PLoS ONE: NDST4 er en roman Candidate tumorsuppressorgen på kromosom 4q26 og dets genetiske Loss forudser Adverse Prognose i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Genomisk sletning ved tumor suppressor loci er en fælles genetisk afvigelse i humane kræftformer. Undersøgelsen havde til formål at udforske kandidat tumorsuppressorgener på kromosom 4q25-q28.2 og at afgrænse nye prognostiske biomarkører forbundet med kolorektal cancer (CRC).

Metoder

Sletning kortlægning af kromosom 4q25-q28 0,2 blev gennemført i 114 sporadisk CRC ved tab af heterozygositet studie med 11 mikrosatellitmarkører. En roman kandidat tumorsuppressorgen, nemlig

NDST4

, blev identificeret ved 4q26. Genekspression af

NDST4

blev undersøgt i 52 par af primære CRC væv ved kvantitativ revers transkription-polymerasekædereaktion. Allelisk tab af

NDST4

genet blev yderligere bestemt i 174 colorektale carcinomer ved tab af heterozygositet analyse, og derefter blev bedømt for klinisk relevans.

Resultater

En minimal deletion region var afgrænset mellem D4S2297 og D4S2303 loci på 4q26, hvor

NDST4

var det eneste gen, som markant var blevet nedreguleret i CRC tumorer. Ved hjælp af laser capture mikrodissektion,

NDST4

RNA-ekspression blev påvist i colon epitelceller, men kunne ikke påvises i tumorceller. I alt 30 (57,7%) af 52 kolorektale karcinomer viste en dramatisk reduktion i

NDST4

genekspression sammenlignet med matchede normale slimhinder. Den genetiske tab af

NDST4

var signifikant associeret med fremskreden patologisk stadium (

P =

0,039) og dårligere samlet overlevelse af patienter (

P =

0,036).

konklusioner

NDST4

gen er en ny kandidat tumorsuppressorgen i human cancer, og tabet af dens funktion kan være involveret i CRC progression. Hertil kommer, at tabet af heterozygositet assay, som blev etableret for at bestemme allele tab af

NDST4

gen, kunne være et omkostningseffektivt redskab til at give en nyttig biomarkør for negativ prognose i CRC.

Henvisning: Tzeng ST, Tsai MH, Chen CL, Lee JX, Jao TM, Yu SL, et al. (2013)

NDST4

er en roman Candidate tumorsuppressorgen på kromosom 4q26 og dets genetiske Loss forudser Adverse Prognose i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (6): e67040. doi: 10,1371 /journal.pone.0067040

Redaktør: Ludmila Prokunina-Olsson, National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA

Modtaget: Januar 24, 2013; Accepteret: 13. maj 2013; Udgivet: 25 juni 2013

Copyright: © 2013 Tzeng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev støttet af tilskud fra National Science Rådet, Executive Yuan (NSC99-2320-B-002-020-MY3), kardinal Tien Hospital (CTH-93-1-2A01), og National Health Research Institutes (NHRI-EX101 -10136BI), Taiwan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige årsager til kræftdødsfald i hele verden, og de fleste tumorer opstår sporadisk ved en kombination af diskrete mutationer og kromosomale ændringer [1] – [3]. Trods aggressive operationer suppleret med forskellige adjuverende behandlingsformer og en øget forståelse af de genetiske mekanismer bag denne lidelse, har der været en lille forbedring i overlevelsen af ​​patienter med invasiv CRC [4], [5]. Selvom histopatologiske funktioner og iscenesættelse på tidspunktet for præsentationen er fortsat de vigtigste prognostiske indikatorer, mange patienter med lignende patologiske træk vise betydeligt forskellige kliniske resultater [6]. Derfor kan anvendelsen af ​​følsomme genetisk analyse være nyttige til identifikation af højrisikopatienter og derefter for stratificering udformningen af ​​adjuverende behandling. Derudover kan en bedre forståelse af de molekylære mekanismer involveret i kolorektal tumorigenese give nye biomarkører for de potentielle mål for terapeutisk intervention og prognostiske indikatorer for kirurgisk indgreb [7].

Kromosomal ustabilitet er den mest almindelige genetiske afvigelse i sporadisk CRC [8], [9]. Betydelige undersøgelser har afsløret, at allele tab på flere områder af kromosom 4 er forbundet med fase progression, tumormetastase, og kortere overlevelse i mange humane cancere, indikerer tilstedeværelsen af ​​en eller flere tumorsuppressorgen (GTS) loci [10] – [15 ]. Imidlertid har nogle GTS’er på kromosom 4 involveret i CRC patogenese blevet identificeret. Vi har for nylig udført sletning kortlægning af kromosom 4 ved tab af heterozygositet (LOH) undersøgelse, og identificeret D4S402 locus på 4q27 der udstillet den højeste allel tab frekvens på 32,5% i 106 sporadisk CRC (vores upublicerede data). I den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at undersøge CRC-associerede GTS i det tilstødende område af D4S402. blev gennemført to tilgange: (1) fine sletning mapping på kromosom 4q25-q28.2 at afgrænse området huser GTS, og (2) analyser af ændringer (genekspression og allel tekst udgår) kandidatlandenes GTS i ubearbejdet CRC tumorer. Desuden blev den genetiske tab af kandidat GTS vurderet for klinisk relevans.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

I alt 174 patienter med sporadisk CRC, der blev opereret på Cardinal Tien Hospital, Taiwan, blev rekrutteret mellem august 1997, og december 2008 (tabel 1). Follow-ups blev udført indtil april 2010. Alle 174 patienter blev opereret for histologisk verificeret kolorektal adenocarcinom uden præoperativ kemoterapi og /eller strålebehandling. Både parrede tumor og tilstødende normale mucosa-prøver blev indsamlet fra hver patient under kirurgi. Desuden blev adenomatøse polypper væv indsamlet fra 57 patienter, som gennemgik coloskopisk polypectomi. Alle vævsprøver blev straks frosset efter resektion og opbevaret i flydende nitrogen indtil nukleinsyre ekstraktion. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke, og undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen og godkendt af Institutional Review Board of Cardinal Tien Hospital, Taiwan.

LOH Analyse

DNA blev ekstraheret fra frosne væv ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). For fine deletion kortlægning af kromosom 4q25-q28.2 (12,9 cm), LOH undersøgelse med et panel af 11 mikrosatellitter blev udført i 114 par af CRC tissue DNA (figur 1A og tabel 2). For yderligere at bestemme allele tab af

NDST4

gen, LOH studie med to mikrosatellitmarkører, MS5850 (UniSTS: 536617) og D4S1580, blev gennemført i 174 CRC tilfælde (figur 1A og tabel 2). I hvert primerpar blev den fremadrettede primer syntetiseret med 6-FAM, VIC eller NED fluorescerende mærke afhængigt af amplikonstørrelse. PCR-amplifikation blev udført i et slutvolumen på 6 pi ved anvendelse af 20 ng DNA, 500 nM af hver af respektive primere, 200 uM af hver dNTP og 0,3 enheder af AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems). PCR blev udført under følgende cyklusbetingelser: En på forhånd PCR inkubationstrin ved 95 ° C i 15 minutter; efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 45 s og 72 ° C i 30 s; og en endelig udvidelse ved 72 ° C i 10 min. De amplificerede fragmenter blev separeret i 6% denaturerende polyacrylamidgeler på en ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) som beskrevet i producentens instruktioner. Normale og tumor-DNA-par blev sammenlignet for ændringer i antallet af allele toppe og tophøjden for hver markør ved hjælp af GeneScan Analysis software (Applied Biosystems). Den LOH indeks for hver normale og tumor-DNA par blev beregnet som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt blev forholdet af allelen tophøjder beregnet for hver tumorprøve divideret med allelen tophøjde mellem den normale tilsvarende kontrolgruppe. En LOH indeks på ≤0.67 eller ≥1.5, repræsenterer mindst et 33% fald af en tumor allel, var tegn på allel tab.

A. Mikrosatellitmarkører anvendes til tab af heterozygositet undersøgelse. Tre gener er placeret i den minimale sletning region afgrænset af D4S2297 og D4S2303. Sorte søjler angiver

UGT8

og

NDST4

gener.

miR-577 Hotel (

MIR577

) ligger i intron af

UGT8

. B. Analyse af

UGT8

og

NDST4

mRNA’er i tumorer (T) og matches normal slimhinde (N) af CRC væv ved RT-PCR.

β-actin-

blev anvendt som en intern RNA kontrol. C. Analyse af

miR-577

udtryk i CRC væv ved QRT-PCR. Ekspressionsniveauerne af tumorer blev normaliseret til de af tilsvarende normale slimhinder. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD.

RNA Extraction

Total RNA blev ekstraheret fra de frosne væv og 10 CRC-cellelinjer (Colo205, HCC2998, HCT116, HCT15, HT29 , KM12 og SW620 fra det amerikanske National Cancer Institute, LoVo, SW48, og SW480 fra Bioresource Indsamling og Research center, Taiwan) ved hjælp TRIzol reagens (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Koncentrationen og renheden af ​​RNA blev bestemt med et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific), og RNA integritet blev bekræftet ved agarosegelelektroforese.

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Ti tilfældigt udvalgte CRC tilfælde blev anvendt i en pilotundersøgelse for genekspression. Komplementær DNA (cDNA) blev revers-transkriberet fra totalt RNA (2 pg /20 pi reaktion) ved anvendelse af High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Revers transkription blev udført under følgende betingelser: 25 ° C i 10 minutter, 37 ° C i 2 timer, og 85 ° C i 5 minutter. Det resulterende cDNA blev fortyndet 5 gange med diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandlet H

2O. Genspecifikke primersæt designet udspændende exoner var som følger:

NDST4

fremadrettet 5′-TCTGGGAGTTACACCTCG-3 ‘og revers 5′-TCTTGAGAGGCTTAGTTCTTG-3’;

UGT8

frem 5′-TTATATTATTCGTCACAATGG-3 ‘og omvendt 5′-AAAACTAAGGTCTGACACAGT-3’;

β-actin

frem 5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3 ‘og omvendt 5’-TCATCTTCTCGCGGTTGG -3 “. PCR-amplifikation blev udført i et endeligt volumen på 25 pi ved anvendelse af 2,5 pi fortyndet cDNA, 1 uM af hver af respektive primere, 250 pM af hver dNTP og 1 enhed af Super-Therm Gold DNA Polymerase (Bertec Enterprise). PCR blev udført under følgende cyklusbetingelser: En på forhånd PCR inkubationstrin ved 95 ° C i 10 min; 36 (

NDST4

og

UGT8

) eller 28 (

β-actin

) cykler af 95 ° C i 15 s, 55 ° C i 45 s, og 72 ° C i 45 s; efterfulgt af en endelig udvidelse ved 72 ° C i 3 minutter. De forstærkede fragmenter blev analyseret ved agarosegelelektroforese.

Kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR)

Til kvantificering af

NDST4

RNA udtryk i 52 par af primær CRC væv og 57 polypper, en TaqMan Gene Expression Assay (Hs00224024_m1, Applied Biosystems) blev anvendt med en reference gen

TBP

(TATA box-bindende protein, Hs00920497_m1) som en kontrol for RNA kvalitet og kvantitet. CDNA’et blev syntetiseret som nævnt i RT-PCR sektion. Kvantitativ PCR-data blev taget til fange af en ABI PRISM 7000 Sequence Detection System og analyseret af ABI PRISM 7000 SDS Software (Applied Biosystems). Reaktionsblandingen omfattede 5 pi af den fortyndede cDNA, 1 pi af en hydrolyseprobe blanding, 10 pi TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems), med tilsætning af DEPC-behandlet H

2O til et endeligt volumen på 20 pi . Reaktionerne blev udført i to eksemplarer på følgende cykliseringsbetingelser: et inkubationstrin ved 50 ° C i 2 min; og et enzym aktiveringstrin ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. Ekspressionsniveauerne af

NDST4

i tumorer, normale slimhinder og polypper blev normaliseret til den enkelte henvisning genet,

TBP

. Tumor-til-matched-normal-mucosa-forhold på

NDST4

RNA ekspression blev beregnet ved hjælp af sammenlignende Ct-metoden, 2

-ΔΔCt [17]. De relative ekspressionsniveauer af

NDST4

i CRC-cellelinjer blev sammenlignet med en gennemsnitlig udtryk for 52 normale slimhinder, som blev justeret til 1.

microRNA 577 Expression Analysis

til kvantificering af

microRNA 577 Hotel (

miR-577

) udtryk i 10 par tilfældigt udvalgte primære CRC væv, blev små RNA udvundet ved hjælp af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion) i henhold til producentens anvisninger. CDNA templates blev fremstillet fra total RNA ved hjælp af TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), som anvender hårnåle-reverse primere. Kort fortalt blev 10 ng af total RNA blandet med 0,8 pi af hårnåle-RT-primere, 0,15 pi 100 mM dNTP, 1,5 pi 10 x RT-puffer, 0,2 pi RNase inhibitor (20 U /pl) og 1,0 pi MultiScribe revers transkriptase (50 U /pi). Blandingen (slutvolumen, 15 pi) blev inkuberet ved 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 30 minutter, 85 ° C i 5 minutter, og derefter holdt ved 4 ° C. Efter RT, cDNA produkter, ud over de TaqMan-primere og prober, blev blandet med de øvrige PCR-reagenser i PCR Universal Master Mix Kit (Applied Biosystems), og qPCR blev udført i tre eksemplarer på ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. PCR-betingelserne omfattede indledende inkubering ved 50 ° C i 2 minutter og denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 s og 60 ° C i 1 min. De anvendte primere til

miR-577 Hotel (del nummer 4.408.995) og

RNU6B

(RNA, U6 lille nukleare 2, 4.373.381) blev købt fra Applied Biosystems. Som en endogen kontrol,

RNU6B

blev opformeret parallelt, og Ct-værdi på

miR-577

blev normaliseret til den for

RNU6B

. Ekspressionsniveauerne af tumorerne blev sammenlignet med matchede normale slimhinder, som blev justeret til 1.

Laser Capture mikrodissektion

For at bekræfte

NDST4

RNA udtryk i bestemte celletyper af primære CRC væv, colorektalt carcinom og epitelceller fra den matchede normale slimhinde blev indsamlet fra to CRC tilfælde, samt mucosa-associeret lymfoide celler blev opsamlet fra den tredje normale vævssnit. Frosne sektioner blev fikseret og farvet ved hjælp af HistoGene LCM Frozen Section Farvning Kit (Arcturus Engineering). Celler blev isoleret ved at udføre laser capture mikrodissektion med AutoPix Automated Laser Capture microdissection System (Arcturus Engineering). Efter mikrodissektion blev cellerne fanget på låget straks inkuberet med en ekstraktionsbuffer, og totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af PicoPure RNA Isolation Kit (Arcturus Engineering), ifølge producentens instruktioner.

Statistisk analyse

Sammenhængen mellem allele tab af

NDST4

gen og klinisk-patologiske variabler blev analyseret af Students

t

-test (for alder), lineær-by-lineær association chi-square test ( for Dukes ‘stadier) eller Pearson chi-square test (for andre kategoriske variabler). En to-sidet

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Overlevelse tid blev betragtet intervallet mellem kirurgi og datoen for den sidste opfølgning eller død sygdom (samlet overlevelse, OS), eller datoen for den sidste opfølgning eller fornyet (sygdomsfri overlevelse, DFS). Overlevelseskurver, der anslås med Kaplan-Meier-metoden, blev sammenlignet ved log-rank test. Alle statistiske analyser blev udført med IBM SPSS-software version 17.0.

Resultater

NDST4 Gene er en kandidat tumorsuppressorgen på kromosom 4q26

I alt 114 par primære CRC væv blev anvendt til at bestemme den minimale deletionsregion på kromosom 4q25-q28.2 ved hjælp LOH analyse. Halvtreds (43,9%) af de 114 tumorer udviste LOH ved et eller flere mikrosatellitmarkører. Hyppig LOH, defineret som forekommende i mere end 30% af informative tumorer, blev observeret i fire loci, herunder D4S2297, D4S2303, D4S402, og D4S2394. Derfor blev en minimal sletning region med en genetisk længde på 1,4 Mb derefter afgrænset mellem D4S2297 og D4S2303, der var involveret i 80,0% (40/50) af tumorer med LOH. Resultaterne demonstrerer en høj frekvens af kromosom 4q26 tab i kolorektale karcinomer, og afsløre en formodet TSG locus involveret i CRC udvikling.

Ved at søge i National Center for Biotechnology Information (NCBI) database, kun to protein-kodende gener,

UGT8

og

NDST4

, samt en microRNA,

miR-577

, viste sig at være placeret i det afgrænsede minimal sletning region. Udtrykket af

UGT8

,

NDST4

, og

miR-577

blev screenet i 10 par tilfældigt udvalgte primære CRC væv ved RT-PCR eller QRT-PCR (figur 1B og 1C). Ekspressionsniveauerne af

UGT8

og

miR-577

i de testede tumorer var foreneligt med deres tilstødende normale slimhinder. Resultaterne viste, at

NDST4

genekspression blev åbenbart faldet i seks af 10 tumorer. Resultaterne tyder på, at

NDST4

kan være en roman TSG placeret i region 4q26, som ofte slettet i CRC.

NDST4 gen udtrykkes i Normal Colon slimhinder og Polypper, men nedreguleres i Kolorektal carcinomer

Colorectal carcinoma stammer fra colon mucosa gennem akkumulering af genetiske ændringer. Som kandidat for CRC-associeret TSG,

NDST4

bør udtrykkes i colon epitel. Derfor blev laser capture microdissection udført for at isolere forskellige celletyper i vævssnit, herunder epitel- og lymfoide celler med normal slimhinde, så vel som tumorcellerne af CRC og derefter

NDST4

ekspression blev bestemt ved QRT -PCR (figur 2). Resultaterne viste, at

NDST4

mRNA var påviselige i epitelceller fra begge tilfælde af normal slimhinde, men hverken i deres parrede tumorceller eller i lymfoide celler, selv efter 45 cykler af PCR-amplifikation. For at fastslå nedregulering af

NDST4

udtryk i CRC, vi yderligere analyseret 52 par af primære væv. Ifølge Knudson to-hit hypotese kan en funktionel kopi af et GTS bidrage til delvis genekspression [18]. Derfor er en 0,25-gange fald blev defineret som grænsen af ​​signifikant nedregulering. I alt 30 tumorer (57,7%) viste en tydelig nedgang i

NDST4

ekspression, sammenlignet med deres matchet normal slimhinder (figur 3A). Desuden

NDST4

genekspression blev også bestemt i 57 adenomatøse polypper. I modsætning til CRC tumorer, hvor

NDST4

udtryk blev reduceret betydeligt, de adenomer viste et tilsvarende niveau for udtryk som normalt slimhinder (figur 3B). Desuden studerede alle 10 CRC cellelinjer udtrykte ekstremt lave eller ikke-detekterbare niveauer af

NDST4

mRNA (figur 3C). En dramatisk reduktion af

NDST4

udtryk i CRC fastholder, at

NDST4

er en ny kandidat GTS, og at tabet af dens funktion kan spille en rolle i kolorektal tumorigenese.

EN. Laser capture microdissection forskellige celletyper fra CRC tumor og matchede normale slimhinde sektioner. Repræsentative billeder af HistoGene-farvede objektglas før og efter laser capture mikrodissektion vises. B. og C. QRT-PCR-analyse af

NDST4

og

TBP

udtryk i de opfangede celler.

TBP

blev anvendt som en intern RNA kontrol. Rn, normaliseret reporter signal.

A. Sammenligning af

NDST4

ekspression mellem tumor og matchet normal slimhinde i 52 par af CRC væv ved QRT-PCR. Den relative ekspression (Tumor /Normal) i hvert tilfælde er angivet med en kolonne. B. nedregulering af

NDST4

udtryk i CRC tumorer, men ikke i adenomatøs polypper.

NDST4

udtryk i forhold til en intern kontrol,

TBP

, er illustreret via boksen plot analyse. De whiskers betegne intervallet mellem 5

th og 95

th percentiler. En væsentlig forskel mellem grupperne blev testet af Students

t

-test (parret, tumor

vs

slimhinde,.-Parret, slimhinder

vs

polyp.). N. S., ikke signifikant. C. Nedregulering af

NDST4

ekspression i alle 10 humane CRC cellelinier testet. De relative ekspressionsniveauer af CRC-celler blev sammenlignet med den gennemsnitlige ekspression af 52 normal colon slimhinder. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SD.

Allelic Tab af NDST4 Gene er signifikant associeret med Advanced Patologisk Stage and Poor overlevelse i CRC

For at præcist bestemme den genetiske sletning af

NDST4

i CRC, den WebSat, web-software til mikrosatellit markør udvikling, blev anvendt til at identificere korte tandemgentagelser inden

NDST4

gen [19]. En ny markering, MS5850, der er designet i denne undersøgelse, og D4S1580 blev anvendt til LOH analyse i 174 par af primære CRC væv (figur 1A). De korrelationer mellem den genetiske ændring og klinisk-patologiske egenskaber er anført i tabel 1. I alt 53 (30,5%) af de 174 tumorer var positive for allel tab af

NDST4

gen. Den genetiske afvigelse blev øget betydeligt i tumorer med højere patologiske stadier (T3 og T4) (

P =

0,039). Hertil kommer, at selv om det ikke statistisk signifikant, blev en stigende tendens i udviklingen af ​​fjernmetastaser og Dukes ‘stadium (

P =

0,075 og 0,083 henholdsvis). Ikke desto mindre blev den genetiske tab ikke er forbundet med andre klinisk-patologiske træk.

Korrelationen af ​​allele tab af

NDST4

gen med patient overlevelse blev yderligere vurderet. OS-analyse blev udført på 174 patienter, hvoraf OS sats var 67,8% (n = 118) med en gennemsnitlig overlevelse på 94 måneder. Ved at anvende Kaplan-Meier overlevelse kurve analyse allele tab af

NDST4

gen forudsagt en dårligere OS (

P

= 0,036) (Figur 4). Fifty-tre patienter med denne genetiske afvigelse havde en OS på 60,4% og en gennemsnitlig overlevelse på 74 måneder, mens de øvrige 121 patienter havde en OS på 71,1% og en gennemsnitlig overlevelse på 100 måneder. Desuden blev DFS analyse udført på 118 patienter med Dukes ‘stadier B og C, hvoraf den DFS sats var 73,7% (n = 87) med en gennemsnitlig DFS 104 måneder. Ikke desto mindre blev den genetiske funktion ikke er identificeret som en væsentlig indikator for DFS for patientgruppen med Dukes ‘faser B og C.

Kaplan-Meier analyse blev udført for at sammenligne patienter med allel tab af

NDST4

gen til de andre (ingen allelisk tab). Genetisk tab af

NDST4

viser signifikant sammenhæng med dårligere overlevelse (log-rank test).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi identificeret

NDST4

gen som en ny kandidat TSG på kromosom 4q26, som er en almindelig deletion region i CRC. I modsætning til normal colon mucosa med

NDST4

udtryk, et flertal af CRC tumorer og cellelinjer viste en dramatisk reduktion i genekspression. Desuden har vi udviklet et LOH assay med to mikrosatellitmarkører, og afslørede, at den genetiske tab af

NDST4

var signifikant forbundet med fremskreden patologisk stadium og dårlig overlevelse, støtter tumorsuppressorfunktionen af ​​NDST4 i CRC.

på trods af visse molekylære veje ligger til grund for belyst kolorektal tumorigenese, kan forskellige genetiske ændringer resulterer i en bestemt fænotype, der er korreleret med forskellige tumor adfærd og patientresultater [20]. Derfor identifikation af nye molekylære markører er nødvendigt at forbedre strategier for målrettede behandlinger og skræddersyet patientbehandling. I undersøgelsen, vi belyst en minimal sletning region på 1,4 Mb på kromosom 4q26 i sporadisk CRC, i overensstemmelse med den forrige rapport, at frekvensen af ​​allel sletning ved 4q26 blev forøget i kolorektale karcinomer sammenlignet med adenomer [11]. Selvom mange tidligere undersøgelser har antydet kandidat GTS loci på kromosom 4 [14], [15], her identificerede vi, for første gang,

NDST4

gen som en ny kandidat TSG på 4q26. Hertil kommer, fordi LOH på polymorfe loci tillader ekspressivitet af tab af funktion deletion i GTS, denne genetiske undersøgelse har potentiale diagnostisk og prognostisk relevans [21]. Den LOH assay etableret i undersøgelsen kunne være et omkostningseffektivt redskab til at give en nyttig biomarkør for negativ prognose i CRC.

NDST4 er et medlem af N-deacetylase /N-sulfotransferase (heparan glucosaminyl) (NDST ) familie, som er ansvarlig for heparansulfat (HS) biosyntese på et kerneprotein til dannelse heparansulfatproteoglycaner (HSPGs) [22], [23]. HSPGs ubikvitært opholde sig på celleoverfladen, inde i cellen, og i den ekstracellulære matrix [24]. HS kæder af HSPGs interagere med en bred vifte af protein-ligander såsom vækstfaktor familier, og dermed bidrage til vævet struktur og funktion under udvikling og voksne homeostase [25], [26]. Vigtigere er indholdet og fordelingen af ​​HSPGs ændret under tumorigenese, som har været impliceret i positive eller negative aspekter af tumorprogression. F.eks HSPGs funktion som co-receptorer for vækstfaktorer og deres receptortyrosinkinaser at stabilisere signaleringsdata komplekser under tumorproliferation og invasion [27]. I modsætning hertil HSPGs fremme celle-celle og celle-ekstracellulær matrix-interaktioner og opbygge inhibitoriske barrierer for tumorinvasion. Derfor er de reducerede niveauer af HSPGs korrelerer med tumorudvikling [28], [29]. I den foreliggende undersøgelse, den genetiske tab af

NDST4

var signifikant associeret med fremskreden patologisk stadium, som henviser til den lokale tumor dybde invasion i CRC, tyder på, at tab af funktion af

NDST4

gen kan skade modifikation af HS kæder af specifikke HSPGs, hvilket fører til mere invasive tumorceller gennem omformning af interaktionen af ​​celleadhæsionsreceptorer og ligander.

Fire forskellige isoformer af NDSTs er identificeret i hvirveldyr. I modsætning til den universelle genekspression af

NDST1

og

NDST2

,

NDST3

NDST4

udskrifter overvejende udtrykt under fosterudviklingen [30], [31 ]. Imidlertid ekspressionsmønstre for

NDSTs

aldrig blevet illustreret i colon hos mennesket. Brug RT-PCR, fandt vi, at udskrifter af fire

NDSTs

var let påviselige i normal colon mucosa, mens kun

NDST4

udtryk blev nedreguleret i de fleste af de testede CRC tumorer (data ikke vist ). Ifølge den forudsagte struktur af sulfotransferase domæne af NDSTs, kan de fire forskellige isoformer udviser varierende substratspecificiteter [30]. Sheng

et al.

Nylig vist, at NDST1 udføres modifikationen i et stærkt ordnet måde at styre de N-sulfateringsgrupper domæner i HS, hvilket antyder, iværksættes og følges N-sulfatering kan gennemføres ved hjælp af forskellige NDSTs [32]. Med den relativt dårlige deacetylering aktivitet af NDST4 på umodificerede HS kæder, kan NDST4 foretrækker dem med en indledende modifikation af andre isoformer [30]. Desuden NDSTs spille en central rolle i HS biosyntese fordi NDSTs er de første deltagere i den sekventielle modifikation proces [33]. Interessant, fordi NDST4 er den eneste isoform, der var blevet markant nedreguleret i de testede CRC tumorer (vores upublicerede data), de andre tre NDST isoformer synes ikke at kompensere for NDST4 mangel i en kolon-specifik betingelse. HS kæder af HSPGs i colon mucosa kan have unikke modifikation mønstre medieret, i det mindste delvist, ved NDST4 aktivitet. Ændrede HSPGs som følge af tab af funktion af NDST4 kan variere celler og væv arrangement, og derefter fremme CRC patogenese. ændringer i ekspressionen af ​​HS biosyntetiske enzymer kunne imidlertid være relativt forskellige i en cancer-typespecifik måde [34]. Fernandez-Vega

et al.

Rapporterede ganske nylig, at

NDST4

transskription steget i 50% af 23 infiltrerer duktale adenokarcinomer studeret, da det var fraværende i normale bryst væv [35]. Tilsammen er yderligere undersøgelser berettiget til at få indsigt i den rolle, NDST4 i tumorudvikling og progression af humane cancere.

Som konklusion ved afgrænsning en minimal deletion region ved kromosom 4q26, denne undersøgelse er den første til at identificere

NDST4

gen som en ny kandidat TSG i CRC. Derudover genetiske tab af

NDST4

kunne tjene som biomarkør for negative prognose for patienter med CRC. Den LOH assay udformet til at bestemme allele tab af

NDST4

gen i undersøgelsen kan anvendes som en molekylær diagnostisk værktøj til risiko lagdeling i individuelle terapeutiske interventioner.