PLoS ONE: LPA inducerer Colon Cancer Cell Proliferation gennem et samarbejde mellem ROCK og STAT-3 Pathways

Abstrakt

lysophosphatidsyre (LPA) spiller en afgørende rolle i udbredelsen og migration af tyktarmskræft celler; Men de efterfølgende signalering begivenheder bag disse processer forbliver dårligt karakteriseret. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge de signalveje udløst af LPA til at regulere de mekanismer, der er involveret i progressionen af ​​colorektal cancer (CRC). Vi har anvendt tre cellelinje modeller af CRC, og indledende analyseret ekspressionen profilen af ​​LPA-receptorer (LPAR). Derefter behandlede vi cellerne med LPA og begivenheder relateret til deres tumorigent potentiale, såsom migration, invasion, forankringsuafhængig vækst, spredning samt apoptose og cellecyklus blev evalueret. Vi bruges Chip-array teknik til at analysere den globale genekspression profilering, der opstår efter LPA behandling, og vi identificeret celle signalveje relateret til cellecyklus. Hæmningen af ​​disse veje verificeret konklusionerne fra transkriptom analyse. Vi fandt, at cellelinierne udtrykt LPAR1, -2 og -3 i en differential måde, og at 10 pM LPA ikke påvirkede cellemigration, invasion og forankringsuafhængig vækst, men det inducerer proliferation og cellecyklusprogression i HCT-116-celler . Selv LPA i denne koncentration ikke inducerede transkriptionsaktivitet af β-catenin, det fremmet aktivering af Rho og STAT-3. Desuden ROCK og STAT-3-inhibitorer forhindrede LPA proliferation, men ROCK hæmning forhindrede ikke STAT-3-aktivering. Endelig observerede vi, at LPA regulerer ekspressionen af ​​gener relateret til cellecyklus og at den kombinerede inhibering af ROCK og STAT-3 forhindret cellecyklusprogression og forøget LPA-inducerede ekspression af cyclin E1, A2 og B1 i højere grad end enten inhibitor alene. Samlet set viser disse resultater, at LPA øger proliferative potentiale kolon adenocarcinom HCT-116 celler gennem en mekanisme, der involverer samarbejde mellem Rho-ROCK og STAT3 involverede veje i cellecyklus kontrol

Henvisning:. Leve F, Peres- Moreira RJ, Binato R, Abdelhay E, Morgado-Díaz JA (2015) LPA Fremkalde Colon Cancer Cell Proliferation gennem et samarbejde mellem ROCK og STAT-3 Pathways. PLoS ONE 10 (9): e0139094. doi: 10,1371 /journal.pone.0139094

Redaktør: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: Juni 15, 2015; Accepteret: 9. september 2015; Udgivet: 29 September, 2015

Copyright: © 2015 Leve et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) og Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em kræft- INCT (573.806 /2008-0 og 170,026 /2008) til JAMD; og Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) (26/11703/2013) til JAMD

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lysophosphatidsyre (LPA) er et naturligt forekommende bioaktive lysophospholipid stede i de fleste væv og biologiske væsker. LPA kan genereres af både lysophospholipase D (lyso-PLD), såsom autotaxin (ATX) eller via phospholipase A1 eller A2 (PLA1 og PLA2, henholdsvis) [1]. ATX blev først identificeret i malignt melanom som en kemotaktisk faktor nødvendig for melanom invasionsevne [2], ATX /Lyso-PLD er aberrerende udtrykt i mange humane cancere og i inflammatorisk tarmsygdom [1,3]. Desuden blev høje niveauer af LPA fundet i plasma og ascitesvæske af patienter med ovariecancer [4]; På samme måde blev høje niveauer af lysophosphatidylcholin (LPC), en LPA precursor, fundet i plasmaet fra kolorektal cancer (CRC) patienter [5]. Selv om stigningen i LPA-niveauer i væsker fra patienter med CRC er endnu ikke direkte påvist, Lin

et al

. [6] har vist, at oral administration af LPA til Apc

Min /+ mus, som er en model er almindeligt anvendt i CRC, næsten fordoblet antallet af polypper i tarmen. Sammen støtter disse undersøgelser den tanke, at LPA spiller en vigtig rolle i CRC patologi, som er den tredje hyppigste kræftform hos mænd og den næsthyppigste hos kvinder over hele verden [7].

Via dets binding til specifikke G -protein-koblede receptorer (GPCR), LPA medierer mange biologiske reaktioner i kræft. I CRC celler, LPA øger spredning [8], apoptose beskyttelse [9], migration [10] og tilpasning til hypoxi [11]. Det er godt accepteret, at den cellulære respons på LPA afhænger ekspressionsmønsteret for LPA-receptorer (LPARs), fordi det varierer meget mellem forskellige væv og celletyper. Der er i øjeblikket seks anerkendte LPARs, LPA

1-6, der er overudtrykt i forskellige typer af kræft, herunder CRC [12,13,14]. Blandt disse LPARs, de klassiske kendte LPARs, LPA

1-3, tilhører den endotelcelle differentiering genet (EDG) familie af GPCR’er og er blevet beskrevet at regulere forskellige adfærd i CRC-celler. For eksempel ved anvendelse af specifik RNA-interferens, blev det vist, at LPA

2 og LPA

3, men ikke LPA

1 er mål for LPA-inducerede proliferation af HCT-116 og LS174T [8]. Endvidere blev det vist, at LPA

1 medierer LPA-stimuleret celle spredning af DLD-1-celler ved anvendelse af en shRNA-lentivirus-system [15]. Desuden LPA

3 knockdown øger migration og invasion af HCT-116 celler [16].

LPARs udløse en række nedstrøms signalveje. Det er veletableret, at LPA producerer Rho-afhængige cytoskeletale reaktioner såsom stress fiber dannelse [17], som er strukturer relateret til celle migration. Faktisk viste vi, at i Caco-2-celler, LPA-induceret cellemigration er Rho-ROCK afhængig [10]. Desuden blev Rho-ROCK signalering også rapporteret at spille en rolle i reguleringen af ​​celledeling [18]. Selv om nogle undersøgelser allerede har vist, at LPA stimulerer spredning af tyktarmskræft celler såsom HCT-116 og SW480 [8,19], Rho-ROCK signalering deltagelse i denne begivenhed blev ikke behandlet.

Signalet transducer og aktivator af transkription 3 (STAT-3) er en transkriptionsfaktor involveret i tumorigenese processer. Konstitutiv STAT-3-aktivering er forbundet med forskellige humane cancere og almindeligt antyder dårlig prognose [20]. Det blev tidligere vist, at ROCK stimulerer STAT-3 aktivering via Janus kinase 1 (JAK 1); STAT-3 og JAK 1 samarbejder for at styre actomyosin kontraktilitet at mægle den afrundede amoeboid migration i melanom celler [21]. Desuden blev det observeret, at LPA inducerer cellemotilitet gennem STAT-3 phosphorylering i ovariecancerceller [22]. Interessant er STAT-3 phosphorylering impliceret i HCT-116 colon cancer cellevækst [23]. Ikke desto mindre er det uvist, om LPA aktiverer STAT-3 i CRC celler eller forårsager aktivering af Rho-ROCK deltagelse i denne signalvej.

Således er formålet med denne undersøgelse var at analysere den rolle, som LPA spiller i forskellige biologiske processer i CRC progression, såsom migration, invasion og spredning, og til at bestemme mekanismerne bag disse begivenheder. Her viste vi, at LPA øger HCT-116 celledeling gennem en kaskade, der integrerer RhoA-ROCK og STAT-3 signalering til at styre cyklin udtryk og cellecyklusprogression.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

L-α-lysophosphatidsyre (oleoyl natrium kat nr L7260..), kanin-anti-LPA

1 (N-terminal;. kat nr SAB4500689), kanin-anti-LPA

2 (kat. nr. HPA019616), kanin-anti-LPA

3 (kat. nr. HPA013421), anti-cyclin B1 (kat. nr. SAB4503501), 40,6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI ;.. Cat nr 32.670) og peberrodsperoxidase-konjugeret gede-anti-kanin og anti-muse-IgG blev opnået fra Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Kanin monoklonalt anti-STAT-3 (kat nr 9139..), Muse monoklonalt anti-phospho-STAT3 (pTyr 705;.. Kat nr 9131), kanin-polyklonalt anti-α tubulin (kat nr 2144..), Kanin monoklonale anti -GSK-3β (kat nr 9315.), anti-phospho-GSK-3β (pSer9;.. kat nr 9336)., muse monoklonalt anti-β-catenin (.. kat nr 9582) og anti-GAPDH (kat . 2118) blev købt hos Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). STA-21 ((S) -Ochromycinone deoxytetrangomycin;.. Kat sc-200.757), anti-cyklin A2 (.. Kat sc-596) og muse anti-cyclin E1 (.. Kat sc-247) blev erhvervet fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Alexa 488-konjugeret sekundært antistof (kat. Nr. A11008) blev opnået fra Molecular Probes (Eugene, OR, USA). Y-27632 ((R) – (+) – trans-N- (4-pyridyl) -4- (1-aminoethyl) cyclohexancarboxamid;. Kat US1688000). Blev indkøbt fra Calbiochem EMD Millipore (Darmstadt, Tyskland)

Cell kultur og LPA behandlinger

de humane kolorektal adenocarcinom cellelinjer Caco-2 (HTB-37TM) og HT-29 (HTB-38TM), den humane kolorektal carcinom cellelinie HCT-116 ( CCL-247TM) og ovarie cancercellelinie Ovcar-3 (HTB-161) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). Tyktarmskræft celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), penicillin G (60 mg /l) og streptomycin (100 mg /l) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 /luft. Cellerne blev passeret ugentligt med 0,05% trypsin /0,02% EDTA i PBS-opløsning. Ovarie adenocarcinoma celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI 1640) (Sigma-Aldrich), der blev suppleret med 20% FBS, penicillin G (60 mg /l) og streptomycin (100 mg /l) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 /luft. Caco-2-celler har en differentieret fænotype, når de danner et konfluent monolag, med lav invasiv og metastatisk potentiale; HT-29-celler er moderat differentieret, mens HCT-116-celler har en udifferentieret fænotype og høj tumorigene potentiale. Så disse celler repræsenterer forskellige stadier af CRC progression. Cellekulturerne blev skiftet til serum-frit medium i 24 timer forud for 10 uM LPA behandling, som tidligere rapporteret [10].

Selektive farmakologiske inhibitorer blev tilsat til cellekulturerne 1 time før LPA behandling og var til stede under hele behandlingen som angivet. Inhibitorerne blev fortyndet i DMSO og opbevaret ved -20 ° C. Hver koncentrerede opløsning fortyndes umiddelbart før anvendelse for at give endelige koncentrationer på 10 uM Y-27632 (ROCK) og 10 uM STA-21 (STAT-3).

Western-blot-analyse

behandlede celler blev homogeniseret i lyseringspuffer (1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,2% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM Hepes, pH 7,4) indeholdende 20 mM NaF, 1 mM orthovanadat, og en proteaseinhibitorcocktail (Sigma, MO, 1: 100 fortynding) i 30 minutter ved 4 ° C. De homogeniserede lysater blev underkastet centrifugering ved 10.000 g i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanterne blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C til efterfølgende analyse. Lige store mængder protein (30 til 60 ug /bane), kvantificeres ved BCA protein assay kit (BioRad, Hercules, CA, USA), blev fremstillet ved kogning efter tilsætningen af ​​denaturering prøvepuffer; de blev elektroforetisk adskilt ved SDS-PAGE på 7,5, 10 eller 12% geler og overført til nitrocellulosemembraner under anvendelse af en halvtør overførsel celle (BioRad) ved 10 V i 60 min. Membranerne blev blokeret i 1 time med TBS-T (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 137 mM NaCl og 0,1% Tween-20) indeholdende 5% fedtfattig tørmælk eller med 1% BSA (Sigma); de blev inkuberet natten over med følgende primære antistoffer: anti-LPA

1 (1: 500), anti-LPA

2 (1: 500), anti-LPA

3 (1: 500), anti -α-tubulin (1: 1000), anti-GAPDH (1: 3000), anti-β-catenin (1: 1000), anti-GSK3-β (1: 1000), anti-phospho-GSK3-β (Ser9 ) (1: 1000), anti-STAT-3 (1: 1000), anti-phospho-STAT-3 (Tyr 705) (1: 1000), anti-cyclin A2 (1: 2000), anti-cyclin E1 ( 1: 2000) og anti-cyclin B1 (1: 2000). Efter vask blev membranerne inkuberet i 1 time med peroxidasekonjugeret ged anti-kanin eller anti-mus IgG (1: 5000). Derefter blev membranerne vasket, og proteinet blev synliggjort ved anvendelse af et forøget kemiluminescens-kit (GE Healthcare UK Limited, Buckinghamshire, UK). Bandet billeder af tre uafhængige forsøg blev kvantificeret ved optisk densitet ved hjælp Labworks 4.6 software (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

RhoA aktivering assay

Aktiviteterne i Rho protein blev bestemt anvendelse af et specifikt G-LISA

TM

RhoA Aktivering Assay Biochem Kit

TM (Cytoskeleton, CO, EUA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Kort fortalt blev Rhotekin RBD bundet til pladerne anvendt til udfældning GTP-bundne Rho fra cellelysatet. Den aktive RhoA blev detekteret under anvendelse af et specifikt antistof mod Rho og blev visualiseret ved anvendelse af en chemiluminescens-reaktion. Niveauet af aktivering blev målt med absorbansen indstillet ved 490 nm i en mikroplade-spektrofotometer.

sårheling assay

cellemonolag serum-udsultet i 24 timer, behandlet med LPA og ridset under anvendelse en steril pipettespids. For hver skål blev tre sår manuelt gjort, og de tre regulære sår sites blev verificeret under en Axio Observer Z1 mikroskop (Carl Zeiss, Inc., Jena, Tyskland) udstyret med en Axio Cam HRc og en Axio Vision Frigivelse 8.2 Image Analyzer; sårene blev derefter udvalgt og markeret. Efter vask med PBS, blev frisk medium indeholdende inhibitorerne tilsat til cellerne, som blev inkuberet ved 37 ° C i serumfrit DMEM indeholdende 10 pM LPA. Ubehandlede og behandlede celler blev tilladt at vandre ind i sårede område og blev fotograferet både umiddelbart efter sårdannelse (0 h) og 24 timer efter sårdannelse. Afstanden mellem de to kanter af skaden blev kvantificeret ved hjælp af Adobe Photoshop 6.0 fra tre uafhængige forsøg. Værdierne er repræsenteret som procenter og afbildet på grafen.

Invasion assay

For at teste tumorceller invasion, en Transwell med en 6,5 mm polycarbonat filter (8 um porestørrelse, kat. Nr. 3422, Costar, Cambridge, MA) blev coatet med 20 pi Matrigel® (kat nr 356.230;.. BD Biosciences, San Diego, CA) fortyndet i DMEM (1:10) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Caco-2 (2,5 x 10

4), HT-29 (2 x 10

4), HCT-116 (2 x 10

4) og Ovcar-3 (2 x 10

4) celler, i 200 pi serumfrit medium med LPA, blev podet i det øvre kammer i Transwell. Dyrkningsmedium med 20% FBS blev tilsat som en kemoattraktant i det nedre kammer. Efter 48 timers inkubation blev den øvre overflade af membranen skrubbes med en vatpind. De invaderede celler i den nedre membran blev fikseret i ethanol i 10 minutter og farvet med krystalviolet. Antallet af invaderede ubehandlede og behandlede celler blev udtrykt som gennemsnittet af fire tilfældige felter under mikroskopet. Værdierne er vist som procentdele og afbildet på grafen. OVCAR-3 blev anvendt som en positiv kontrol af LPA virkningsfuldhed.

forankringsuafhængig vækst

Caco-2 blev HT-29 og HCT-116 celler podet i en 12-brønds plade ( tidligere dækket med 1 ml 0,6% agarose halvfast) ved en densitet på 250 celler /brønd i en opløsning af DMEM indeholdende 10% SFB og 0,3% agarose i 30 min. DMEM med 10% FBS, at enten indeholdt LPA eller ikke indeholdt LPA (kontrol) blev tilsat til toppen af ​​den semi-faste opløsning og blev fornyet hver 3. dag. Efter 14 dage blev de dannede kolonier afbildet og talt under anvendelse af en Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Inc.) mikroskop udstyret med en Axiocam MRC5 kamera.

Cellelevedygtighed analyse

HT-29 ( 1×10

3 celle /ml) og HCT-116 (2 x 10

4 celle /ml) celler blev podet og dyrket i plader med 96 brønde, og efter FBS udtømning, behandlet med en af ​​følgende løsninger: 10 uM LPA alene, 10 uM STA-21, 10 uM Y-27632, eller LPA i kombination med disse inhibitorer i de angivne tidsrum før inkubering med MTT (Sigma Chemical Co.). Cellerne blev holdt i 2 timer ved 37 ° C og centrifugeret ved 1.500 g i 5 min. Supernatanten blev fjernet, og krystallerne blev opløst i DMSO. Absorbansen ved 538 nm blev målt med et Spectra Max 190 spektrofotometer (Molecular Devices Sunnyvale, CA).

Celleproliferationsassay

krystalviolet metoden blev anvendt til at måle celleproliferation. Caco-2 (2×10

4 celler /ml), HT-29 (10

3 celle /ml) og HCT-116 (2×10

4 celle /ml) celler blev dyrket i 96-brønds plader og blev FBS-udtømte og behandles som anført med LPA og hæmmere af STAT-3 og ROCK for 24, 48 og 72 timer og fikseret med ethanol i 10 min. Den krystalviolet-opløsning (0,05% krystalviolet og 20% ​​methanol) blev tilsat i 10 min. Cellerne blev vasket to gange med vand og derefter solubiliseres med methanol. Absorbansen ved 595 nm blev målt med et Spectra Max 190 spektrofotometer (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Værdierne er repræsenteret som procenter og afbildet på grafen.

apoptose og overlevelse analyse

HT-29 og HCT-116 celler (10

5-10

6 celler /ml) blev dyrket i seks-brønds mikrotiterplader og var serum-udsultet i 24 timer. Efter blev de behandlet i 24, 48 og 72 timer med 10 pM LPA. Apoptose blev påvist ved en Annexin V /propidiumiodid (PI) farvning assay til påvisning tidligt apoptotiske celler, sent apoptotiske celler og ikke-apoptotiske celler på de angivne tidspunkter. Cellerne blev vasket i iskold PBS og resuspenderet i 100 pi Annexin V-bindingsbuffer (0,1 M Hepes /NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, 25 mM CaCI

2) indeholdende annexin V-FITC og PI ( 1 ug /ml) i 15 min. En FACS-analyse blev udført under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer og CellQuest software (BDBiosciences, San Jose, CA, USA); cellerne negative for både annexin V og PI blev anset levedygtig (overlevelse).

Cell cyklus analyse

HCT-116 celler (10

5-10

6 celle /ml ) dyrket i seks-brønds mikrotiterplader blev FBS forarmet og behandlet i 8, 12 og 16 timer med LPA og /eller inhibitorer af STAT-3 eller ROCK. Efter denne periode blev cellerne høstet ved trypsinisering og vasket en gang med iskold PBS. Cellerne blev derefter farvet i mørke med 75 pM propidiumiodid (Sigma) i 10 minutter i en buffer indeholdende 3,4 mM Tris-HCI (pH 7,6), 10 mM NaCl, 0,2% Triton X-100 og 3500 U /l RNAse. En analyse af DNA-indholdet blev udført ved at opsamle 10.000 begivenheder for cellecyklus og sub-G1-analyse under anvendelse af et FACSCalibur flowcytometer (BD Transduction Labs, Lexington, KY, ERE) og Mod Fit LT software.

Immunofluorescens

cellerne blev udsået på dækglas, der var blevet placeret på 24-brønds plader på forhånd. Efter FBS udtømning og behandling, blev cellerne vasket i PBS suppleret med 100 mM CaCl

2 og 100 mM MgCl

2 (PBS /CM) og fikseres i 100% methanol i 20 min. Prøverne blev permeabiliseret med 0,5% TX-100 i PBS i 10 min. Senere blev cellerne inkuberet i 50 mM NHCl

4 i PBS i 10 min og blokeret i 3% BSA i 1 time. Cellerne blev inkuberet med primære antistoffer, anti-β-catenin (1: 250) og anti-STAT3 (1:50) i 1 time, efterfulgt af en yderligere times inkubation med sekundært Alexa 488-konjugeret anti-kanin eller anti -mouse antistoffer. Derefter blev cellerne inkuberet med 40,6-diamidino-2-phenylindol dihydrochlorid (DAPI) (1: 1000) i 3 minutter. De dækglas blev vasket i PBS og monteret med

n

propyl-gallate, og cellefarvning blev opdaget ved hjælp af en Axio Observer Z1 immuno-fluorescens mikroskop udstyret med en Axiocam HRc Rev. 3 kamera og en Axiovision Frigivelse 4.8. 1 billedanalysator program (Carl Zeiss Inc., Tyskland)

luciferase assay for TCF-aktivitet

To forskellige TCF luciferase reportergener blev anvendt i dette assay:. en intakt vildtype TCF-luciferase reporterkonstruktion (SUPER 8 TOPFLASH) og en muteret TCF-luciferase-reporterkonstruktion (SUPER 8 FOPFLASH), som blev anvendt som en negativ kontrol. HCT-116 (2×10

4) celler blev podet i seks-brønds plader og transient transficeret med 2 pg af SUPER 8 TOPFLASH eller FOPFLASH reporterplasmid, sammen med 3 pi af Fugene® 6 transfektionsreagens (Roche). Som en kontrol for transfektionseffektivitet, 0,2 ug af et Renila luciferase konstruktion blev inkluderet i hver transfektion. Efter 24 timers transfektion blev cellerne vasket to gange med PBS, FBS depleteret i 24 timer og derefter behandlet med 10 pM LPA. Cellerne blev høstet 6 og 24 timer efter transfektion, og ekstrakter blev fremstillet med 200 pi reporter lysepuffer (Promega). Renila og luciferaseaktivitet blev analyseret i henhold til fabrikantens protokol under anvendelse af et kit Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Luciferaseaktiviteten i hver brønd blev normaliseret til renila aktivitet. Tre uafhængige forsøg, der hver analyseret tre gange, blev udført på separate cellepassager.

Expression Chip array-dataanalyse

Totalt RNA fra FBS-depleterede HCT-116 celler, blev enten behandlet eller ikke med LPA i 12 timer blev opnået under anvendelse af et RNeasy Mini Kit (QIAGEN, USA) ifølge producentens anvisninger. Et hundrede nanogram af total RNA blev anvendt til at syntetisere det biotinylerede cRNA ifølge GeneChip hele transkription (WT) sense target-mærkning assay (

Affymetrix

,

USA

). Efter blev det biotinylerede cRNA hybridiseret til GeneChip humane gen 1.0 ST array (

Affymetrix

,

USA

), vasket og farvet i henhold til producentens protokoller. De GeneChip arrays blev scannet ved hjælp af en GeneChip® Scanner 3000. Affymetrix Expression Console Software Version 1.0 blev brugt til at skabe sammenfattet udtryk værdier (CHP-filer), og den Robust Multichip Analysis (RMA) algoritme blev anvendt. Dataene blev analyseret ved anvendelse Partek

® software (https://www.partek.com) [24]; differentielt udtrykte gener med ≥ 2-fold-change blev anvendt som kriterier for at definere overekspression eller nedreguleringen. De pathway analyse og relaterede processer blev opnået ved hjælp MetaCore

TM software (https://thomsonreuters.com/metacore) og Opfindsomhed

® Pathway analyse software (https://www.ingenuity.com).

statistisk analyse

Den statistiske analyse af tre uafhængige forsøg blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Statistiske analyser af migration, invasion, forankringsuafhængig vækst, TCF-aktivitet og protein optiske densitet blev udført ved anvendelse Students t-test; cellecyklus-analyse blev udført under anvendelse af en envejs ANOVA med Bonferroni post-test; og en to-halet ANOVA med Bonferroni post-test blev udført for celleproliferationsassay. Dataene blev udtrykt som middelværdien ± SEM. En forskel blev betragtet som statistisk signifikant, når * P 0,05; ** P 0,01; *** P. 0,001

Resultater

tyktarms cancerceller udtrykker LPA-receptorer i en differentieret måde, men LPA behandling ændrer ikke cellemigration, invasiv eller forankringsuafhængig vækst

i første omgang undersøgte vi ekspressionsniveauerne af LPA-receptorer i tre cellelinier af tyktarmskræft, Caco-2, HT-29 og HCT-116, under anvendelse af western blotting. Fig 1 viser, at Caco-2, HT-29 og HCT-116 celler udtrykker receptorerne LPA

1, LPA

2 og LPA

3 i differentierede måder. De lav kvalitet invasive Caco-2 celler præsenteret lavere niveauer af LPA

1 og LPA

3 i forhold til de andre cellelinjer og højere niveauer af LPA

2 i forhold til HT-29. Den intermediært invasive HT-29 celler udtrykte tilsvarende niveauer af alle tre LPA-receptorer; og de meget invasive HCT-116-celler præsenteret højere niveauer af receptorerne LPA

2 og LPA

3, i sammenligning med Caco-2 og HT-29 celler, men lavere niveauer af LPA

1 i forhold til HT-29. Dette resultat viser, at i virkeligheden er de tre cellelinier reagerer på denne biolipid. Nogle undersøgelser har vist, at LPA medierer cellemigration i en bred vifte af cancer celletyper [25,26], og vi har tidligere vist, at LPA forøger migrationen af ​​Caco-2-celler [10]. Således ønskede vi at vurdere virkningerne af LPA på begivenheder relateret til kræft progression i tyktarmen cancerceller med en højere invasive potentiale. Derfor udførte vi sårheling, en celle invasion assay og forankringsuafhængig vækst (AIG) i Caco-2, HT-29 og HCT-116 celler. Vi fandt, at LPA ikke ændrede celle migration i HT-29 og HCT-116 celler eller øge den invasive potentiale af de tre tyktarmskræft cellelinjer; øvrigt havde LPA ikke ændre tumorigenicitet, som evalueret af AIG (S1, S2 og S3 Fig henholdsvis).

repræsentant western blotting og densitometriske analyser af Caco-2, HT-29 og HCT-116-celler under anvendelse af specifikke antistoffer mod LPAR

1-3 (ac, henholdsvis). Caco-2-celler udtrykker høje niveauer af LPA

2, HT-29 celler udtrykker høje niveauer af LPA

1-3 og HCT-116-celler udtrykker høje niveauer af LPA

2-3. De gennemsnitlige score ± SEM. for tre er vist uafhængige forsøg.

LPA ikke inducerer celledød men øger spredningen ved at fremme celle progression til S-fasen og derefter G2 /M faser

Fordi LPA øger celle spredning og unddragelse af død i colon cancerceller [8,9,27], besluttede vi at vurdere, om LPA modulerer cellernes levedygtighed i vores undersøgelse. Vores resultater viste, at efter 48 og 72 timer af behandlingen, LPA steg antallet af levedygtige HCT-116 celler, men ikke antallet af levedygtige Caco-2 og HT-29-celler (fig 2A). Fordi øget antal levedygtige celler kan indikere induktion af proliferation eller nedsat celledød ved apoptose svig, bestemte vi, om LPA kunne påvirke celledød ved inkubering serumudsultede HCT-116-celler med LPA i 24, 48 og 72 timer og derefter farvning celler med Annexin V og PI (fig 2B og 2C). LPA ændrede ikke antallet af døde celler, hvilket indikerer, at stigningen i celletal observeret ved fig 2A sker ved forøgelsen celleproliferation og ikke en reduktion af døden. For at bestemme hvorvidt LPA-inducerede HCT-116 cellevækst var et resultat af ændringen af ​​cellecyklusregulering, blev cellecyklussen profiler overvåges af en flowcytometrisk analyse af DNA-indhold. Som vist i figur 3, fordelingen i faserne i cellecyklus indikeret, at behandling med LPA til 8, 12 og 16 timer fremmes celle progression til S-fasen og derefter G2 /M-faser, hvorunder befolkningen steget i forhold til den serum-udsultede celler.

Colon cancerceller blev FBS sultet i 24 timer og derefter behandlet med LPA (10 uM) i 24, 48 eller 72 timer. Det relative celleantal blev evalueret gennem krystalviolet-farvning (a), og apoptose blev efterfulgt af Annexin-V /PI dobbelt farvningsfremgangsmåde (b). a) LPA øgede det relative antal af HCT-116-celler, men ikke Caco-2 eller HT-29-celler. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af

tovejs

ANOVA med

post-hoc

Bonferroni test. ** P 0,01; *** P 0,001. Gennemsnitlige score ± SEM. for tre er vist uafhængige forsøg. b) FACS-analyse via Annexin V-FITC /PI-farvning viste, at LPA ikke reducerede celledød i HCT-116-celler. Fire forskellige cellepopulationer blev påvist efter Annexin V /PI-farvning af HCT-116-celler. Alive celler er grupperet i nederste venstre del af panelet, der tidligt apoptotiske celler grupperet i nederste højre del af panelet, der sent apoptotiske celler grupperet i højere højre del af panelet og nekrotiske celler er grupperet i højere venstre del af panelet. FL1-H, Annexin V; FL2-H, PI. c) Data hentet fra flowcytometriske analyser er plottet i en graf. Der var ingen øget procentdel af LPA-medieret apoptose.

Cellerne blev FBS sultet i 24 timer (CONT, kontrol), behandlet med LPA på de angivne tidspunkter, farvet med PI og analyseret ved anvendelse af FACS. a) Andelen af ​​celler i G2 /M-fasen blev signifikant øget efter 12 og 16 timer med LPA behandling. M1: celler i G1; M2: celler i S-fase; M3: celler i G2 /M. b) Grafen angiver den procentdel af S og G2 /M-celler i forhold til kontrolgruppen. Andelen af ​​DNA i S fasen blev beregnet under anvendelse ModfitLT Software. Data er vist som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af

envejs

ANOVA (*** p 0,001). PI, propidiumiodid; FACS, fluorescens-aktiveret cellesortering.

LPA-induceret celleproliferation af HCT-116 involverer Rho-ROCK signaleringsaktivering

Baseret på tidligere undersøgelser, der viser, at LPA aktiverer lille GTPase Rho [14], og at Rho regulerer celleproliferation i forskellige celletyper [28], besluttede vi at undersøge, om LPA-inducerende proliferation af HCT-116-celler er Rho-ROCK afhængig. De cellelag blev serum sultet i 1 time, efterfulgt af behandling med 10 pM LPA på de angivne tidspunkter; vi derefter udført Rho aktivitet assay. S4 Figur viser, at LPA inducerer RhoA aktivering primært på 5 og 15 minutters behandling. Dette resultat bekræfter tidligere undersøgelser, der viser, at LPA aktiverer RhoA GTPase.

Dernæst undersøgte vi, om LPA aktiverer ROCK nedstrøms for Rho og om denne signalvej er ansvarlig for modulering af celleproliferation. Således udførte vi en krystalviolet assay og cellecyklus-analyse efter inhibering af ROCK med Y-27632. Resultaterne indikerer, at ROCK inhibering forhindrede stigning i den relative celleantal efter behandling med LPA i 48 timer (Fig 4A). Desuden ROCK inhibitor forhindrede LPA-induceret cellecyklusprogression (Fig 4B). Disse data understøtter den opfattelse, at LPA inducerer HCT-116 celleproliferation gennem Rho-ROCK aktivering.

Subkonfluerende cellemonolag FBS depleteret i 24 timer og behandlet med LPA på de angivne tidspunkter. a) Crystal violet farvning af HCT-116 viste, at ROCK inhibitor Y-27632 (10 uM) forhindrede en LPA-medieret stigning i den relative celleantal efter 48 timers behandling. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af

tovejs

ANOVA med

post-hoc

Bonferroni test. *** P 0,001, vs kontrol; ### P 0,001, vs LPA. Gennemsnitlige score ± SEM. for tre er vist uafhængige forsøg. b) FACS-analyse via PI-farvning viste, at ROCK inhibering med Y-27632 forhindrede LPA-inducerede stigning i andelen af ​​celler i S-G2 /M-fasen. De statistiske analyser blev udført ved hjælp af

envejs

ANOVA med

post-hoc

Bonferroni test. Data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. (*** P 0,001, vs kontrol; ## p 0,01, vs LPA)

LPA aktiverer STAT-3 for at mægle celledeling i en Rho-ROCK uafhængig måde

Det er velkendt, at både LPA og Rho kan udløse forskellige signalveje at modulere celleproliferation. Desuden har vi tidligere vist, at LPA forstyrrer adherensovergange i Caco-2 celler gennem Rho-ROCK signalering [10], og en undersøgelse foretaget af Yang

et al

. [35].