PLoS ONE: Den strukturelle kompleksitet af Human BORIS Gene i gametogenese og Cancer

Abstrakt

Baggrund

BORIS

/

CTCFL

er en paralog af

CTCF

, de store epigenetisk regulator af hvirveldyr genomer. BORIS udtrykkes normalt kun i kimceller men er aberrerende aktiveret i talrige cancere. Mens de seneste undersøgelser viste, at BORIS er en transskriptionel aktivator af testis-specifikke gener, er lidt almindeligt kendt om dens biologiske og molekylære funktioner.

Metodologi /vigtigste resultater

Her viser vi, at

BORIS

udtrykkes som 23 isoformer i germlinie og kræftceller. Isoformerne består af alternative N- og C-terminale ender kombineret med varierende antal zinkfingre (ZF) i det DNA-bindende domæne. Mønstrene af

BORIS

isoform udtryk adskiller i kim og kræftceller. Isoform udtryk aktiveres ved nedregulering af

CTCF

, opreguleret ved reduktion i CpG methylering forårsaget af inaktivering af DNMT1 eller DNMT3b, og undertrykt af aktivering af

p53

. Undersøgelser af ektopisk udtrykte isoformer viste, at alle er oversat og lokaliseret til kernen. Brug af testis-specifikke cerebrosid sulfotransferase (

CST)

promotoren og

IGF2 /H19

prægning kontrol region (ICR), blev det vist, at binding af BORIS isoformer til DNA-mål

i vitro

er følsomme for methylering, og afhænger af antallet og specifik sammensætning ZF. Evnen til at binde mål-DNA og tilstedeværelsen af ​​en specifik lang aminoterminal (N258) i forskellige isoformer er nødvendige og tilstrækkelige til at aktivere

CST

transkription. Sammenlignende sekvens analyser afslørede en evolutionær burst i pattedyr med stærk bevarelse af BORIS isoproteins blandt primater.

Konklusioner

Den omfattende repertoire af splejset

BORIS

varianter hos mennesker, der giver tydelig DNA bindende og transkriptionel aktivering egenskaber, og deres differentielle mønstre af ekspression blandt kimceller og neoplastiske celler antyder, at genet er involveret i en række funktionelt vigtige aspekter af både normal gametogenese og cancerudvikling. Derudover kan en byge i isoform diversificering være evolutionært bundet til unikke aspekter af primat artsdannelse

Henvisning:. Pugacheva EM, Suzuki T, Pack SD, Kosaka-Suzuki N, Yoon J, Vostrov AA, et al. (2010) Den strukturelle kompleksitet af Human

BORIS

Gene i gametogenese og kræft. PLoS ONE 5 (11): e13872. doi: 10,1371 /journal.pone.0013872

Redaktør: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, USA

Modtaget: Juli 2, 2010; Accepteret: 11 oktober 2010; Udgivet: November 8, 2010

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af murene forskningsprogram af NIAID og af intramuralt bevilling fra NIH Office of aIDS Research til AVS og DL de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

BORIS

(bror til den regulator af imprintede steder) er en paralog af den multifunktionelle

CTCF

gen, som er involveret i læsning epigenetiske mærker, transkriptionel genaktivering og undertrykkelse, X-kromosom inaktivering, chromatin loop-dannelse gennem dimerisering og i globale tredimensionale genom organisation [1], [2], [3], [4], [5]. Mens de to proteiner deler en central 11 zinkfinger (ZF) DNA-bindende domæne, de har særskilte amino- og carboxy-termini [2], [6]. I normale væv, de to paraloge gener viser gensidigt udelukker ekspressionsmønstre:

BORIS

mRNA er rigeligt i mandlige kimceller, navnlig på primær- spermatocytter og runde spermatider, hvor

CTCF

, som udtrykkes ubikvitært i somatiske celler, undertrykkes [2]. BORIS fungerer som transkriptionel aktivator af flere testis-specifikke målgener under spermatogenesen, mens CTCF undertrykker de samme mål i somatiske celler [7], [8], [9]. I kønsceller blev BORIS foreslået at være involveret i nulstilling af prægning på

Igf2 /H19

prægning kontrol region (ICR) [10]. I modsætning hertil CTCF er det kendte læseren og beskytter af

Igf2 /H19

prægning mærker i somatiske celler [11], [12], [13], [14], [15]. Den adskillelse af

BORIS

CTCF

udtryk i forskellige celletyper i pattedyr er tæt kontrolleret. Normalt CTCF, p53, og CpG methylering undertrykke

BORIS

transskription i somatiske celler, effektivt begrænser sit udtryk til testikulære kimceller [8], [16], hvor fraværet af CTCF [2] og flere bølger af genom-dækkende demethylering skabe betingelserne for

BORIS

aktivering.

BORIS

er afvigende aktiveres i mange typer af kræftceller, dens udtryk sammenfaldende med tabet af CpG methylering, den første epigenetisk forandring identificeret i cancerceller [2], [6], [17]. Afvigende udtryk for

BORIS

i kræftceller sandsynlige resultater i en konkurrence mellem BORIS og CTCF proteiner til binding til CTCF DNA-bindende mål sites (CTSes). BORIS kan forstyrre CTCF funktioner i kræftcellerne ikke blot i kraft af at have den samme ZF bindende domæne og overlappende DNA-bindende specificitet, men også på grund af sin særegne amino- og carboxy-termini, der sandsynligvis tildeler et diskret sæt af molekylære funktioner [2] . Faktisk både CTCF og BORIS binder

MAGE A1

promotor, men med modsatrettede resultater: mens CTCF fungerer som en transskriptionsrepressor Boris fungerer som en aktivator [8]. En nylig undersøgelse viste også, at BORIS og CTCF udfører forskellige transkriptionelle funktioner ved binding til promotoren af ​​muse testis-specifik

CST

splejsningsvariant [9]. Afslutningsvis selvom molekylære funktioner BORIS i cancer mangler at blive undersøgt i dybden, afvigende co-ekspression af

CTCF

BORIS

er en af ​​genekspression signaturer karakteristisk for mange kræftformer [6 ].

Tidligere undersøgelser har vist, at den evolutionære fremkomsten af ​​

BORIS

i amniotes indtruffet før divergensen af ​​krybdyr og pattedyr, og kunne tilskrives en indledende gentagelse af hele

CTCF

sekvens [18]. Mens BORIS er almindeligt udtryk i krybdyr og Monotremer blev udtryk vist at være gonadedosis-specifikke i pungdyr og eutherians, hvilket indikerer, at BORIS blev funktionelt specialiseret i pattedyr evolution i koncert med udviklingen af ​​genomisk prægning [18]. Mens

CTCF

er stærkt bevaret fra Drosophila til mennesker [18], [19], [20],

BORIS

kodning og ikke-kodende sekvenser er udviklingsmæssigt plast [18]. En sammenligning af den amino- og carboxy-termini af humant

BORIS

med ortologer i andre arter afslører relativt lav lighed, 32,3% og 23,7%, henholdsvis hvorimod den tilsvarende lighed af human

CTCF

med andre ortologer er 90,1% og 80,7%, henholdsvis. Ikke desto mindre BORIS ZF regionen har 80,4% identitet med sine orthologer, svarende til bevarelse 99,5% for CTCF ZFS [18]. Den hurtige udvikling af

BORIS

er ikke begrænset til protein sekvenser. Bemærkelsesværdigt, strukturen af ​​locus som helhed er markant anderledes, selv mellem mus og mennesker, som kan tyde et specialiseret sæt funktioner og /eller splejsnings- isoformer. Det humane

BORIS

gen spænder over 29 kb ved 20q13 og består af 11 exoner, hvoraf 10 er kodende [2]. Dette kan tillade frembringelsen af ​​et antal forskellige isoformer ved alternativ splejsning. Evolutionært, alternativ splejsning er den mest udbredte mekanisme til at øge kodning evne mRNA-transkripter til at tillade generering af forskellige protein-isoformer med forskellige aktiviteter.

Den første bevis for alternativ

BORIS

udskrifter kom fra den seneste demonstration af, at menneskelig

BORIS

udtrykkes fra mindst tre alternative initiativtagere udnytte fem forskellige 5 ‘UTR’er [16]. I den foreliggende undersøgelse, vi kendetegnet 23

BORIS

splejsningsvarianter med distinkte udtryk profiler i normale germlinie og cancerceller, samtidig udviser differentiel DNA-bindende aktiviteter og varierende transskriptionelle egenskaber. Således

BORIS

udtrykkes som et repertoire af alternative transkripter og proteiner, hvilket indikerer, at alternativ splejsning genererer en kompleks mekanisme for BORIS-medieret funktion i germlinie og cancerceller.

Resultater

Multiple

BORIS

udskrifter udtrykkes i human testikel, ES-celler og cellelinjer fra forskellige typer af kræft

Vi har tidligere vist, at ekspressionen af ​​

BORIS

er begrænset til testiklerne væv og cancerceller, med ekspression afhængig af status for methylering af CpG af alternative

BORIS

promotorer [8], [16]. I analysen af ​​

CTCF

BORIS

udtryk i menneskelig testikel, embryonale stamceller (ES) celler, og flere cancer cellelinier ved RT-PCR, var vi i stand til at forstærke den fuld længde ZF- kodende regioner af begge gener. Kun en enkelt PCR bånd specifikt for

CTCF

ZF Domænet blev påvist i alle celletyper undersøgte; blev dog flere PCR-bånd genereret af primere amplifikation af

BORIS

region svarende til ZF domæne (fig. 1A). Sekvens analyser af klonede

BORIS

PCR-produkter er identificeret en række alternative udskrifter med forskellige kombinationer af ZF exoner, der blev genereret på grund af udnyttelsen af ​​alternative splejsningssites (Fig. 1A). Den overflod og distribution af

BORIS

udskrift varianter afveg blandt kræft cellelinjer og i testiklerne, hvilket tyder på distinkte mekanismer for regulering af

BORIS

gen i normale germlinie og kræftceller.

(A) Samlet RNA fra de angivne cellelinjer og testis væv blev analyseret ved RT-PCR under anvendelse af primere designet til at amplificere fuld-længde

CTCF

og

BORIS

ZFS domæner. Sekvenserne af primerne er vist i tabel S1. Nested PCR blev udført med 20 og 35 cykler for første og anden runde hhv. Kilderne til RNA er vist på toppen af ​​hver gel. Pile peger på den enkelte

CTCF

udskrift og flere

BORIS

alternative udskrifter. (B) 3 ‘RLM-RACE strategi til kloning alternativt splejset

BORIS

former. Tre

BORIS

alternative promotere og 12 exons med ikke-kodende sekvenser (hvide kasser) eller kodende sekvenser (grå kasser) er vist. Total RNA fra voksent menneske testis og K562 cellelinien blev behandlet med Generacer PCR kit til amplifikation af cDNA’er i fuld længde. Den første runde af PCR blev udført med tre fremad gen-specifikke (GSP) primere A, B, og C, der var designet til at identificere mRNA udtrykt fra tilsvarende alternativ

BORIS

initiativtagere A, B eller C, henholdsvis. 3’Generacer primer bundet til poly A-halen blev anvendt som en revers primer. l pi af den første runde PCR-blandingen blev anvendt som en skabelon til at udføre nested PCR med tre fremad nestede genspecifikke (NGSP) primere A1, B1 og C1. (C) 3’RLM-RACE blev udført på human testis og K562 cellelinien. Multiple

BORIS

udskrifter blev påvist i begge prøver. PCR-produkter af den nestede PCR er vist adskilt på 1% agarosegeler. M er størrelsen markør.

Vel vidende, at CpG hypometylering er involveret i

BORIS

aktivering [2], [8], [16], vi sammenlignet

BORIS

udtryk i HCT116 coloncancercellelinie til HCT116 celler behandlet med 5aza-dC, og HCT116 bærer en dobbelt knockout (DKO) i

DNMT3b

DNMT1

[21]. Et dramatisk fald i CpG-methylering i HCT116 DKO og HCT116-celler behandlet med 5aza-dC, beskrevet tidligere [21], korreleret med fremkomsten af ​​multiple

BORIS

-specifikke RT-PCR-produkter (fig. 1A), hvilket var fraværende i den parentale HCT116 cellelinie. Interessant, blev humane ES-celler sig at udtrykke mindst to alternative

BORIS

udskrifter, der bekræfter

BORIS

udtryk i ES-cellelinjer som påvist tidligere ved immunfluorescens [22]. Vi konkluderer derfor, at mens

CTCF

udtrykkes som en enkelt udskrift i human testikel og kræft,

BORIS

udtrykkes som flere isoformer i testiklerne, ES-celler og i kræftceller, specielt i celler med øget DNA hypometylering.

Tyve tre alternativt splejset

BORIS

isoformer udtrykkes i testiklerne og i cancerceller

Foranlediget af vores tidligere identifikation af fem alternative 5′-UTR splejsning

BORIS

varianter genereret fra tre alternativ

BORIS

initiativtagere (a, B og C) [16], gennemførte vi en skærm til fuld længde alternativt splejset

BORIS

udskrifter i human testikel og K562 kræft cellelinje cellerne med de højeste niveauer af

BORIS

udtryk. For at isolere fuld-længde

BORIS

alternative transskripter, vi udnyttet den fremgangsmåde 3′-RLM-RACE vist i figur 1B. Vi forstærket flere

BORIS

RT-PCR-produkter, som derefter blev klonet og sekventeret (Fig. 1C). Fra denne, vi identificeret 19 hidtil ukendte

BORIS

splejsningsvarianter (fig. 2). De to vigtigste kilder til heterogenitet i

BORIS

mRNA var brugen af ​​alternative initiativtagere og splejsningssteder. Vi observerede også differentiel brug af distinkte 5′- og 3′-UTR’er samt alternative translationsrammer i amino- og carboxyterminale kodende områder. Justering af

BORIS

genomisk sekvens med alternative udskrifter afslørede, at exon-intron-grænserne havde klassiske splejsningssite sekvenser (tabel S4). Det meste af den alternative

BORIS

udskrifter besad en polyA hale ligger 20-30 bp nedstrøms fra den kanoniske polyadenyleringssignalet, AAUAAA (File S1), hvilket indikerer, at

BORIS

isoformer nået den fase af udtryk som modent mRNA.

(A) Skematisk illustration af

BORIS

gen med tre alternative initiativtagere og seksten exoner anvendes til fremskaffelse af 23 isoform mRNA. Exoner størrelser er vist under ordningen, med minimum og maksimum antal nukleotider til de alternative exons. Start- og stopcodoner for ORF’erne er angivet som ATG og Stop hhv. Den første

BORIS

udskrift repræsenterer den oprindeligt klonet

BORIS

form betegnes her som

B0

; den

BORIS

udskrifter vist nedenfor er nye klonede isoformer. Til venstre er navnene på

BORIS

isoformer, svarende til skematisk givne udskrifter. Til højre den seks

BORIS

underfamilier, fordelt på grundlag af tilsvarende 3 ‘ender, er angivet. De røde og blå streger på toppen eller bunden af ​​den skematiske afbildning af isoformer afbilder placeringen af ​​Taqman-prober. Utranslaterede regioner er repræsenteret ved åbne kasser. Introns (tynde linjer) vises ikke til nøjagtige omfang. (B) Alternativ splejsning skaber en ny ZF i

C6

isoform. Aminosyresekvens sammenligninger af ZF 4 af

B0

og nyt alternativ ZF 4/9 af

C6,

som kombinerer den første halvdel af ZF 4 og den anden halvdel af ZF 9. (C) Alternativ splejsning skaber en ny kodning spacer mellem ZFS 5 og 6 i

A3

isoform.

BORIS

isoformer blev kategoriseret efter promotor brug (fig. 2A ). Isoformer fordrevet fra promotor A inkluderet

BORIS A1

,

A2

,

A3, A4, A5

, og

A6

. I forhold til den oprindeligt beskrevne

BORIS

udskrift [2], som nu betegnes som den

BORIS B0

isoform, isoformer

A1

og

A2

indeholdt alternative 5’UTR’er, men kodes samme BORIS polypeptid (fig. 2A, tabel S3). Isoform

A3

havde flere nye funktioner, der adskiller den fra

B0

herunder en lang ikke-kodende 5’UTR og udelukkelsen af ​​exon 6 på grund af alternativ splejsning. Dette resulterede i nærvær af kun 9 ZFS, snarere end 11

BORIS B0

, men også produceret en ny lang spacer mellem ZF5 og ZF8 (fig. 2A, C). For isoformer

A4

og

C2

, som både koder for det samme polypeptid, ORF’er fortsætte ind intron 4 indtil en anden stopkodon resulterede i trunkering af ZF domæne samtidig producere en alternativ COOH-terminus . Isoformer

A5

og

A6

både kodet 10 fulde ZFS og halvdelen af ​​ZF11, som alternativt splejsede fra exon 8 til nye exons 9a eller 9a (1), henholdsvis, hvilket resulterer i to alternative carboxy termini. Den isoform

B1

har de samme 10 kodende exoner som

BORIS B0

prototype, men besad en ekstra exon 11, som kodede en alternativ carboxyterminus. Desuden er nogle isoformer havde alternative amino-termini på grund af udnyttelsen af ​​forskellige startkodoner, som hidrører fra alternativ splejsning af exon Eb til exon 2 (i

B3

B4

) eller exon 3 (i

B2, B5, B6, B7

).

De fleste overraskende, kun 7 ud af 23

BORIS

isoformer kodede en fuld-længde 11 ZF DNA binding domæne, med antallet af ZF i de andre isoformer i området fra 1 til 10 (File S1, tabel S3). Som vist ved de følgende eksempler, reduktioner i antallet af ZFS resulterede fra anvendelsen af ​​alternative splejsningssites og stopkodoner. Isoformen

C5

havde kun én ZF og en alternativ carboxy-terminus er resultatet af splejsning fra midten af ​​exon 3 til exon 10b. Mens isoform

C8

indeholdt alle 11 exons, tilstedeværelsen af ​​en ekstra exon 6a med en i-frame-stopkodon resulterede i blot seks ZFS. Bemærkelsesværdigt, splejsning fra exon 4 til exon 8 i isoform

C6

skabt en ny hybrid ZF består af halvdelen af ​​ZF 4 og halvdelen af ​​ZF 9. Dette rejser muligheden for, at den nye ZF kunne give nye DNA-bindende egenskaber til denne isoform (fig. 2B). Endelig nogle alternative exons, såsom 5a i

B6, B7, C7

, og

C9

, beholdt intronsekvenser der indarbejdet præmature stopcodoner, og kan derfor ikke producere stabilt protein på grund af den nonsense-medieret mRNA nedbrydning (NMD) vej, en mulighed, der bør verificeres eksperimentelt.

Karakteristiske træk af

BORIS

alternative varianter og deres evolutionære bevarelse i mennesker og ikke-menneskelige primater

23

BORIS

mRNA splejsning varianter har potentialet til at kode 17 forskellige polypeptider, som vi udpeger som BORIS isoform proteiner 1 til 17. for at kategorisere isoformer, den alternative amino- og carboxy-termini blev navngivet i overensstemmelse til antallet af aminosyrerester opstrøms og nedstrøms for ZF domæne (tabel S3). For eksempel, N258 betegner en amino-terminal med 258 aminosyrerester opstrøms for ZF domæne, som kodes i mange

BORIS

isoformer herunder

B0, B1, A3, A4, A5, A6, C3, C4, C5, C6, C7 /C9

C8

. Især N24 og N53, afkortede versioner af N258, har ingen aminosyre forskelle N258 inden for de 24 og 53 aminosyrer opstrøms fra ZF1. Elleve alternativ carboxy-termini findes i distinkte isoformer betegnes som “C”, med antal svarende til antallet af kodoner nedstrøms for den sidste ZF. For eksempel,

B1

har C132,

C3

har C97,

C5

har C53, etc. (File S1, tabel S3).

Til søgning efter homologi med kendte proteiner eller domæner, blev de elleve unikke alternative C-termini sammenlignet ved BLAST til GenBank aminosyresekvenser. Kun en alternativ carboxyterminalen, C97, viste en betydelig grad af lighed med flere ikke-BORIS proteiner, herunder flere involveret i de processer af transkription eller translation (Fig. S2). Denne nyligt anerkendte formodede domæne er en tidligere ukarakteriseret komponent af en kendt helicase-lignende domæne (COG0553). Yderligere analyser af alternative 3’UTRs af nogle isoformer afslørede tilstedeværelsen af ​​specifikke repetitive DNA-elementer. For eksempel kan en del af 3’UTR for

B6

C7

isoformer tilhører en Alu-J konsensus. Det 3’UTR af isoform

B1

er også meget repetitiv i menneskelige og primater genomer. Isoformer

C3, B2, B3, C4, C5

, og

C8

har primat-specifikke repetitive DNA element, MER1 [23] i deres 3’UTRs.

Det faktum, at

er BORIS

isoformer bevaret i andre arter antyder deres biologiske betydning. For eksempel, alle funktioner i menneskelig

BORIS

isoformer er stærkt konserverede i aberne

Pan troglodytes

og

Macaca mullata,

med bevarede splejsningssites og tilsvarende protein identiteter spænder fra 96 % til 100% og fra 53% til 97%, (fig. 3). Blandt de mest konserverede C-terminale ender er: C95 (med identiteter af 99% og 89% i chimpanse og makakaber, henholdsvis), C97 (97% og 91%), C68 (98% og 96%), C35 (100%, og 97%), og C24 (96% og 96%). C132 er stærkt bevaret i chimpanse (96%), men i mindre grad i makakaber (53%). Mens tilpasning af menneskelige

BORIS

isoformer med musen genomiske locus afdækket flere formodede mus BORIS carboxytermini (C95, C90, C35, og C34), homologiværdierne niveauer var temmelig lav, lige fra 9% til 42% . Dette tyder på, at tempoet i

BORIS

evolution hos pattedyr har været ret hurtige og kompleksiteten af ​​

BORIS

locus sandsynligvis faldt sammen med fremkomsten af ​​primater. Den omstændighed, at musen

Boris

locus har ikke den samme række isoformer som mennesker eller andre primater kan være relateret til primat-specifik udvikling af intronsekvenser af

BORIS

loci [18]. Det er endnu ikke fastslået, om mus har alternative

Boris

isoform arter. Hvis de findes, skal det forventes, at de ville være forskellige fra dem af mennesker trods bevarelsen af ​​splejsningssteder. Fremkomsten af ​​isoformer i primater kan således henføres til formodede intron splejsning forstærkere.

(A) Procent identitet menneske (

H.sapiens

) BORIS isoformer C-termini til formodet alternativ aminosyre sekvenser dem af chimpanse (

P.troglod.

), makak (

M.mulatta

), og mus (

M.mus

.). Eleven alternative C-termini findes i forskellige isoformer er defineret ved antallet af kodoner nedstrøms for den sidste ZF. Tabellen viser navne på BORIS isoformer med tilsvarende C-termini og deres identitet i procent. (B) Tilpasning af BORIS alternative C-termini i menneskelig, chimpanse, makak og mus. De alternative aminosyresekvenser af human, chimpanse, makak og musen er tilpasses ved ClustalW (Vector NTI). Human BORIS splejsningsvarianter er stærkt konserverede i primater, men ikke hos mus. Aminosyresekvenser for nogle af BORIS alternative C-termini (C132, C97, C68, C53, C36, C30, C24) er fuldstændig fraværende i mus. Gul fremhævet sekvenser er 100% identisk med den humane aminosyresekvens; den blå højdepunkt indikerer konservative substitutioner i forhold til humane homologe BORIS sekvenser. Prikker indikerer indsættelser eller sletninger.

Alternative

BORIS

udskrifter er udtrykt i normal mandlige og kvindelige gonader

Vi har tidligere rapporteret, at ekspressionen af ​​

BORIS B0

i normale humane væv blev begrænset til testikel [2]. At analysere mønstre af

BORIS

isoform udtryk i testiklerne, vi designet en serie af primere og Taqman sonder til at forstærke de alternative udskrifter ved QRT-PCR. Kun 8 af 23

BORIS

isoformer kan specifikt diskrimineret af QRT-PCR, fordi de fleste isoformer deler sekvenser, hvilket gør det umuligt at designe primere og prober, der ville opdage hver

BORIS

isoform som en selvstændig art . Derfor er vi operationelt opdelt de 23 isoformer i seks underfamilier (SF1 til SF6) baseret på deres unikke 3′-terminale sekvenser, som blev anvendt til at designe 6 Taqman prober til QRT-PCR (fig. 2A, materialer og metoder). Blandt 13 voksne og 13 fostervæv testet, blev ekspression af de seks

BORIS Salg underfamilier kun detekteret i voksen testikel og i embryonisk ovarie, men de relative niveauer af isoform-ekspression var reproducerbart forskellige i de to væv (fig. 4A , B). I voksen testikel blev alle seks underfamilier udtryk på sammenlignelige niveauer, med SF1 er den mest udbredte gruppe, udtrykt ved ca. 1,3-til tre gange højere niveauer end de andre fem underfamilier (fig. 4A). I modsætning hertil SF3 var den mest udbredte form i embryoniske ovarier (fig. 4B), der udtrykkes i niveauer ca. 4 gange højere end SF1 og SF4, og 11- til 127-fold højere end SF6, SF2, og SF5 grupper ( fig. 4B). Mens der blandt voksne væv kun testikel var stærkt positiv for

BORIS

isoformer, de blev udtrykt ved meget lave omend reproducerbare niveauer i flere væv hos fostret panel, herunder testis, hud og milt (fig. 4B). Dette antyder, at

BORIS

isoformer kan være funktionelt aktiv uden for kimcellelinje under fosterudviklingen.

QRT-PCR-analyse af

BORIS

isoform udtryk i normalt voksent menneske (A) og føtale (B) væv, henholdsvis blev kvantificeret ved den absolutte kvantificering tilgang. Den 23

BORIS

isoformer blev inddelt i 6 underfamilier baseret på deres unikke 3 ‘ende sekvenser til at gøre udformningen af ​​Taqman sonder (Materiale og metoder). (C)

BORIS

isoform udtryk i human normal voksen testikel analyseret af

in situ

hybridisering, RNA FISH. For FISH analyser, de prober til seks

BORIS

underfamilier (SF1-SF6) blev mærket med digoxygenin-11-dUTP ved PCR og individuelt hybridiseret til humant testikel voksen formaldehyd-fikseret. Objektglassene blev inkuberet med anti-DIG-antistoffer natten over og derefter visualiseret med rhodamin-konjugeret sekundært antistof. At identificere spermatogonier og spermatocytter, udførte vi immunfarvning med antistoffer mod SCP3 (rød) og E-cadherin (lysegrøn) hhv. Flettede billeder af DAPI-farvede kerner (blå) og

BORIS

isoform RNA (rød) taget med 20x forstørrelse; højere forstørrelse billeder er 63X. Pile med bogstaver angiver: Sg-spermatogonier, Sc – spermatocytter, St – spermatider (små, aflange celler med aflange kerner, henholdsvis). Styringen (CTR) er farvning med rhodamin-konjugeret sekundært antistof alene.

For at identificere de specifikke celletyper, der udtrykkelig

BORIS

isoformer i voksen testikel, vi gennemførte RNA

in situ

hybridisering ved hjælp af faste præparater af normal menneskelig testis. Immunfarvning af testis med antistoffer mod SCP3 og E-cadherin blev anvendt til at skelne spermatogonier og spermatocytter, hvorimod spermatider blev identificeret morfologisk som små og aflange celler med aflange kerner (fig. 4C, E-cad, SCP3). Efter hybridisering med seks mærkede PCR-prober designet til specifikt at detektere hver af de seks

BORIS

underfamilier, en isoform transkripter blev påvist på næsten alle stadier af spermatogenese (fig. 4C). Alle seks

BORIS

udskrift underfamilier var mindre rigelige i cytoplasmaet i spermatogonier end spermatocytter, mens spermatider var meget positivt for

BORIS

SF2 og marginalt positiv for SF5 og SF6. Således SF2, SF5 og SF6 synes at karakterisere de senere faser af spermatogenesen fra spermatocytter til spermatider. En tidligere undersøgelse [2] med kylling anti-BORIS-antistof og et 5′-endemærket

BORIS

probe, både specifik for N258 terminus, viste, at ekspression af

BORIS B0

isoform var begrænset primært til spermatocytter. Den nuværende arbejde supplerer vores tidligere vurdering af

BORIS

udskrift lokalisering ved at give bevis for ekspression af alle seks

BORIS

underfamilier i voksent menneske testikler. Den tilsyneladende forskellen udtryk for individuelle underfamilier under progression fra tidlig til senere faser af spermatogenesen indikerer, at ekspressionen af ​​

BORIS

isoformer er udviklingsmæssigt reguleret.

BORIS

isoformer indkode formodede kræft -testis antigener

Tidligere undersøgelser viste, at

BORIS B0

isoform er unormalt udtrykkes i mange typer af humane kræftformer, herunder både primære kræftformer og kræft cellelinjer, kvalificere den som koder for en formodet kræft- testis antigen (CTA) [6], [8], [24], [25], [26]. For at forstå relevansen af ​​den nyopdagede multipel

BORIS

isoformer til kræft udviklingen og progressionen testede vi NCI-60 cancercellelinje panel ved RT-PCR og fandt, at omkring 70% af disse cellelinier udtrykte transkripter af nogle isoformer (fig. 5A). De fleste af de positive linjer, udtrykte imidlertid niveauer af

BORIS

transkripter, der var ganske lav ved mindre end 500-1,500 transkripter pr 50 ng totalt RNA. Alligevel var niveauerne tilstrækkeligt til at påvise to forskellige mønstre af

BORIS

isoform-ekspression. Den første mønster, eksemplificeret i figur 5B for K562-cellelinje, var forbundet med mere end 20.000

BORIS

udskrifter (summeret over alle seks

BORIS

underfamilier) pr 50 ng total RNA. I denne undergruppe af cellelinjer (8 ud af 60, 13% af NCI-60 panel), SF1 udskrifter var til stede på højeste niveau, i gennemsnit omkring 3 gange højere end niveauet for SF2, 10 gange højere end for SF3 og SF4, 50 gange højere end for SF6, og mere end 100 gange højere end for SF5 (fig. 5B). Cellelinierne viser dette ekspressionsmønster stammede fra forskellige væv, herunder ovarie, lunge, bryst, blod og hud, hvilket indikerer, at ekspression af

BORIS

isoformer er ikke specifikt forbundet med kræft i bestemte oprindelser.

(A)

BORIS

underfamilier er signifikant opreguleret i kræftceller i forhold til normale celler. For normale celler (N) – udtryk for

BORIS

isoformer blev analyseret i 13 væv og 4 primære cellelinjer. For tumorceller (T) – blev analyseret NCI-60 cancercellelinier. 59 i NCI-60 cancercellelinier blev 13 normale væv, og 4 normale primære cellelinjer analyseret ved den absolutte kvantificering tilgang med normalisering til GAPDH niveauer, og afbildet under anvendelse af en logaritmisk skala. Niveauer af

BORIS

isoform udtryk variere meget (fra 0 til 60000 udskrifter pr 50 ng total RNA). Røde streger angiver middelværdier for hver

BORIS

underfamilie. (B) Den første mønster af

BORIS

isoform-ekspression i NCI-60 cancerceller, som repræsenteret ved K562 cancercellelinie. (C) Det andet mønster af

BORIS

isoformer ekspression i NCI-60 panel eksemplificeres ved OVCAR3 cancercellelinie. (D-J)

BORIS

isoformer udtryk analyseret af RPA. Portioner af total RNA opnået fra nyre, testikel og K562 cellelinien blev hybridiseret med

32P-mærket antisense RNA-prober. RNAse beskyttede fragmenter (pilespidser) blev kun detekteret i testis og K562, men ikke i nyrerne. Den første bane på hver gel er en kontrol, en ufordøjet sonde inkuberes med gær-RNA. (D) RPA med riboprobe SF1 /SF5 giver 154 bp og 40 bp fragmenter, svarende til SF1 og SF5 hhv.