PLoS ONE: ETS transkriptionsfaktorer Kontrol Transkription af EZH2 og epigenetisk inaktivering af tumorsuppressorgen Nkx3.1 i prostatakræft

Abstrakt

Baggrund

ETS transkriptionsfaktorer regulerer vigtige signalveje involveret i celledifferentiering og udvikling i mange væv og er dukket op som vigtige aktører i prostatakræft. Men den biologiske virkning af ETS faktorer i prostata tumorigenese stadig debatteret.

Metode /vigtigste resultater

Vi udførte en analyse af ETS-genet familie ved hjælp microarray data og real-time PCR i normal og tumorvæv sammen med funktionelle studier i normale og cancer cellelinjer at forstå konsekvenserne i prostata tumorigenese og identificere centrale mål for disse transkriptionsfaktorer. Vi fandt hyppig dysregulering af ETS gener med oncogen (dvs. ERG og ESE1) og tumor-suppressor (dvs. ESE3) egenskaber i prostatatumorer forhold til normal prostata. Tumor undergrupper (dvs. ERG

høj, ESE1

høj, ESE3

lave og NoETS tumorer) blev identificeret på grundlag af deres ETS udtryk status og viste tydelig transkriptionelle og biologiske funktioner. ERG

høje og ESE3

lave tumorer havde de mest robuste gen signaturer med både forskellige og overlappende funktioner. Integration genomiske data med funktionelle undersøgelser i flere cellelinier, vi demonstreret, at ERG og ESE3 styres i modsat retning transkription af Polycomb Group proteinet EZH2, et centralt gen i udvikling, differentiering, stamcellebiologi og tumorigenese. Vi endvidere vist, at prostata-specifikke tumorsuppressorgen Nkx3.1 blev kontrolleret af ERG og ESE3 både direkte og gennem induktion af EZH2.

Konklusioner /Betydning

Disse resultater giver nye indsigter i rolle ETS transkriptionelle netværk i prostata tumorigenese og afdække tidligere indregnede forbindelser mellem afvigende ekspression af ETS faktorer, deregulering af epigenetiske effektorer og lyddæmpning af tumorsuppressorgener. Sammenhængen mellem afvigende ETS aktivitet og epigenetisk gendæmpning kan være relevante for den kliniske behandling af prostatakræft og design af nye terapeutiske strategier

Henvisning:. Kunderfranco P, Mello-Grand M, Cangemi R, Pellini S, Mensah A, Albertini V, et al. (2010) ETS transkriptionsfaktorer Kontrol Transkription af EZH2 og epigenetisk inaktivering af tumorsuppressorgen Nkx3.1 i prostatakræft. PLoS ONE 5 (5): e10547. doi: 10,1371 /journal.pone.0010547

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: November 3, 2009; Accepteret: April 12, 2010; Udgivet: May 10, 2010

Copyright: © 2010 Kunderfranco et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Oncosuisse (OCS-01.913-08), Swiss National Science Foundation (FNS-31003A-118.113) og Ticino Foundation for Cancer Research til GMC. MGM og CG blev støttet af Compagnia di San Paolo, Torino, Italien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancer i prostata er den mest almindelige cancer og en førende årsag til kræft død i vestlige lande [1]. Prostatakræft har en meget heterogen klinisk adfærd og lidt om de molekylære mekanismer, der bidrager til denne heterogenitet [1]. For nylig har ETS transkriptionsfaktorer dukket op som vigtige elementer i prostata tumorigenese grund konstateringen af ​​tilbagevendende translokationer involverer kvotebelagte gener, den hyppigste er den TMPRSS2: erga gen fusion fører til overekspression af fuld længde ERG [2], [3] [4]. Men den biologiske virkning af omplantede ETS gener stadig debatteret. De seneste rapporter tyder på, at ERG overekspression ikke er tilstrækkelig til at fremkalde neoplastisk transformation og samarbejde med andre onkogene veje, såsom PTEN tab og PI3K /AKT dysregulering, er nødvendig [5], [6], [7], [8], [9]. Den menneskelige ETS familien omfatter 27 medlemmer, der deler en højt konserveret DNA-bindende domæne og er knudepunkter af forskellige signalveje, der kontrollerer celleproliferation, differentiering og overlevelse [10]. Selv om der er et stort potentiale for overlapning, individuelle ETS faktorer har forskellige funktioner, der manifesterer gennem positive og negative regulering af de forskellige delmængder af gener og biologiske processer [10]. I mange væv ETS faktorer udgør komplekse regulerende netværk med specifikke cellulære responser afhængigt af balancen mellem faktorer med lignende eller modsatte funktioner [10]. De fleste ETS faktorer, som dem omplantes i prostatakræft, fremmer celledeling, overlevelse og transformation, mens andre fungerer som tumorsuppressorer [10]. For nylig fandt vi, at epitel-specifikke ETS faktor ESE3 var ofte nedreguleret i prostatakræft, negativt påvirket celleproliferation og overlevelse, og fungerede som tumorsuppressor i prostata epitelceller [11]. Således at forstå den samlede virkning af ETS gen deregulering i tumorigenese og identificere centrale mål for liberaliserede ETS faktorer, vil det være vigtigt at overveje det samlede sæt af ETS gener udtrykt i en given væv.

I denne undersøgelse, gennem en omfattende analyse af ETS-genet familien i prostata normale og tumorvæv, vi identificeret tumor undergrupper med forskellige ETS ekspressionsmønstre. Udover allerede kendte ETS mål, opdagede vi tidligere indregnede gener og stier i tilknytning til afvigende ETS aktivitet. Ved at integrere genomiske data med funktionelle studier, vi fastslået, at Polycomb Group (PcG) protein EZH2 er et direkte mål for ERG og ESE3, og en central aktør i transkriptionel lyddæmpning af prostata specifikt tumorsuppressorgen Nkx3.1. Tilsammen vores data viser hyppigere og komplekse ændringer af ETS gener end tidligere anerkendte og identificere vigtige gener som EZH2 og Nkx3.1 bidrager til omprogrammering af prostata epitelcelle transkriptom som reaktion på afvigende ekspression af onkogene og tumor suppressor ETS faktorer. Disse resultater kan være relevante for den kliniske behandling for prostatakræft og design af nye terapeutiske strategier.

Resultater

ETS genekspression Mønstre Definer prostatakræft undergrupper

For at få en omfattende billede af ETS transkriptionelle netværk i prostatakræft, undersøgte vi ekspressionen af ​​ETS-genet familien i microarray datasæt fra primær prostatacancer (

n = 59

) og normal prostata (

n = 14

) kliniske prøver. Analyse af microarray data viste, at flere ETS-gener differentielt blev udtrykt i tumorprøver sammenlignet med normal prostata. Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) blev anvendt til at bekræfte den differentielle ekspression af de mest hyppigt ændringer ETS faktorer (fig. S1). De mest markant påvirket ETS gener var ERG, ESE3 og epitel-specifikke ETS faktor-1 (ESE1 /ELF3 /ESX). Vi har tidligere vist, at ESE3 er der udtrykt i normal prostata epitelceller, negativt påvirket spredning og overlevelse af prostata kræftceller og foreslog, at den handlede som en tumor suppressor [11]. ESE1, som er nært beslægtet med ESE3, udtrykkes i normale epitelceller fra forskellige organer, herunder prostata, bryst og lunge og er kendt for at virke som et onkogen når overudtrykt i bryst- epitelceller [12], [13]. Men opregulering af ESE1 i prostatatumorer er ikke blevet rapporteret før. Samlet set dysreguleret udtryk for ETS gener var meget hyppige i prostata tumorer. De fleste af tumorerne havde mindst én op- eller ned-reguleret ETS-gen i forhold til normal prostata og ofte flere ETS blev samtidig påvirket.

Vores mål var at forstå, hvordan disse individuelle og sammensat ETS ændringer kunne påvirke biologi prostatacancer. Brug QRT-PCR-data på ETS genekspression og genomiske data, vi vurderet, om bestemte transkriptionelle profiler var forbundet med de forskellige ETS ekspressionsmønstre. Vi brugte flere kriterier for at minimere de potentielle forstyrrende virkninger af tilstedeværelsen af ​​flere ETS faktorer. Først blev QRT-PCR data anvendes til at klassificere nøjagtigt tumorer efter deres ETS genekspression status. Derefter tumorer kun med meget høj eller meget lav ekspression af et givet ETS (dvs. ≥4 gange højere eller lavere end den gennemsnitlige værdi i normal prostata) blev tildelt til en gruppe og inkluderet i analysen. Ved hjælp af disse kriterier ca. 80% af prostatakræft havde meget dereguleret ekspression af mindst ét ​​fremherskende ETS gen. På dette grundlag vi identificeret tre store tumor undergrupper karakteriseret ved den fremherskende dysregulering af et ETS faktor: i) tumorer med høj ERG ekspression (ERG

høj,

n = 14

), ii) tumorer med høj ESE-1-ekspression (ESE1

høj,

n = 12

) og iii) tumorer med lav ESE3 udtryk (ESE3

lav,

n = 13

). En fjerde gruppe (NoETS,

n = 14

) omfattede tumorer, der havde normal-lignende niveauer af alle ETS-genet (fig. 1A). Otte tumorer med ≥4 gange overekspression enten ETV1 blev ETV4, ETS2 eller ETS1 udelukket fra analysen på grund af deres begrænsede antal. ESE1 blev højt udtrykt i 26 af de 59 (44%) prostatatumorer, men kun i 12, som indgik i ESE1

højt udtrykkende gruppe, det var den eneste overudtrykt ETS. ESE3 var nedreguleret ≥4 fold i 27 af de 59 (46%) prostata tumorer, men kun i de 13 sager, der indgik i ESE3

lav udtrykke gruppe, det var den eneste dereguleret ETS. Vi anvendte en lignende tilgang til en offentligt tilgængelig microarray datasæt fra en uafhængig undersøgelse [14] at opnå en lignende fordeling af prostata tumorer i fire store undergrupper (fig. S2). Interessant, i vores serie 6 og 8 af de 14 ERG

høje tumorer havde samtidigt dysreguleret udtryk for ESE3 og ESE1 henholdsvis (fig. 1A). Ligeledes i den offentlige datasæt de 15 ERG

høje tumorer havde samtidigt dysreguleret udtryk for ESE3 og ESE1 (fig. S2A). Således kunne ERG overekspression klart sameksistere med dysreguleret udtryk for disse andre ETS faktorer. I vores tumor serie, 11 af de 14 ERG

høje tumorer (79%) var positive for TMPRSS2: erga fusion udskrift vurderet ved endepunkt RT-PCR (figur S3A.). De andre ERG over-udtrykkende tumorer havde sandsynligvis andre typer fusionstranskripter ikke påvises ved assayet. Syv tumorer havde meget lave niveauer af TMPRSS2: erga udskrift ved endepunkt RT-PCR, normal-lignende udtryk for ERG ved QRT-PCR og blev ikke inkluderet i ERG

høj gruppe. Ingen af ​​de 8 normale prøver og af de 11 benign prostatahyperplasi (BPH) undersøgte prøver havde bevis for TMPRSS2: ERGA transkript (. Fig S3A). Kliniske og patologiske parametre for de fire tumor undergrupper er vist i fig. S3B. Der var ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem ETS undergrupper og nogen af ​​de vurderede kliniske /patologiske parametre.

A. Ekspression af ERG, ESE1 og ESE3 bestemt ved QRT-PCR i normale prostata og prostatatumorer. Tumorer er grupperet efter den overvejende udtrykt ETS faktor. B. Principal komponent analyse. Dots repræsenterer individuelle prøver med deres placering bestemmes af de vigtigste komponenter i transkriptomet. C. Antal differentielt udtrykte gener med Q≤0.1 i hvert ETS undergruppe. D-E. Venn diagrammer, der viser delt og distinkte differentielt udtrykte gener blandt de angivne tumor undergrupper.

Transkriptionelle programmer i prostatakræft undergrupper

Vi brugte Principal Component Analysis (PCA) for at vurdere den globale grad af lighed eller divergens af de enkelte transcriptomes normale og prostatakræft prøver. Som vist i fig. 1B, tumorer tilhører forskellige undergrupper dannet helt adskilte klynger antyder, at divergens i de transkriptionelle programmer afhang i det mindste delvist på deres ETS genekspressionsmønstre. ERG

høje og ESE3

lave tumorer var længst væk fra normal prostata og stort set adskiller sig fra de andre undergrupper. Dernæst vi sammenlignede transkriptionelle profiler af tumor undergrupper med for normal prostata ved hjælp Gene Expression Profil Analyse Suite (GEPAS) [15] for at identificere fælles og adskilte funktioner og udtrække ETS-specifikke gen-signaturer. Antallet af differentielt udtrykte gener (Q≤0.1) i hver undergruppe er vist i fig. 1C og genet listerne er vist i tabel S1. ERG

høje og ESE3

lave tumorer havde de mest robuste gen signaturer med det største antal differentielt udtrykte gener i forhold til normal prostata, mens antallet af differentielt udtrykte gener var betydeligt mindre i ESE1

høj og NoETS tumorer .

Dernæst krydsede vi listerne over differentielt udtrykte gener i forhold til normal prostata at bestemme graden af ​​overlapning og divergens blandt tumor undergrupper (fig. 1D-E). Især ERG

høje og ESE3

lave tumorer delte mange differentielt udtrykte gener med et stort overlap blandt både opreguleret og ned- regulerede gener, hvilket indikerer, at ændret ekspression af ERG og ESE3 havde delvist lignende virkninger. På den anden side, ERG

høje og ESE3

lave tumorer havde et stort antal særlige kendetegn i forhold til Ingen ETS (fig. 1D) og ESE1

høj (Fig. 1E) tumorer. Disse forskelle i gensæt overlap var statistisk signifikant (P 0,0001, Fisher Exact test). Generne moduleret både i ERG

høj og ESE3

lave tumorer, men ikke i de andre tumor undergrupper, som indkredses gennem en 3-vejs (fig. 1D) og 4-vejs (fig. S4) Venn diagrammer, er opført i tabel S2.

for at forstå de funktionelle konsekvenser af forskellene mellem de tumor undergrupper vi brugte Metacore, en softwarepakke til integreret funktionel analyse af genekspression data [16]. Metacore lov til at kortlægge fælles, lignende og unikke funktioner blandt tumor undergrupper og definere almindeligt og forskelligt påvirket Gene ontologi veje. Som vist i fig. 2A, der var mange fælles og lignende træk blandt de tumor undergrupper. På den anden side, ERG

høje og ESE3

lave tumorer havde det største antal unikke funktioner. Den øverste almindeligt berørt GeneGo pathway kort (GGPM), der er vist i fig. 2B, inkluderet

immunrespons, cytoskeleton remodeling, udvikling, cellecyklus

og

transkriptionel regulering

. De kan repræsentere gener og pathways almindeligvis aktiverede i tumorer sammenlignet med normalt væv. De forskelligt berørte GGPMs blev overvejende eller udelukkende beriget med ERG

høj og ESE3

lave tumorer (Fig. 2C). Den øverste forskelligt påvirkede GGMPs inkluderet

celleadhæsion-integrin medieret

,

cytoskelet remodeling

,

celleadhæsion-ECM remodeling

celleadhæsion-kemokiner

, hvilket antyder, at aktivering af disse veje, relateret til cellemigrering og invasion, kunne være fremherskende træk ved disse tumorer. Interessant, disse data impliceret også, at ESE3 tab haft konsekvenser ganske ligner ERG overekspression på transkriptionelle program af prostata tumorer.

A. Antal unikke, lignende og fælles træk blandt de differentielt udtrykte gener i forhold til normal prostata i ERG

høj, ESE3

lave, ESE1

høje og NoETS tumorer ifølge Metacore. B. Almindeligt påvirket GeneGo Pathway Maps i tumor undergrupper. C. Differentielt påvirkede GeneGo Pathway Maps i ERG

høj, ESE3

lav, ESE1

høje og NoETS tumorer.

ERG opregulerer EZH2 Expression i prostata tumorer

Omfattende evaluering af ETS genekspression og genomiske data viste robuste og delvist overlappende gen signaturer i ERG

høje og ESE3

lave tumorer med mange aktiverede og fortrængte gener. Dernæst søgte vi ERG

høje og ESE3

lave signaturer til målgener, der kunne fungere som centrale knudepunkter medierer virkningerne af disse afvigende udtrykte ETS faktorer på prostatakræft transkriptomet. EZH2 var blandt de 169 up-regulerede gener både i ERG

høj og ESE3

lave tumorer gener (Fig. S4 og tabel S2), mens det ikke blev forøget i de andre tumor undergrupper. EZH2 blev også positivt korreleret med ERG og negativt korreleret med ESE3 i en korrelationsanalyse af hele microarray datasæt (tabel S3). EZH2 er en histon H3 lysin 27 (H3K27) methyltransferase og et centralt element i epigenetisk gendæmpning [17], [18]. H3K27 methylering er en histon mærke, der skaber et forankringspunkt for ansættelse af yderligere kromatin remodeling faktorer inducerer en undertrykkende kromatin tilstand [17]. Således kunne induktion af EZH2 forbundet med ERG forstærkning og ESE3 tab bidrager til den brede repressive signatur observeret i disse tumorer (fig. 1C). EZH2 har vist sig at være opreguleret i prostatakræft sammenlignet med normal prostata med særligt højere niveauer i høj kvalitet og metastatiske tumorer [19]. Men kun få faktorer er blevet identificeret som kan øge EZH2 udtryk i prostata tumorer [20], [21], [22], [23]. Vi fandt, at EZH2 var signifikant opreguleret i ERG

høje tumorer i forhold til både normal prostata og NoETS tumorer (Fig. 3A), hvilket indikerer, at der kan være en direkte forbindelse mellem EZH2 og ERG udtryk, der ikke var blevet anerkendt før. I overensstemmelse med dette fund, EZH2 var signifikant højere i ERG

høj sammenlignet med NoETS tumorer (Q 0,0001). Også i en uafhængig datasæt (. Fig 3B)

A. EZH2 ekspression i vævsprøver. Microarray data præsenteres som log2 nøgletal sammenlignet med referencen. B. EZH2 udtryk i NoETS og ERG

høje tumorer i Wallace et al. microarray datasæt. C. EZH2 udtryk i LNCaP og 22Rv1 celler forbigående transficeret med tomme (

ev

) eller ERG udtryk (

Erg

) vektor bestemmes ved RT-PCR (

venstre

) og Western blot (

rigtige

). D. EZH2 niveau i kontrol og stabile ERG-udtrykkende 22Rv1 og LNCaP celler bestemt ved RT-PCR (

øvre

) og Western blot (

bund

). E. EZH2 niveau i VCAP celler forbigående transficeret med kontrol og ERG-specifik (siERG) siRNA bestemt ved RT-PCR (

venstre

) og Western blot (

rigtige

). F. chip i de angivne cellelinjer med ERG antistof og qPCR med primersæt omfattende EBS i EZH2 promotoren. Positive (MMP3 promotor) og negative (ETS2) kontrol er vist i fig. S6A-B og 7A hhv. G væv eksemplarer af ERG

høje og NoETS tumorer blev udsat for chip med anti-ERG antistof og analyseret af qPCR. ETS2 blev anvendt som negativ kontrol (fig. S7B). *, P 0,01; **, P. 0,0001

Næste, vi undersøgt det funktionelle forhold mellem ERG og EZH2 og muligheden for direkte regulering af EZH2 af ERG i prostata kræftceller, hvor vi eksperimentelt op- og ned -regulated ERG. I disse eksperimenter, vi overudtrykt ERG i ERG-translokation negative 22Rv1 og LNCaP prostata kræftceller, der ikke udtrykker endogene ERG. Ved transfektion, 22Rv1 og LNCaP celler udtrykte ERG til niveauer svarende til TMPRSS2: ERG translokationspositiv VCap celler (. Figur S5A). Parallelt hermed knock-down af ERG blev udført i VCAP celler ved hjælp af en ERG specifikke siRNA. Niveauet af ERG RNA og protein blev signifikant reduceret i siRNA transficerede celler sammenlignet med kontrolgruppen VCAP celler (Fig. S5B). For at validere disse cellulære modeller, vi undersøgte ekspression af gener, ligesom MMP3, PLA-1 og CRISP3, der var øverst på listen over op-regulerede gener i ERG

høje tumorer og tidligere er blevet vist til at blive kontrolleret ERG i andre cellesystemer [6]. Ekspression af disse gener steget på ERG overekspression i 22Rv1 og LNCaP celler (Fig. S5C) og faldt over ERG knock-down i VCAP celler (Fig. S5D). Disse resultater viste tilstrækkeligheden af ​​vores cellulære modeller til at undersøge potentielle ERG målgener sammen med den prædiktive værdi af de gen-signaturer, vi stammer fra prostatakræft kliniske prøver.

Både forbigående og stabil ekspression af ERG i ERG-negativ LNCaP og 22Rv1 celler førte til øget niveau af EZH2 (fig. 3C-D). Endvidere blev EZH2 mRNA og protein reduceres ved siRNA-medieret knock-down af ERG i VCAP celler (Fig. 3E). Ændringerne i EZH2 udtryk observeret ved op- og ned- regulering af ERG foreslog muligheden for direkte regulering af ERG. Vi identificerede formodede ETS-bindingssteder (EBSS) inden 1 kb af EZH2 TSS efter beregningsanalyse og udførte CHIP eksperimenter for at bestemme, om ERG kunne binde til disse sites (Fig. 3F). Binding af ERG til EZH2 promotoren blev observeret i ERG translokationspositiv VCAP celler og i LNCaP og 22Rv1 celler efter stabil ekspression af ERG, mens ingen binding blev set i ikke-ERG udtrykkende parental LNCaP og 22Rv1 celler (Fig. 3F). Tilsvarende blev ERG bundet til MMP3 gen, et kendt ERG target anvendes her som positiv kontrol, kun i ERG udtrykkende kloner og i VCap celler (Fig. S6A). Ingen binding af ERG blev set til ETS2 promotoren, der blev anvendt som en negativ kontrol (fig. S7A). Området af ETS2 promotoren vurderet af Chip inkluderet transkriptionsstartstedet og både RNA-polymerase II og Sp1 var blevet vist at binde til denne region i gel shift og chip assays ([24], og data ikke vist). Taget sammen støttede disse data den konklusion, at ERG handlet som en transkriptionel aktivator for EZH2 ved binding til dets promotor. Endelig, for at bevise, at denne interaktion forekom også i kliniske tumor prøver vi udførte chip til at vurdere binding af ERG til EZH2 promotor i ERG

høje og NoETS prøver (Fig. 3G). ERG var forbundet til EZH2 promotor i ERG

høje tumorer, mens det var fraværende i NoETS tumorer, i overensstemmelse med den hypotese, at det kontrollerede transskription af dette gen. Specificitet blev demonstreret ved fravær af binding af ERG til ETS2 promotoren i tumor prøver (fig. S7B).

ERG undertrykker Nkx3.1 i Prostata tumorer gennem EZH2 og histon H3K27 Methylering

Foruden op-regulerede gener, transkriptomet af ERG

høje tumorer navnlig adskillige gener, hvis ekspression blev signifikant reduceret sammenlignet med den normale prostata, hvilket antyder, at disse gener kan undertrykkes enten direkte eller indirekte af ERG. Listen over down-regulerede gener i ERG

høje tumorer indeholdt mange relevante gener, der kan få væsentlig indvirkning på prostatakræft biologi. Blandt gener med kendte tumor suppressor funktioner, vi fokuseret på Nkx3.1, der ligeledes var påvirket i ERG

høj og ESE3

lave tumorer. Nkx3.1 er et prostataspecifikt homeobox-gen og en transkriptionsfaktor, der har kritiske funktioner i prostata udvikling og tumor suppression [25]. Tab af Nkx3.1 udtryk er en hyppig begivenhed i prostata tumorigenese og er blevet tilskrevet forskellige mekanismer, herunder allel tab methylering og post-transkriptionel lyddæmpning [25], [26], [27], [28]. Vi fandt, at niveauet for Nkx3.1 blev reduceret betydeligt i ERG

høje tumorer sammenlignet med normale prostata og NoETS tumorer (fig. 4A). For at bestemme om Nkx3.1 nedregulering blev funktionelt knyttet til ERG overekspression undersøgte vi niveauet af Nkx3.1 i prostatacancerceller ved modulation af ERG. ERG knock-down i VCap celler resulterede i øget Nkx3.1 ekspression på mRNA og proteinniveauet (Fig. 4B). På den anden side blev Nkx3.1 niveau reduceret med stabil ekspression af ERG i ERG negativ LNCaP og 22RV1 celler, hvilket giver yderligere bevis for kontrol med Nkx3.1 ekspression af ERG (fig. 4B). Da ETS faktorer kan virke som transkriptionelle aktivatorer eller repressorer, afhængigt af promotoren kontekst [10], [29], vi søgte Nkx3.1 promotoren for eventuel EBS der kunne medieres ERG binding. Beregningsanalyse viste tilstedeværelsen af ​​en formodet EBS i Nkx3.1 promotoren. Chip assays viste binding af ERG til denne region af promotoren i VCap celler (Fig. 4C). ERG besatte Nkx3.1 promotoren også i LNCaP og 22Rv1 celler efter stabil ERG udtryk og samtidig til lyddæmpning af genet (fig. 4C). Således binding af ERG til Nkx3.1 promotoren var forbundet med transkriptionel repression af genet. Vi observerede Nkx3.1 promotor belægning af ERG også i kliniske tumorprøver ved at udføre chip i ERG

høje og NoETS tumorer. ERG blev bundet til Nkx3.1 promotor i ERG

høje tumorer, i overensstemmelse med den hypotese, at det kontrollerede negativt transskription af genet i denne tumor undergruppe (Fig. 4D).

A. Nkx3.1 ekspression i normale og tumorceller vævsprøver. B. Nkx3.1 niveau i LNCaP celler forbigående transficeret med tomme (

ev

) eller ERG udtryk (

Erg

) vektor bestemmes af Western blot (øverste panel), Nkx3.1 niveau i VCap celler transient transficeret med siERG og kontrol siRNA bestemt ved RT-PCR og Western blot (midterste panel), Nkx3.1 niveau i kontrol og stabile ERG-udtrykkende 22Rv1 og LNCaP-celler analyseret ved RT-PCR og Western blot (nederste panel). C. Binding af ERG til Nkx3.1 promotoren bestemt ved chip og qPCR i angivne cellelinjer. Negative kontroller er vist i fig. S7A. D. Vævsprøver af ERG

høj og NoETS tumor blev udsat for chip med anti-ERG antistof og analyseret af qPCR. Negative kontroller er vist i fig. S7B. E. VCap, parenteral (kontrol) og ERG udtrykkende (ERG 18) LNCaP-celler transficeret med EZH2 specifikke (siEZH2) og kontrol-siRNA og analyseret ved RT-PCR. F. chip med et antistof for methylerede H3K27 og qPCR med primer sæt omfatter EBS (

øverste panel

) og en androgen enhancer (ARE) (

nederste panel

) i Nkx3.1 gen. ETS2 blev anvendt som negativ kontrol (fig. S8A). G. Nkx3.1 promotoraktivitet i LNCaP-celler transficeret med human Nkx3.1 promoter reporter sammen med de angivne ekspressionsvektorer. Luciferaseaktivitet reporter-aktivitet blev målt efter 24 timer. H. Nkx3.1 proteinniveauet i LNCaP-celler transient transficeret med tomme (-) eller enten ERG (Perg) eller EZH2 (pEZH2) ekspressionsvektor bestemt ved Western blot. I. Nkx3.1 promotor methylering blev vurderet ved bisulfit-behandlet DNA-sekventering. Tomme og fyldte cirkler repræsenterer methyleret og methyleret CpG sites hhv. *, P 0,01; **, P. 0,001

For at afgøre, om induktion af EZH2 af ERG kan bidrage til lyddæmpning af Nkx3.1, vi bankede-down EZH2 i ERG udtrykkende celler. siRNA-medieret knock-down af EZH2 i VCAP celler forøgede ekspression af Nkx3.1, overensstemmelse med den hypotese, at genet var under kontrol af EZH2 i disse celler (fig. 4E). Desuden EZH2 knock-down i ERG udtrykker LNCaP kloner delvist restaureret Nkx3.1 udtryk til et niveau, der svarer til forældrenes LNCaP celler (Fig. 4E). For yderligere at bevise rolle EZH2 bestemte vi af Chip hvorvidt Nkx3.1 promotoren erhvervet H3K27 methylering mærket karakteristisk for EZH2 aktivitet i celler, hvori genet blev undertrykt. Vi observerede forøgede H3K27 methylering i regionen omkring EBS, som vi identificeret i promotoren, og på niveau med et androgen responsive enhancer (ARE), der er et vigtigt regulatorisk site i Nkx3.1 genet [30] i ERG- translokationspositiv VCAP celler (fig. 4F). En lignende berigelse af H3K27 methylering blev også observeret i LNCaP og 22Rv1 celler med stabil ekspression af ERG (fig. 4F). Således købte Nkx3.1 en undertrykkende mark karakteristisk for EZH2 aktivitet i en ERG-afhængig måde. Tilsammen disse data fastslået, at Nkx3.1 var et mål på både ERG og EZH2. ERG undertrykt Nkx3.1 direkte ved binding til dets promotor og indirekte gennem induktion af EZH2 og H3K27 methylering. Luciferase reporter assays og eksperimenter med transient transfektion understøttet denne hypotese. Nkx3.1 promotoraktivitet og proteinniveau blev reduceret ved forbigående ekspression af ERG i LNCaP-celler (fig. 4G-H). I modsætning hertil transient transfektion af EZH2 alene havde ingen virkning på Nkx3.1 promotoraktivitet i reporter assay eller Nkx3.1 proteinniveauet (Fig. 4G-H), hvilket indikerer, at EZH2 kræves ERG og stabil ekspression til tavshed Nkx3.1. Disse resultater er således i overensstemmelse med evne ETS faktorer til at handle alternativt som transkriptionel aktivator og repressor [10], [29] og med den hypotese, at transkriptionsfaktorer kan påvirke rekrutteringen af ​​epigenetiske effektorer som EZH2 til genpromotorer [31].

Køb af repressive histon mærker, ligesom H3K27 methylering, er kun en af ​​flere mekanismer, der bidrager til lyddæmpning af tumorsuppressorgener i cancerceller [18]. Promotoren af ​​Nkx3.1 genet indeholder et CpG ø og genet er blevet rapporteret at være bragt til tavshed af CpG-promotor-methylering i prostatatumorer [26]. Således har vi fastslået, om DNA-methylering også var involveret i ERG induceret Nkx3.1 lyddæmpning. Bisulfit sekventering viste fravær af CpG-methylering i den Nkx3.1 promotoren i ERG-translokationspositiv VCAP celler og ERG udtrykkende og ikke-udtrykkende LNCaP-celler (fig. 4I). I modsætning hertil blev Nkx3.1 promotor methylerede i ERG-translokation negative PC3 prostata kræftceller, der ikke udtrykker Nkx3.1 (fig. 4I), hvilket indikerer, at Nkx3.1 i disse celler blev bragt til tavshed af CpG promotor methylering. Således ERG-induceret Nkx3.1 lyddæmpning påberåbt primært på EZH2 og var uafhængig af promotor methylering, i overensstemmelse med reaktivering af Nkx3.1 udtryk på EZH2 knock-down.

ESE-3 undertrykker EZH2 og Aktiverer Nkx3.1 Transskription

transkriptom af ERG

høje og ESE3

lave tumorer delte mange gener til fælles. Dette antydede, at ERG og ESE3 kan påvirke transkription af mange gener i modsatte retninger, og at ERG opregulering og ESE3 nedregulering kunne resulterer i delvis lignende virkninger på prostatacancer transkriptomet. Som det ses i ERG

høje tumorer, EZH2 var signifikant højere i ESE3

lave tumorer sammenlignet med normale prostata og NoETS tumorer (fig. 5A). Det omvendte forhold mellem ESE3 og EZH2 ekspressionsniveauet blev også set i en uafhængig microarray datasæt (Q 0,0004) [14] (figur 5B,. S2D). Disse observationer foreslog, at ESE3 negativt kunne regulere EZH2 i prostata og tab af ESE3 kunne resultere i øget EZH2 udtryk i prostata tumorer. For at teste denne hypotese, genereret vi kloner af LNCaP celler (ESE3-

kd

), hvor vi stabilt bankede-down ESE3 hjælp shRNA konstruerer. Disse kloner havde signifikant lavere niveauer af ESE3 sammenlignet med parentale LNCaP-celler, som udtrykker detekterbare niveauer af ESE3 (fig. S5E). I overensstemmelse med vores hypotese, ESE3-

kd

LNCaP celler havde højere udtryk for EZH2 end forældrenes celler (fig. 5C). For at bestemme om ESE3 kontrollerede udtryk for EZH2 også i normale prostata epitelceller vi stabilt knock-down ESE3 i udødeliggjort LHS celler [32], som vi tidligere har vist at udtrykke ESE3 [11]. Som vist i fig.