxA1 (en gave fra Dr. Costas lab), FoxO1 (Cell Signaling), FoxO3a (Upstate), kløvet caspase- 3 (cellesignalering) og β-actin (Sigma).

luciferaseassays

C3-Luc2.3-FoxO1 celler blev dyrket på plader med 6 brønde og behandlet natten over med kombinationen af ​​enten 1 ug /ml doxycyclin eller 300 nM tamoxifen og 3 uM Siomycin A eller thiostrepton. Også den HCT116-p53RE-Luc-cellelinien blev dyrket på plader med 6 brønde og behandlet med 3 uM Siomycin A eller thiostrepton i 16 timer. Endvidere SW480 coloncancercellelinie dyrket på plader med 6 brønde blev transient transficeret med TOPFlash og FOPFlash konstruktionerne. Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne behandlet med 3 uM Siomycin A eller thiostrepton. Den næste dag ildflueluciferase blev målt under anvendelse af Luciferase Assay System (Promega). Proteinkoncentrationen måles ved Bio-Rad Protein Assay-reagens (Bio-Rad) blev anvendt til normalisering. A549 lungekræft celler dyrket på plader med 6 brønde blev transient cotransficeret med enten GLI-afhængige GLIBS-Luc eller kontrol- miniTK reporterkonstruktioner, GLI ekspressionsplasmidet og pRL-null (Promega), der udtrykker Renilla luciferase. Celler blev behandlet med 3 uM Siomycin A eller thiostrepton 24 timer efter transfektion og luciferaseaktiviteten blev målt med Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) ifølge producentens instruktioner den følgende dag.

Tak

Dette håndskrift er dedikeret til mindet om Dr. Robert H. Costa. Vi vil gerne takke Dr. Randall Moon (University of Washington, Seattle) til TOPFlash og FOPFlash plasmider, Dr. David Robbins (Dartmouth Medical School, Hannover) for at levere de GLI effektor og reporter plasmider. Vi vil også gerne takke Dr. Jill M. Lahti (St. Jude Children Research Hospital, Memphis) for caspase-8 mangelfulde, og som rekonstitueres NB7 neuroblastom cellelinjer. Vi takker Dr. Angela Tyner (University of Illinois i Chicago, Chicago) og Dr. Senthil Radhakrishnan (Caltech, Pasadena) til aflæsning af manuskriptet og for deres værdifulde kommentarer. Vi takker også Dr. Nissim Hay (University of Illinois i Chicago, Chicago) for at levere de FoxO1 og FoxO3a antistoffer, og for hans nyttige forslag.