PLoS ONE: BCG-medieret Blære Cancerimmunterapi: Identificering Determinanter for behandlingsrespons med en kalibreret Matematisk Model

Abstrakt

Intravesikal Bacillus Calmette Guérin (BCG) immunterapi betragtes som den standard for pleje af behandling af ikke-muskel invasiv blærekræft; men de behandlingsparametre blev fastsat empirisk. For at vurdere potentialet optimering af kliniske parametre af BCG induktion terapi, konstruerede vi og forespørges en ny matematisk model. Specifikt vurderede vi konsekvenserne af (1) varighed mellem resektion og den første inddrypning; (2) BCG dosis; (3) indlagte tid; og (4) behandling interval på induktion terapi – ved hjælp af kur sats som det primære endpoint. Baseret på tilgængelige kliniske og

in vitro

eksperimentelle data, vi konstrueret og parametreres en stokastisk matematisk model, der beskriver samspillet mellem BCG, immunsystemet, de blære mucosa og tumorceller. Det primære endpoint i modellen var sandsynligheden for tumor uddø efter BCG induktionsbehandling hos patienter med høj risiko for tumor tilbagefald. Vi teoretisk vise, at forlænge varigheden mellem resektion og første BCG instillation negativt påvirker behandlingsresultater. Simuleringer af højere BCG doser og længere indlagte gange både forbedrede sandsynligheden for tumor udryddelse. En bemærkelsesværdig opdagelse var, at en inter-instillationsperioder interval to gange længere end de syv-dages interval anvendes i den nuværende standard for pleje i væsentlig grad ville forbedre behandlingsresultater. Vi giver indsigt i relevante kliniske spørgsmål ved hjælp en ny matematisk model af BCG immunterapi. Vores model forudsiger en ændret regime, der kan nedsætte bivirkninger af behandlingen og samtidig forbedre respons på behandlingen

Henvisning:. Rentsch CA, Biot C, Gsponer JR, Bachmann A, Albert ML, Breban R (2013) BCG-medieret Blære Cancer Immunterapi: Identificering determinanter for behandlingsrespons med en kalibreret matematisk model. PLoS ONE 8 (2): e56327. doi: 10,1371 /journal.pone.0056327

Redaktør: David J. Klinke, West Virginia University, USA

Modtaget: September 23, 2012; Accepteret: 8. januar 2013; Publiceret: 25 feb 2013

Copyright: © 2013 Rentsch et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte : Dette arbejde blev støttet af La Ligue Contre le Cancer og associeringsaftalen pour la Recherche sur le Cancer. CAR anerkender støtte fra den schweiziske National Foundation. Udtalelserne og udsagn i denne artikel er forfatternes og repræsenterer ikke den officielle politik, påtegning, eller udsigt over Institute Pasteur. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Adjuverende behandling af ikke-muskel invasiv blærekræft (NMIBC) ved hjælp af intravesikal Bacillus Calmette-Guérin (BCG) efter transuretral resektion blev etableret empirisk næsten 40 år siden [1]. Mens BCG behandling fortsat standarden for pleje, er kritiske parametre, der påvirker behandlingsresultater stadig dårligt forstået. I en tidligere undersøgelse konstruerede vi en matematisk model, der blev kalibreret til tilgængelige kliniske data til at evaluere evnen hos det medfødte immunsystem, da princippet effektor arm ansvarlig for respons på terapi. Vi viste, at effektorfunktion af det medfødte immunrespons er ikke potent nok til at give de hærdningshastigheder observeret i klinisk praksis [2]. Vi konkluderede derfor, at komponenter af det adaptive immunsystem skal spille en kritisk rolle i tumor elimination. Adaptive immune effektorceller (fx T-lymfocytter) er forskellige fra de fleste medfødte udfylder da de er langlivet, besidder egenskaber antigenspecificitet og immunologisk hukommelse, med mulighed for at interagere med flere målceller løbet af en enkelt runde af aktivering. Skøn baseret på eksperimentelle data antyder, at en enkelt cytolytisk T-lymfocyt har potentialet til at dræbe ti målceller før det kræver genaktivering af en antigen-præsenterende celle [3]. Desuden kan eksistensen af ​​en hukommelse pulje af antigenspecifikke T-celler muliggør en mere robust adaptive immuneffektorcelle respons ved sekundær senere eksponering for BCG.

Brug en raffineret matematisk model, der inkluderer de adaptive effektorfunktioner af immunsystem, vi fat flere kliniske parametre for at lære om deres virkning for en optimal protokol vellykket BCG immunterapi. Konkret har vi integreret tilgængelige kliniske og

in vitro

eksperimentelle data til at konstruere og parametrisere en ny stokastisk matematisk model, der beskriver samspillet mellem BCG, immunsystemet, og tumorceller med det primære endpoint er sandsynligheden for tumor udryddelse. Vi har ikke tilstræbe præcise kvantitative resultater, men snarere for en robust kvalitativ forståelse, der ville være gyldig i fremtidige modeller, der kunne integrere stigende niveauer af detaljer. Heri vurderede vi konsekvenserne af: (1) at variere tiden fra resektion til BCG-instillation, (2) modulering af BCG dosis anvendes under intravesikal instillation, (3) den iboende tidspunktet for BCG, og (4) den inter-instillation interval .

Selv om alle parametre påvirket behandlingsresultat, vedrørte den mest overraskende resultat af virkningen af ​​den inter-instillation interval, hvor simuleringer foreslog, at et interval to gange længere end de syv-dages interval anvendes i den nuværende standard for pleje, ville en væsentlig forbedring behandlingsresultater. Vores undersøgelse giver nyttig indsigt og testbare hypoteser, der kunne føre til bedre forvaltning i NMIBC.

Materialer og metoder

Vores matematisk model gør antagelser om samspillet udløst af BCG instillationer og simulerer dynamikken i befolkningerne af celler. Inden initiering af BCG-behandling, tre cellepopulationer er til stede: sunde urotelial væv, tumor og medfødte immunceller. Samspillet mellem disse cellepopulationer er ubetydelige. De processer, der finder sted for hver af disse cellepopulationer før behandlingen er celle migration og /eller lokale spredning og dødsfald (figur 1 og S1 for skematisk, og Figur S2 til simulering af tumorvækst). Af note, aktiveret adaptive immunceller (fx antigenspecifikke T-celler) ikke er til stede før BCG-terapi, som henlægges kræver priming. Under BCG instillationer, levende BCG er i stand til aktivt at interagere med celler, mens døde BCG kan internaliseres af celler; vi refererer til BCG som at blive “celleassocieret” til at betegne en af ​​disse to muligheder. Som følge af association med BCG, dukker fire nye cellepopulationer, der er forbundet af dynamiske interaktioner til de tidligere tilstedeværende cellepopulationer i blæren: (1) BCG-associerede urothelial celler, (2) BCG-associerede tumorceller, (3) aktiverede medfødte immunceller og (4) aktiveret adaptive immunceller. BCG associates til sunde urothelial celler og tumorceller, og som igen udløser øget migration og aktivering af medfødte immunceller ind i blæren. Medfødte immuneffektorceller målrette BCG associeret urothelial og tumorceller, ødelægge dem samt deres tilstødende sunde slimhinde og ikke-inficerede tumorceller [2]. Den gentagne og boostet betændelse udløser priming og eventuel rekruttering af adaptive immuneffektorceller. Celler af det adaptive immunsystem kan være specifik for BCG-antigen, således målretning BCG associeret urothelial og tumorceller; men de kan også omfatte tumor antigenspecifikke effektorceller, hvilket således tillader den direkte målretning af uinficerede tumorceller.

Den dynamiske model repræsenterer interaktionen mellem sunde urotelial væv, tumorceller, og deres forbindelse med BCG (interaktion afbildet ved grøn linje), hvilket igen resulterer i frembringelsen af ​​BCG-associerede sundt væv og tumorceller. Sidstnævnte cellepopulationer har kapacitet til at udløse aktivering af medfødte immuneffektorceller og dermed også det priming af adaptive immuneffektorceller. Røde linjer ender på cirkler angiver input stimuli, der påvirker rekrutteringen af ​​de angivne immuncellepopulationer. Sorte pile angiver enten stige (for eksempel rekruttering eller proliferation) eller formindskelse (fx død eller celle turn-over) af den respektive cellepopulation. Linjer med stumpe ender indikerer direkte drab af target cellepopulationer (optrukne linjer) eller tilskuer død (stiplede linjer). Modellen blev parameteriseret hjælp tilgængelige kliniske og

in vivo

data og tunet til at opnå 50% sandsynlighed for tumor uddø efter seks ugentlige intravesikale instillationer af BCG. En mere detaljeret version af denne figur er tilvejebragt af figur S1 af det supplerende materiale.

Den kvalitative model præsenteret ovenfor blev realiseret som et kontinuerlig-tid-Markovkæde hvor cellepopulationer er oplyst af heltallige stokastiske variable (tabel S1). Hver interaktion blev defineret ved dens indvirkning på cellepopulationer og tildeles en sats for forekomst (tabel S2). Når den matematiske model blev defineret, vi integreret den numerisk ved hjælp af

effektiv tau-springende algoritme

[4], at vi implementeret i C /C ++. Parameterværdierne for modellen (tabel S3) blev etableret af en af ​​de tre metoder. Først blev de indhentet fra litteraturen, hvor de blev direkte estimeret ud fra oplysninger [2], [5]. For det andet blev de vælges således, at simuleringer af cellen bestandsudviklingen er i overensstemmelse med tilgængelige kliniske og

in vivo

oplysninger [5]; se Figur S3 for en prøve simulering. Det tredje blev de ekstraheret fra kalibrering af modellen, således at sandsynligheden for tumor elimination er -50% i forståelse med kliniske data. Dermed for første gang, opnåede vi en matematisk model, der kombinerer immunologiske og kliniske data på BCG immunterapi. Den komplette beskrivelse af den matematiske model og dens parametrisering er inkluderet i den supplerende materiale

Modellen blev brugt til at simulere forskellige BCG regimer til at vurdere, hvordan tumor udslettelse påvirkes af:. (1) at variere tiden fra resektion til BCG-instillation, (2) modulering af BCG dosis anvendes under intravesikal instillation, (3) den iboende tidspunkt for BCG, og (4) den inter-instillation interval. Hver sandsynligheden for tumor udryddelse blev beregnet ved at køre 1.000 stokastiske simulationer, således at det er resulterende 95% konfidensinterval blev forholdsvis lille. Computeren koden blev også ansat i usikkerhed og følsomhedsanalyser til vurdering af robustheden af ​​vores resultater (Figur S4).

Resultater

Brug af parametriserede matematiske model, vi evaluerede behandling parametre menes at påvirke den kliniske respons. Først, vi bestemt indflydelse tidsintervallet mellem kirurgi og initiering af BCG behandling. Modellen beregnes sandsynligheden for tumor ekstinktion efter seks ugentlige instillationer som en funktion af tiden efter resektion tid (figur 2A). Jo kortere intervallet fra kirurgi til BCG-terapi, jo større er chancen for at opnå klinisk respons.

(A) Sandsynlighed for tumor ekstinktion med varierende tiden fra kirurgi til starten af ​​BCG-terapi. Det grå skraverede område repræsenterer tiden fra operation til den typiske initiering af BCG-behandling (dvs. 2 uger). Kræften vækstrate brugt er baseret på den kliniske observation, at high-grade læsioner bliver synlige med 3 måneder i fravær af behandling (detaljeret definition af tumor dynamik findes i de supplerende oplysninger og figur S2). Sandsynligheden for tumor ekstinktion efter seks ugentlige BCG instillationer blev modelleret som en funktion af (B) BCG dosis, og (C) BCG opholdstid.

Modellen blev yderligere forespørges til bestemmelse indvirkning BCG dosis og opholdstiden i blæren. Vi bemærkede en klar positiv korrelation mellem BCG dosis og sandsynligheden for tumor uddø (figur 2B). Slående, er små ændringer i dosis af BCG forventes at have en betydelig indvirkning på terapeutisk succes. BCG almindeligvis leveret ved et interval mellem 10

8 til 10

9 CFU’er /hætteglas. Overensstemmelse med den prædiktive model kan sådan en 10-fold forskel i klinisk anvendte dosis udgør ~ 40% differentieret respons på behandlingen. Som en naturlig følge, undersøgte vi opholdstid (dvs. varigheden af ​​BCG-instillation). Gang, finder vi, at en større eksponering af blæren mucosa til BCG resulterer i en øget sandsynlighed for tumor ekstinktion (figur 2C).

Nylige data vedrørende den forsinkede timingen af ​​T-celle priming efter mycobakteriel infektion [6], eller BCG intravesikal instillation [7], foreslog, at den aktuelle behandlingsplan ikke kan korrekt tunet til kinetikken af ​​adaptive immunresponser. Derfor blev effekten af ​​varierende mellem instillation timing vurderes. Vi fastholdt de første tre ugentlige doser, da dette er nødvendigt for priming adaptive immunrespons og indlede blære betændelse [5]; og vi modelleret det optimale tidsinterval mellem det tredje gennem sjette dosis behandling, der er udpeget af

N

i figur 3A. Efter fra parametrering betingelser, seks ugentlige instillationer resulterede i den forventede helbrede sats på 50%. Kortere inter-instillation varighed negativt påvirket klinisk respons (figur 3B). Bemærkelsesværdigt, modellen indikerer en optimal behandling interval, der er dobbelt længere end den nuværende standard for pleje, med nogen negativ indvirkning, hvis forlænges op til 30 dage (figur 3B).

(A) Skematisk fremstilling af den modellerede kirurgi tidspunkt efterfulgt af intravesikale behandling tidspunkter (pile). Symbolet * angiver tidspunktet for transuretral resektion (TUR) efterfulgt af 2 ugers interval før BCG terapi starter. Tre ugentlige instillationer er givet for at initiere medfødte og adaptive immunrespons. Tidsintervallet mellem den tredje gennem sjette dosis behandling var varieret og udpeget af

N Hotel (målt i uger). (B) Sandsynlighed for tumor udslettelse som en funktion af

N

, inter-instillation interval under 3

rd – 6

th behandling doser. Den stiplede linje markerer resultatet efter den anbefalede interval på

N

= 1 uge.

Vi udførte usikkerhed og følsomhedsanalyser for at vurdere robustheden af ​​vores numeriske resultater. Vi fandt, at de kvalitative træk ved figurerne 2B 2C er bevaret med lille variation af parametre. Resultaterne præsenteres i Figur 2A og 3 blev også undersøgt. Vi fandt, at efter model rekalibrering, varierende optællingen af ​​tumorceller ved starten af ​​behandlingen eller nøgle modelparametre påvirkninger lidt på vores forudsigelser. Nærmere oplysninger om disse analyser indgår i den supplerende materiale (figur S4).

Diskussion

Ved hjælp af en matematisk model, vi evalueret klinisk relevante spørgsmål BCG-behandling i NMIBC. Modellen viste, at terapeutisk succes afhænger meget af timingen af ​​BCG regime. En tidlig start på BCG behandling efter TUR, kombineret med en optimal opholdstid og behandling mellem instillation interval, gør, i virkeligheden, har dybtgående indflydelse på udfaldet behandling, ifølge vores model.

Der er ingen aktuelle retningslinjer rådgive når at starte BCG behandling efter operationen. Forsinkelse anses for vigtigt for helbredelsen af ​​blærevæggen, og forebyggelse af systemiske komplikationer som følge af BCG-behandling. Derfor er de fleste urologer vente 2-6 uger før start BCG-behandling; men i nogle undersøgelser intravesikal behandling er iværksat så tidligt som 1 uge efter transuretral resektion [8], [9]. Til dato, ingen potentielle sammenligninger af forskellige forsinkelser start af BCG behandling er blevet udført. Vores model viser, at en længere forsinkelse i initiering BCG terapi negativt kan påvirke tilbagefald satser (Figur 2A). Analyse af modellen foreslået, at den øgede risiko for fornyet var relateret til udvækst af resterende tumorceller. Dette resultat skyldes den fortsatte udbygning af tilbageværende tumorceller efter resektion, øge byrden af ​​sygdom og udfordre den begrænsede dræbe kapacitet af immunsystemet.

Ændringer i dosis og dvæle tid tidligere er blevet drøftet i litteratur på grundlag af reducerende bivirkninger. Dosisreduktion er blevet vurderet i flere kliniske undersøgelser [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Reduktion BCG dosis til en tredjedel blev betragtet som en strategi med henblik på at sænke bivirkninger. Denne lavere dosis forblev signifikant bedre end mitomycin; henviser en sjettedel af BCG-dosis var ikke bedre end anvendelse af mitomycin alene [13], [14]. Disse resultater bekræfter vores modellering resultater med hensyn til påvirkning af dosis på kur sats (figur 2B). Vores model viser også, at øge dosis øges terapeutisk succes. Dette ville imidlertid sandsynligvis ske på bekostning af forbedrede bivirkninger.

Reduktion af opholdstid er blevet rapporteret som en mulighed for at forbedre terapi og som et alternativ til dosisreduktion hos patienter med alvorlige bivirkninger [16], men ingen prospektive undersøgelse har sammenlignet BCG opholdstid som en variabel. Vores model viser, at øget opholdstid også kunne påvirke resultatet behandling (Figur 2C). Dette kunne være af særlig betydning hos patienter med minimale symptomer, der kan drage fordel af forbedret BCG-medieret immun aktivering. Disse resultater giver en kraftig påmindelse om vigtigheden af ​​at overholde som minimum de nuværende retningslinjer for BCG immunterapi.

Måske den mest slående fund er den observation, at den optimale behandling interval kunne være dobbelt så lang som den nuværende tidsplan for forvaltningen patienter (figur 3). Denne konstatering er sandsynligvis relateret til kinetikken af ​​T og B-celle-aktivering, og den vedvarende disse relativt langlivede effektorceller i blæren. Ved at forlænge behandlingen interval under effektorfasen, er det lykkedes at forbedre den tidsperiode, hvor immunsystemet kan udøve undertryk på den resterende tumorbyrde. Kun begrænset information er tilgængelig fra kliniske forsøg, hvor behandlingen intervallet blev ændret under BCG induktionsbehandling. Studier i mus viste, at antallet og timingen af ​​instillationerne er vigtige ved bestemmelse forskellige lokale cytokinprofiler, hvilket igen kan påvirke den kvalitative og kvantitative rekruttering af adaptive effektorceller [17]. Sådanne fund i kombination med resultatet af vores model understøtter behovet for yderligere undersøgelser for at bestemme den optimale timing af BCG instillationer. Endelig bør man være opmærksom på den pludselige tab af behandlingen kraft efter en bestemt interval (figur 3), en konstatering, der kan få konsekvenser for timingen af ​​vedligeholdelsesbehandling.

Disse data er spændende som den modificerede behandling regimen indgriber immunresponset afferent i den tidlige fase af behandling og maks fordele fra de langlivede effektor potentiale efferente adaptive respons. Sådan et regime med udvidede behandlingsforløb kan bedre tolereres af patienter [18]. Desuden er det spændende at antage, at en udvidelse af de første seks doser BCG kunne overflødiggøre behovet for vedligeholdelsesbehandling. Det er klart, disse fund kræver validering i prækliniske forsøgsmodeller og kliniske forsøg inden deres vedtaget for patientbehandlingen. Ikke desto mindre er vi opmuntret af resultaterne og understøtte brugen af ​​matematiske modeller til at fastlægge en ramme for optimering af behandling praksis.

Feltet af matematisk modellering i BCG immunterapi for blærekræft har først for nylig dukket [19], [20], [21], [22]. Emner behandlet hidtil har været: BCG dosis og antal instillationer nødvendige for at opnå helbredelse, og den kombinerede effekt af IL-2 og BCG. Tidligere modeller [19], [20], [21], [22] har en række begrænsninger, som er blevet omgået i dette arbejde. Først, i stedet for ordinære differentialligninger, hvor antallet af celler er givet af reelle tal, har vi valgt en stokastisk model, hvor antallet af celler tager heltalsværdier. Derfor er vores model bedre egnet til at beskrive tumor elimination. For det andet, i modsætning til tidligere modeller [19], [20], [21], [22], vores omfatter dynamikken i BCG-associerede sunde urothelial celler, som er mere talrige end BCG-associerede tumorceller – både tjener som initiativtagerne til medfødte og adaptiv immunitet. Tredje, er vi de første til at modellere prime boost respons af immunsystemet, et fænomen menes at være af afgørende betydning for BCG immunterapi [5]. Disse metodologiske fremskridt, ud over de her fremlagte resultater, vil medvirke til at fremme brugen af ​​matematiske modeller til optimering af immunbaserede behandlingsstrategier.

Konklusioner

Selvom per definition ufuldkommen, matematiske modeller er nyttige værktøjer til styring empirisk viden til at udtrække både kvalitative og kvantitative oplysninger. De nye indsigter opnået i BCG behandling endnu ikke klinisk testet og valideret for at bekræfte sammenhængen i modellen og dens forudsætninger. En model som den præsenteres her, kan derfor anses for udformningen af ​​nye terapeutiske strategier og kliniske studier.

Alt i alt vores model implicerer, at en streng tidsstyring af patienter blærekræft kan være afgørende for en vellykket BCG behandling, og at patienter kan drage stor fordel af en instillation plan med forlænget behandling intervaller. Vores resultater berettiger yderligere undersøgelser, der tager sigte på at optimere BCG behandling af patienter med NMIBC.

Støtte Information

Figur S1.

Blokdiagram over modellen af ​​interaktioner mellem det medfødte immunsystem og blære tumor under BCG-instillation.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s001

(TIFF)

Figur S2.

Simulering af logistisk tumorvækst, resektion og tumor genvækst. Den vandrette stiplede linje repræsenterer den omtrentlige størrelse af tumor når tumoren er synlig på blærevæggen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056327.s002

(TIFF)

figur S3.

Simulering af populationsdynamik af celler under og efter en seks-ugers forløb intravesikal BCG terapi. BCG (panel A), tumorceller (panel B), BCG-associerede tumorceller (panel C), BCG-associerede vævsceller (panel D), medfødte effektor celler (panel E), adaptive effektorceller celler (panel F). Bemærk modelleringen af ​​prime /boost respons medfødte og tilpasset immunsystem forekommer efter den tredje instillation (især note paneler E og F)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056327.s003

( TIFF)

Figur S4.

Følsomhedsanalyser for fig. 2A og 3 i hovedteksten. A. Følsomhedsanalyse af fig. 3 med skiftende tabet af tilpassede effektorer,

μ

Ea

. Den blå, sort (også vist i fig. 3) og røde kurver svarer til

μ

Ea

= 0,4, 0,8 og 1,6 dage

-1 hhv. For hver parametersæt, modellen er blevet re-kalibreret således, at seks ugentlige instillation af BCG terapi udbytte ~ 50% chance for helbredelse. B. Følsomhedsanalyse af fig. 3 med at variere antallet af tumorceller, der findes i blæren før initiering BCG-terapi,

T

(0). Den sorte (også vist i fig. 3), blå, magenta og røde kurver svarer til

T Hotel (0) = 10

6, 10

5, 10

4 og 10

3 tumorceller. Modellen er blevet re-kalibreret for hver værdi af

T Hotel (0), i overensstemmelse hermed. Disse talværdier tyder på, at vores forudsigelse af forbedret terapeutisk resultat af en to-ugers inter-instillation interval er robust. C. Følsomhedsanalyse af fig. 2A med at ændre antallet af tumorceller inden initiering BCG-terapi, T (0). Den sorte (. Også vist i figur 2A) og røde kurver svarer til

T Hotel (0) = 10

6 og 10

3 tumorceller henholdsvis

doi:. 10,1371 /tidsskrift .pone.0056327.s004

(TIFF)

tabel S1. Salg tilstandsvariable af modellen sammen med deres biologiske beskrivelse. De tilstandsvariable repræsenterer tællinger af forskellige celletyper, der er involveret i samspillet mellem immunsystemet, tumorceller og BCG

doi:. 10,1371 /journal.pone.0056327.s005

(TIFF)

tabel S2.

Stokastiske processer og deres tilsvarende priser.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s006

(TIFF)

tabel S3. Salg modellens parametre.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s007

(TIFF)

Text S1.

Detaljeret beskrivelse og numerisk analyse af den stokastiske matematisk model.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056327.s008

(PDF)