PLoS ONE: en potent Chemotherapeutic strategi med EG5 Inhibitor mod Gemcitabin Resistant Blære Cancer

Abstrakt

Udvikling af resistens mod gemcitabin er et stort problem i blærekræft terapi, og mekanismen er fortsat uklart. EG5 er for nylig blevet identificeret som et attraktivt mål i cancerkemoterapi, så nye målrettet kemoterapi med forventes EG5 inhibitor at forbedre anticancervirkning i gemcitabin-resistent blærecancer. I denne forskning, RT112-GR-celler blev 350 gange mindre følsom over for gemcitabin end de parentale cellelinier, mens KU7-GR-celler blev 15 gange mindre følsom for gemcitabin end de parentale cellelinier. Human OneArray Microarray analyse blev udført for at opnå bredspektret information om generne udtrykkes differentielt i RT112 og RT112-GR-celler. Den anti-proliferative aktivitet af S (MeO) TLC, en EG5 inhibitor, blev analyseret i RT112-Gr cellelinjer under anvendelse en celleviabilitetstest. Desuden blev den inhibitoriske virkning vurderes in vivo ved anvendelse subkutane xenograft tumor model. Ifølge resultatet af menneskelige OneArray® GeneChip, RRM1 og RRM2 blev opreguleret, mens der ikke var nogen signifikant ændring i EG5. Trypan blåfarvning bekræftede, at i S (MeO) TLC og Gemcitabin kombinere S (MeO) TLC gruppe cellelevedygtighed blev markant reduceret i RT112-GR-celler sammenlignet med andre grupper. S (MeO) TLC og S (MeO) TLC + gemcitabin grupper fremtrædende undertrykte tumorvækst i sammenligning med andre grupper «in vivo. Der var ingen signifikante forskelle i S (MeO) TLC og gemcitabin + S (MeO) TLC gruppe i effekten af ​​hæmning af blærekræft in vivo og in vitro. Vore data kollektivt vist, at S (MeO) TLC betegner en hidtil ukendt strategi til behandling af gemcitabin resistent blærecancer

Henvisning:. Sun L, Lu J, Niu Z, Ding K, Bi D, Liu S, et al. (2015) en potent Chemotherapeutic strategi med EG5 Inhibitor mod Gemcitabin Resistant blærekræft. PLoS ONE 10 (12): e0144484. doi: 10,1371 /journal.pone.0144484

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Columbia University, UNITED STATES

Modtaget: 16 oktober, 2014 Accepteret: November 19, 2015; Udgivet: December 10, 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Vi har uploadet data til ArrayExpress. Data anmeldelse URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.202.017) (https://www.nsfc.gov.cn), Natural Science Foundation i Shandong-provinsen (nr ZR2011HQ027 og nr ZR2014HQ041) (https://www.sdnsf.gov.cn), og Videnskab og Teknologi Research Foundation i Shandong-provinsen (nr 2012YD18049) (https://www.sdnsf.gov.cn). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Blærekræft (BCA) repræsenterer den fjerde mest almindelige kræftform i USA [1,2]. Ca. 25% af blærecancerpatienter er diagnosticeret med muskel-invasiv blærekræft (MIBC), selv om 75% af nydiagnosticerede tumorer er ikke-muskel invasive (Ta, Tis, og T1); de fleste af dem gentage sig og 15-20% fremskridt at invadere tunica muscularis. Og langt størstedelen af ​​cancerspecifikke dødsfald skyldes MIBC, hvilket fører til lokal invasion og fjernmetastase [3, 4]. Dødeligheden af ​​sygdommen opfordrer urologer til at udforske nye metoder til at behandle blærekræft [5]. Kemoterapi med gemcitabin og cisplatin er det mest populære valg for blærekræft. Gemcitabin er en analog af deoxycytidin med høj aktivitet mod mange typer af faste tumorer, herunder pancreas, cervical, ovarie-, bryst-, blære-, og ikke-småcellet lungekræft [6,7]. Men udviklingen af ​​resistens over for gemcitabin er nu en stor bekymring for urologer. På trods af en rimelig svarprocent efter indledende kemoterapi i patienter med metastatisk blærekræft, 60-70% af responderende patienter tilbagefald inden for det første år, med en median overlevelse på 12-14 måneder. Denne begrænsede effekt kan skyldes de novo resistens lægemiddel og udviklingen af ​​cellulær lægemiddel-resistente fænotype under behandlingen [8].

Men de underliggende mekanismer til induktion kemoterapi resistens ved Gemcitabin fortsat ukendt. For nylig, gennem studiet af pancreascancer, Nakahira S et al rapporterede en vigtig faktor i gemcitabin modstand var overekspression af ribonukleotidreduktase (RR) [9]. RR består af dimeriserede store og små underenheder, M1 og M2, henholdsvis. M1 underenheden besidder et bindingssted for enzym regulering (regulatoriske underenhed), og M2-underenheden er involveret med RR-aktivitet (katalytisk underenhed) [10]. RRM1 formodes at spille en rolle i gemcitabin modstand af forskellige kræft som metaboliske enzymer af lægemidlet [9, 11]. RRM1 er ikke kun et cellulært mål for gemcitabin, men også en tumorsuppressor. Prækliniske undersøgelser har vist sit engagement i undertrykkelsen af ​​kræft celledeling, migration, og metastase [12, 13]. I nogle kræftformer, et højt niveau af RRM2 mRNA korrelerer med kemoterapeutisk modstand, cellulær invasionsevne og utilfredsstillet prognose, hvilket antyder, at RRM2 bidrager til malign progression og er et potentielt terapeutisk mål. Men der er begrænset information om RRM1 og RRM2 proteinekspression i blærekræft, og så vidt vides findes ingen rapporter, der beskriver RRM i processen af ​​lægemiddelresistens i blærekræft. Desuden har nogle nylige undersøgelser vist, at RRM spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​humane carcinomer, men den kliniske betydning af RRM udtryk i BCA fortsat uklart.

På den anden side er det af stor betydning at undersøge hidtil ukendte blærekræft kemoterapeutisk strategi. Målrettede lægemidler til behandling af urinvejsinfektioner tumorer i de seneste år har vist lovende resultater. Vore tidlige undersøgelser har vist, at EG5 inhibitorer som målrettede lægemidler in vivo og in vitro behandling af prostatacancer og blærecancer bør have tilfredsstillende helbredende virkninger [14, 15]. EG5, et centralt molekyle involveret i dannelsen af ​​bipolære spindler, er en af ​​de mest attraktive mål-enzymer i antimitotiske lægemiddelforskning [16]. EG5 regnskab for mange af de bevægelser spindlen og kromosomer i delende celler og lokaliserer til spindlen i mitotiske delende celler [17]. Et interessant træk ved EG5 er, at det lokaliseres til mikrotubuli i mitose, men ikke at interfase mikrotubuli, hvilket antyder, at en EG5 inhibitor kan være nyttig til specifikt at målrette prolifererende tumorvæv [18]. Der er rapporteret flere kemiske typer af småmolekylære EG5 inhibitorer [16]. S- (4-methoxytrityl) -L-cystein (S (MeO) TLC), et derivat af S-trityl- L-cystein (STLC), kan specifikt inhiberer EG5, og inducere monopolær mitosespindelen dannelse [14, 15]. Svigt i EG5 funktion fører til cellecyklus arrest i mitose med monoastral mikrotubuli arrays. Den vigtige rolle EG5 i mitotisk progression gør det til en attraktiv kandidat for at udvikle målrettede terapi i kræft [19]. Der er imidlertid ingen undersøgelse af EG5 inhibitor behandling af gemcitabin resistent blærekræft.

I denne undersøgelse en gemcitabin-resistent human blærecancer-cellelinie blev etableret, og den rolle, RRM1 og RRM2 i udviklingen af ​​gemcitabin modstand blev oprindelig undersøgt. Vi vurderede også effekten af ​​anticancer effekt af EG5 målrettet terapi in vitro og in vivo, har til formål at tilbyde en bedre strategi klinisk behandling til patienter med gemcitabin resistente blærekræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg af Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University (Permit nummer: 2013-026). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Blærekræft væv blev indsamlet fra Shandong Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University. Før undersøgelsen blev protokollen godkendt af den etiske komité for Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University (Permit nummer: 2012-033). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Celler, reagenser og kliniske prøver

Blærekræft cellelinie RT112 og KU7 blev anvendt i denne undersøgelse og dyrket som tidligere [14,20] beskrevet. RT112 og KU7 cellelinjer blev indkøbt fra celle bank af kinesiske Academy of Science (Shanghai, Kina). RT112 og KU7 celler blev hovedsagelig anvendes i følgende undersøgelse, der stammer fra ikke-invasiv blærekræft. Cellerne blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin /streptomycin og inkuberet ved 37 ° C med en fugtig 5% CO

2 atmosfære. Salg

EG5 inhibitorer, S (MeO) TLC blev indkøbt fra Bachem (Bubendorf, Schweiz) og blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO). Antistof anti-RRM1 og anti-RRM2 (Rabbit) blev indkøbt fra Abcam (USA); IRDye 800CW konjugeret gede anti-kanin IgG var fra Li-Cor Biosciences (USA). Prime Script RT-PCR-kit blev indkøbt fra TaKaRa (Kina). TRIzol blev købt fra Invitrogen (USA).

140 tilfælde af blærekræft væv blev indsamlet fra Shandong Provincial Hospital Tilknyttet til Shandong University fra December 2005 til marts 2007. Strålebehandling, kemoterapi og immunterapi blev ikke foretaget før operationen og alle prøver blev verificeret ved to patologier efter operationen.

Etablering af gemcitabin-resistente cellelinier

gemcitabin resistente celler blev udviklet af kronisk, gentagen eksponering for gemcitabin selvom gradient kultur. Den etablerede resistent cellelinje blev opretholdt i medium indeholdende 45 nmol /l af gemcitabin. For alle undersøgelser, resistente celler blev dyrket i medikamentfrit medium i 1 uge for at eliminere gemcitabin. Gemcitabin-resistente celler betegnes som RT112-GR-celler og KU7-Gr. IC50 af gemcitabin-resistente RT112 celler til Gemcitabin er 4.2umol /L. IC50 af gemcitabin-resistente KU7 celler til Gemcitabin er 0.285umol /L. Så vi vælger RT112-Gr celler som et emne i de følgende forsøg.

Menneskelig OneArray Microarray

Totalt RNA blev ekstraheret ved Trizol reagens (Invitrogen, Shanghai, CN) og sendes til falanks Biotech Group (Shanghai, CN) til udtryk microarray analyse. Tredobbelte hybridiseringer for hver prøve blev udført ved hjælp af menneskelige Whole-genom OneArray 6.1.

RRM1 og RRM2 udtryk analyse af IHC

immunhistokemisk analyse blev udført for at analysere RRM1 og RRM2 udtryk i blærekræft, som tidligere beskrevet [21]. Anti-RRM1 og anti-RRM2 antistoffer blev begge anvendt i en fortynding på 1: 100. Negative kontroller bestod af objektglas, hvor det primære antistof var udeladt. Tilfælde blev evalueret som havende positiv farvning hvis 10% af cytoplasmaet af tumorcellerne var plettet. Tumorklassificering og fase blev evalueret ved anvendelse af standard hematoxylin og eosin (H RRM1 (391bp) primere var: Fremad: 5′-GTTGTATTCGGGCTACTGG-3′, omvendt: 5′-ACTTTGCGGACACGACCT-3′; RRM2 (882bp) primere var: Fremad: 5′-GCCGCTTTGTCATCTTCC-3′, omvendt: 5′-TCCTCTGATACTCGCCTACT-3′. PCR-produkter blev derefter elektroforeret i 1,0% agarosegel og visualiseret ved en transilluminator. Pixel intensitet for hvert bånd blev bestemt ved anvendelse af AlphaImager

TM2200.

Animal eksperiment

Seks til otte uger gamle BALB /c nøgne mus blev købt fra Vital River Company (Beijing, Kina). Undersøgelsen blev opnået godkendelse fra Udvalget om Animal Research Shandong Provincial Hospital of Shandong University og vores omsorg var i overensstemmelse med institutionens retningslinjer.

For subkutane xenograftmodeller, ca. 4 × 10

6 RT112-Gr celler (suspenderet i 100 pi PBS) blev inokuleret subkutant i begge flanker per mus, som tidligere [23] beskrevne. Tumoren volumen blev beregnet som følger: volumen = Bredde

2 × Længde /2. Når tumorer var palpable og målbare (ca. 50mm

3), blev 20 mus tilfældigt opdelt i fire grupper og behandlet en gang dagligt (fem dage om ugen) ved intraperitoneal injektion med DMSO (vehikelkontrol), 20 mg /kg S (MeO ) TLC, 50 mg /kg gemcitabin eller 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg gemcitabin i 5 dage. Mus krop vejer og tumorstørrelser blev målt hver anden dag. De andre mus blev aflivet på den 21. dag efter den indledende behandling, og tumorer blev også skåret ud og paraffin-indlejret for H . E farvning

Statistisk analyse

Betydningen af ​​forholdet mellem RRM1 og RRM2 udtryk og klinisk-patologiske parametre blev evalueret ved hjælp af chi-squared test og to-vejs ANOVA. Midler blev sammenlignet ved anvendelse af en to-halet studerendes

t

test og den inhibitoriske aktivitet af S (MeO) TLC og gemcitabin på xenograftmodeller blev udført med en to-vejs ANOVA efterfulgt af S-N-K-test. SPSS 17.0 software blev anvendt som statistisk analyse.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Global genekspression analyse i RT112 og RT112-Gr cellelinjer

RT112-Gr celler 350 gange mindre følsom over for gemcitabin end forældrenes cellelinjer, som IC50 var 4,2 pmol /l i det tidligere. KU7-GR-celler blev 15 gange mindre følsom for gemcitabin end de parentale cellelinier, som IC50 var 0.285umol /li tidligere. Microarray analyse blev udført for at opnå bredspektret information om generne udtrykkes differentielt i RT112 og RT112-GR-celler. De opnåede fra RT112 og RT112-Gr celler RNA’er blev forstærket, fragmenteret, mærket, og hybridiseret til GeneChip microarrays. Af de 55752 generne repræsenteret i menneskelige OneArray® GeneChip, 442 viste signifikant opreguleret og 235 nedreguleres. Blandt dem, P-værdi (differentielt udtrykte) af RRM1 er 0,046, og RRM2 er 0,021, mens EG5 (KIF11) er 0,323. Vores microarray resultater med succes er blevet indlæst i et offentligt arkiv med navnet ‘ArrayExpress «, Data anmeldelse URL:. https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-3495/

Clustering blev udført for at visualisere korrelationerne blandt replikater og varierende prøvebetingelser. En undergruppe af differentierede gener blev udvalgt til clustering analyse. En intensitet filter blev anvendt til at vælge gener, hvor forskellen mellem de maksimale og minimale værdier intensitet overstiger 1000 blandt alle microarrays. Til dette mikroarray projekt, antallet af gener grupperet var 227 (figur 1).

Gruppering blev udført for at visualisere sammenhænge mellem replikater samt varierende prøvebetingelser. Op- og ned-regulerede gener er repræsenteret i røde og grønne farver, hhv. En undergruppe af differentierede gener blev udvalgt til clustering analyse. En intensitet filter blev anvendt til at vælge gener, hvor forskellen mellem de maksimale og minimale værdier intensitet overstiger 1000 blandt alle microarrays. Til denne microarray projekt, antallet af gener grupperet var 227.

RRM1 og RRM2 ekspressionsanalyse i blærekræft væv og cellelinjer

immunhistokemisk analyse blev udført for at analysere RRM1 og RRM2 udtryk i kirurgisk resektion eksemplarer af blærekræft. RRM1 og RRM2 farvning blev lokaliseret i cytoplasmaet. Der var 98 mænd og 42 kvinder, med 65 lav kvalitet tilfælde og 75 high-grade sager i histologisk klasse. Farvningen reaktivitet af anti-RRM1 og anti-RRM2 blev viste i tabel 1 og figur 2, henholdsvis. RT-PCR-analyse blev afbildet for at identificere RRM1 mRNA og RRM2 mRNA-ekspression i RT112 og RT112-Gr cellelinier. RT-PCR endvidere vist, at RT112-Gr celler havde betydelige stigninger i niveauerne af RRM1 og RRM2 mRNA sammenlignet med de parentale celler (

s

0,001)., (Fig 3)

A: immunhistokemisk farvning af RRM1 og RRM2 i kliniske væv. RRM1 og RRM2 immunfarvning blev anset for positiv, hvis 10% af cytoplasmaet af cancerceller udviste svag eller større intensitet. (I) Høj ekspression af RRM1 i klinisk blærekræft. (II) Lav ekspression af RRM1 i klinisk blærekræft (III) Høj ekspression af RRM2 i klinisk blærekræft. (Ⅳ) Lav udtryk for RRM2 i klinisk blærekræft (alle tal blev taget til fange ved 400 × forstørrelse). B: (I) Søjlediagram illustrerer kombineret immunfarvning score for RRM1 udtryk efter tumor klasse. (II) Søjlediagram illustrerer kombineret immunfarvning score for RRM2 udtryk efter tumor stadie (farve sort og grå repræsenterer svagt og stærkt positive, henholdsvis).

RT-PCR for RRM1 og RRM2 mRNA-ekspression i blære cancer cellelinjer. GAPDH tjente som lastning kontrol. Bar graf illustrerer RRM1 og RRM2 mRNA-ekspression i RT112, RT112-Gr og siRNA-RT112-Gr blærekræft cellelinjer. (

s

0,001).

siRNA-medieret Knockdown af RRM1 /2 i RT112-Gr blære cancerceller

For at vurdere virkningerne af RRM1 /2 på RT112-Gr blærecancer cellelinjer, RRM1 /2-genet var Knockdown henholdsvis (figur 3). RT112-Gr celler blev efterladt ubehandlet eller blev behandlet med 45 nm Gemcitabin (GEM), RNAi-medieret Knockdown af RRM1 og RRM2 i RT112-Gr blære cancerceller blev efterladt ubehandlet eller blev behandlet med 45 nm Gemcitabin (GEM). Tooghalvfjerds timer senere levedygtighed blev analyseret ved Trypan blåfarvning. RNAi-medieret Knockdown af RRM1 og RRM2 + GEM, hæmme tumor effekt er den bedste blandt de fire grupper. Kvantificering af hver værdi er fra tredobbelte uafhængige eksperimenter (fig 4).

RT112-GR-celler blev efterladt ubehandlet eller blev behandlet med 45 nm Gemcitabin (GEM), RNAi-medieret Knockdown af RRM1 (A) og RRM2 (B ) i RT112-Gr blære cancerceller blev efterladt ubehandlet eller blev behandlet med 45 nm Gemcitabin (GEM). Tooghalvfjerds timer senere levedygtighed blev analyseret ved Trypan blåfarvning. RNAi-medieret Knockdown af RRM1 (A) og RRM2 (B) + GEM, hæmme tumor effekt er den bedste blandt de fire grupper. Kvantificering af hver værdi er fra tredobbelte uafhængige forsøg. (

s

0,01).

Antiproliferative virkninger af S (MeO) TLC og gemcitabin på gemcitabin Resistant blære cancer cellelinjer

For at vurdere anti -proliferative virkninger af gemcitabin og S (MeO) TLC på blærekræft cellelinjer RT112-Gr, blev de efterladt ubehandlet eller behandlet med 45nm gemcitabin, 0,5 uM S (MeO) TLC eller begge sammen (gemcitabin + S (MeO) TLC) i 24 timer, 48 timer og 72 timer. Gemcitabin og S (MeO) TLC undertrykt cellevækst i en tidsafhængig måde og vises den mest fremtrædende undertrykkelse karakter i de 72 timer. De IC50’er af RT112 og RT112-Gr mod gemcitabin i 72 timer var 0.012μM og 4.2μM, mens IC50’er af RT112 og RT112-Gr mod S (MeO) TLC var 210μM og 290μM henholdsvis (figur 5).

A: IC50’er af gemcitabin i KU7, KU7-Gr, RT112 og RT112-Gr i 72 timer. B: De IC50’er af S (MeO) TLC af KU7, KU7-Gr, RT112 og RT112-Gr i 72 timer. C: KU7-Gr og RT112-Gr celler blev efterladt ubehandlet eller blev behandlet med 45 nm Gemcitabin (GEM), 0,5 uM S (MeO) TLC eller begge sammen (GEM + S (MeO) TLC). Tooghalvfjerds timer senere levedygtighed blev analyseret ved Trypan blåfarvning. S (MeO) TLC og GEM + S (MeO) TLC, hæmme tumor effekt er den bedste blandt de fire gruppe. Kvantificering af hver værdi er fra tredobbelte uafhængige forsøg. (

s

0,01).

Induktion af apoptose med S (MeO) TLC og Gemcitabin i gemcitabin Resistant blære cancer cellelinjer

Hoechst 33342 nukleare farvning viste, at typiske monopolære spindel mitotiske celler med en karakteristisk roset-lignende fænotype blev observeret i mitotiske fase ved 24 timer efter udsættelse for 45nm gemcitabin, 0,5 uM S (MeO) TLC, 45nm gemcitabin + 0,5 uM S (MeO) TLC eller køretøj og karakteristiske apoptotiske celler med nukleare kondens og fragmentering blev også identificeret ved 48 timer efter eksponering (figur 6)

A:. RT112-Gr celler ubehandlet; B: RT112-GR-celler blev behandlet med 45 nm Gemcitabin; C: RT112-GR-celler blev behandlet med 0,5 pM S (MeO) TLC; D:. RT112-Gr celler blev behandlet med både sammen (45 nm Gemcitabin + 0,5 uM S (MeO) TLC) for de angivne tidspunkter og derefter nukleare morfologi blev undersøgt med Hoechst farvning og visualiseres ved fluorescerende mikroskopi

Trypan blåfarvning bekræftede, at i gemcitabin + S (MeO) TLC-gruppe og gruppe cellelevedygtighed S (MeO) TLC blev signifikant reduceret i RT112-Gr og KU7-GR-celler i sammenligning med kontrolgruppen (figur 5).

Virkninger af S (MeO) TLC og gemcitabin i blærekræft xenograft model

for den indledende analyse af anticancer aktivitet af S (MeO) TLC i subkutane xenograftmodeller, tumor volumen blev evalueret efter behandling med DMSO (vehikelkontrol), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg gemcitabin eller 20 mg /kg S (MeO) TLC + 50 mg /kg gemcitabin. Efter 3 ugers observation blev det konstateret, at S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemcitabin (50 mg /kg) og S (MeO) TLC (20 mg /kg) grupper fremtrædende undertrykt tumorvækst i sammenligning med gemcitabin (50 mg /kg ) og DMSO (køretøj kontrol). Organ vægttab blev ikke observeret i nogen af ​​behandlingsgrupperne. Nekrose blev observeret på tumoren overflade af S (MeO) TLC (20 mg /kg) og S (MeO) TLC (20 mg /kg) + gemcitabin (50 mg /kg) behandlingsgruppen, om end der var ingen indlysende nekrose i kontrolgruppen . ændringer af musene tumorvolumen blev sammenlignet mellem behandlings- og kontrolgrupper, forskellen i middelværdien endelige tumorvolumen blandt de fire grupper var statistisk signifikant (figur 7).

A. Efter vellykket oprettelse af subkutane xenotransplantattumorer, DMSO (vehikelkontrol), 20 mg /kg S (MeO) TLC, 50 mg /kg gemcitabin eller begge (S (MeO) TLC + GEM) blev administreret intraperitonealt dagligt i 5 dage (pile) . Tumorvolumener blev målt hver anden dag. B. gennemsnitlige kropsvægte for mus blev vurderet hver anden dag. Der er ingen signifikant forskel mellem tre grupper (

P

0,05).

Diskussion

kemoresistens er en væsentlig årsag til svigt i behandling for blærekræft med gemcitabin. Derfor er det ekstremt vigtigt at klarlægge mekanismen for kemoresistens og identificere prædiktive markører for iboende og erhvervet kemoresistens til gemcitabin [24]. Ribonukleotidreduktase (RR) er en heterotetramer, og aktivitet kræver to 90 kDa store underenheder og to 45 kDa små underenheder. Enzymet er afgørende for levering af deoxynucleosid til de novo syntese af DNA og så for celleproliferation. Den består af de dimeriserede store og små underenheder, M1 og M2. RRM1 er en stor peptidkæde (α), mens RRM2 er en lille protein-subunits af RR (β). Selvom den enzymatiske aktivitet af RR moduleres af niveauer af RRM2 kunne RRM1 spille en nøglerolle blandt de 2 underenheder i løbet af gemcitabin [9, 13]. Rolle RRM1 i RR dannelse har også gjort det til et attraktivt molekylære mål for udviklingen af ​​kemoterapeutiske midler, såsom gemcitabin [13].

Genekspression profilering af microarray analyse giver et stærkt middel til at få overblik over genekspression og fysiologiske processer involveret i reaktioner på bestemte stimuli. I den aktuelle undersøgelse, vi etableret gemcitabin-resistente humane blærecancer cellelinjer RT112-GR og KU7-GR, RT112-GR-celler blev 350 gange mindre følsom over for gemcitabin end de parentale cellelinier, mens KU7-GR-celler blev 15-fold mindre følsom over for gemcitabin end de parentale cellelinier. Så vi vælger RT112-Gr celler som et emne i de følgende forsøg. microarray-analyse blev anvendt til at undersøge genekspression ændringer mellem RT112 og RT112-GR-celler. Vores resultater viser, at 442-gener, herunder RRM1 og RRM2, blev opreguleret, mens 235 gener nedreguleret i RT112-GR-celler. EG5 ændring var ikke indlysende. Vores nuværende undersøgelse viser, at RRM1 og RRM2 er involveret i gemcitabin modstand i human blærekræft. I cellen, gemcitabin er phosphoryleres til monophosphat, diphosphat eller trifosfat før dens inkorporering i DNA, som er nødvendig for dens vækst hæmmende aktivitet. Den diphosphorylated form for gemcitabin virker som en RR-inhibitor, som er årsag til gemcitabin cytotoksisk aktivitet. RR forøger deoxynucleosidtriphosphat (dNTP) pulje i cellerne, hvilket kunne føre til nedsat inkorporering af dNTP-analoger såsom triphosphoryleret gemcitabin i DNA og kan reducere antitumorvirkningen af ​​gemcitabin [9]. En række af prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at RRM1 kunne være målrettet molekyle til at regulere gemcitabin modstand. Endvidere kunne dens ekspressionsniveauer være en nyttig indikator for gemcitabin modstand. Shin Nakahira et al rapporterede, at øget RRM1 ekspression blev signifikant associeret med antitumorvirkninger og med ringe overlevelse efter behandling med gemcitabin i pancreas kræftpatienter [9]. Hao Xie et al rapporterede, at efter kirurgisk resektion i pancreas adenocarcinom, for at opnå den bedste overlevelse, kan niveauet af RRM1 ekspression anvendes til at stratificere patienterne at modtage enten adjuvans gemcitabin eller ikke-gemcitabin adjuverende behandling. Dette er i overensstemmelse med resultaterne fra tidlige stadium NSCLC undersøgelser [13], og denne implikation støttes af den rolle, som RRM1 som tumorsuppressor [12]. Desuden er RRM2 kendt for at være involveret i kemoresistens. Undertrykkelse af RRM2 kunne bevidstgøre kolon og bugspytkirtlen kræftceller til kemoterapeutiske midler [25]. Forholdet mellem RRM2 ekspression og kemoterapeutisk virkning i kliniske prøver er også blevet undersøgt. Itoi et al undersøgte RRM2 mRNA-niveauer i biopsi prøver fra 35 patienter med inoperabel kræft i bugspytkirtlen i et prospektivt studie, og fandt, at svarprocenten på gemcitabin kemoterapi var signifikant højere hos patienter med lavt RRM2 udtryk [26]. Ingen af ​​de tidligere undersøgelser har undersøgt ekspressionen af ​​RRM i blærekræft.

Vores undersøgelse viste, at RRM1 og RRM2 blev udtrykt i kliniske blærekræft væv og blære cancercellelinier. Det angives, at ekspressionen af ​​RRM1 og RRM2 var signifikant højere i lav kvalitet tumorer end high-grade tumorer. Vore data antydede, at RRM1 og RRM2 overekspression kan være forbundet med udviklingen af ​​blærekræft. I blære cancer cellelinjer, demonstrerede RT-PCR resultater, RT112-Gr celler signifikant var steget i niveauerne af RRM1 og RRM2 mRNA sammenlignet med de parentale celler (

s

0,001) henholdsvis. For at vurdere virkningerne af RRM1 /2 om RT112-Gr blærekræft cellelinjer blev RRM1 /2-genet knockdown. Vores undersøgelse viste, at efter knockdown af RRM1 /2 blev RT112-Gr blærekræft cellelinjer følsomme over for gemcitabin igen, med angivelse af overekspression af RRM forbundet med gemcitabin modstand, og kan være en ny kandidat biomarkør for gemcitabin modstand. Data fra talrige kliniske studier viste, at RRM1 /2-ekspression i tumorceller er omvendt korreleret til følsomheden af ​​tumorcellerne til gemcitabinbehandling [9, 11, 12]. For eksempel Woon-Gye Chung et al rapporterede, at den forøgede RRM1 ekspression var sandsynligvis ansvarlig for resistens mod gemcitabin i TC-1-GR (gemcitabin modstand TC-1) celler, der blev yderligere understøttet af den observation, at transfektion af RRM1 siRNA i TC-1-celler GR gjort cellerne mere følsomme over for gemcitabin HCI [27]. Zhang M et al rapporterede, at små interfererende RNA-medieret RRM2 knockdown vendte markant SKOV3 /DDP celle modstand mod cisplatin [28].

Beviser viste, at patienter med gemcitabin modstand ville stå over for en dårligere resultat. Derfor er behandlingen af ​​gemcitabin modstand blærekræft er meget vigtig. Stigende studier viste et bedre resultat ved hjælp terapi målrettet i behandling af blærekræft. Vores tidlige undersøgelse viste EG5 hæmmere som målrettede lægemidler in vivo og in vitro behandling af blærekræft kan have god helbredende virkning, desuden vi oprindeligt demonstreret anticancer effekt af EG5 inhibitor på gemcitabin modstand blærekræft i nærværende dokument.

EG5 er en homotetramer motor dannet af antiparallelle arrangement af to dimerer. Den EG5 tetramer har evnen til at tværbinde antiparallelle mikrotubuli udspring i to centrosomer ved G2 /M [29]. Den primære funktion af EG5 er at danne den bipolære spindel under tidlig prometafasen; manglende adskille duplikerede centrosomer fører til mitosestandsning og i sidste ende udløser apoptotisk celledød i visse tumorcellelinier [30, 31].