PLoS ONE: Undersøgelse effekt af karendothelvækstfaktor polymorfier i Epithelial ovariecancer: A Study in den indiske Population

Abstrakt

epitelovariecancer er en af ​​de stigende hændelse maligniteter, der er berygtet på grund af sin undvige for tidlig diagnosticering og høj dødelighed. Epiteliale ovariecancer er meget afhængige af patologisk kar og karendotelvækstfaktor er kendt for at være en af ​​de mest effektive angiogene faktorer. Polymorfier af VEGF-genet, i denne undersøgelse, blev vurderet til associering med malignitet og andre klinisk-patologiske faktorer. 300 case prøver og 320 alder og mensus status matchede kontroller blev indprentet i undersøgelsen. rs699947, rs833061, rs1570360, rs2010963, rs1413711 og rs3025039 var de seks enkelt nukleotid polymorfier, der blev gennemgået. Genotypebestemmelse blev udført ved polymerasekædereaktion og restriktionsfragmentlængde-polymorfisme. rs 3025039 viste enorm lovende som en markør for sygdom aggression og tilbagefald og en faktor for dårlig prognose. rs699947 viste mindst association med sygdommen og klinisk-patologisk faktorer undersøgt. rs833061, rs 1570360 viste signifikant sammenhæng med nogle klinisk-patologiske faktorer såsom bilateral lidelse af æggestokke og post operative CA-125 niveauer. rs2010963 forbundet med tilstedeværelse af ascites i større mængder. De SNPs under overvejelse viste ingen formidabel kobling i vores undersøgelse prøver. En haplotype analyse (ekskl rs699947 og rs1413711) afslørede 5 frontløbere at være til stede i 85% af befolkningen med TGGC og CGCC associere betydeligt som beskyttende og risikofaktorer hhv. Disse haplotyper viste en afhængig dosis additiv effekt af deres tilsyneladende funktionalitet. Denne undersøgelse er unik og en første af sin art udført i den indiske befolkning i Sydøstasien

Henvisning:. Janardhan B, Vaderhobli S, Bhagat R, Chennagiri Srinivasamurthy P, Venketeshiah Reddihalli P, Gawari R, et al. (2015) Undersøgelse effekt af karendothelvækstfaktor polymorfier i Epithelial ovariecancer: A Study in den indiske Befolkning. PLoS ONE 10 (7): e0131190. doi: 10,1371 /journal.pone.0131190

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: Februar 27, 2015; Accepteret: 30. maj 2015; Udgivet: 9 juli 2015

Copyright: © 2015 Janardhan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af den indiske Råd for Medicinsk Forskning, Ref No: 5/13/28/2010-NCD-III. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene, den førende dødsårsag fra gynækologiske maligniteter er den femte mest almindelige dødsårsag hos kvinder i den kaukasiske race. Overlevelse er direkte relateret til iscenesætte med en overlevelse fem år på 93% for dem, diagnosticeret med lokaliseret sygdom, men kun 31% for dem med fjernt sygdom. Desværre, to tredjedele af patienter til stede med fjernt sygdom på tidspunktet for diagnosen. I Indien har der været en lav forekomst, men en støt stigning i aldersrelaterede standardiserede prævalens på kræft i æggestokkene med 3% om året i forskellige statslige registre over en periode [1].

Flertal af æggestokkene kræftformer (80-90%) er epiteliale tumorer i æggestokkene (EOCs). Oprindelsen og patogenese EOC s forblive gallingly undvigende, dels fordi det er sjældent at finde veldefinerede prækursorer læsioner, og dels fordi EOCs tendens til at have en kompleks og heterogen histologi, der trodser en simpel biologisk forklaring. En mangel på praktiske screeningsmetoder og fraværet af klare symptomer i de tidlige stadier af tumor progression har gjort EOCs vanskelig at behandle med succes. Paclitaxel (Taxol) og platinbaseret kemoterapi (enten cisplatin eller carboplatin) repræsenterer standard behandling efter kirurgisk debulking. Desværre, selv med moderne kemoterapi, de fleste patienter med fremskreden sygdom tilbagefald og dør af sygdommen.

En uundgåelig tilstand, der udvikler sig i tumor-mikromiljøer er hypoxi. Dette er en vigtig stimulerende faktor for angiogenese, som er en fremdrift faktor til aggressive maligniteter. Der er flere angiogene faktorer og alligevel Vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF-A) er blevet udråbt som den mest robuste molekyle i processen med angiogenese. VEGF-A secerneres af mange tumorceller in vitro og er stærkt opreguleret i de fleste humane cancere. Ekspressionen af ​​VEGF-A korrelerer med intratumoral kardensitet og dårlig prognose hos cancerpatienter og inhibering vides at formindske tumor kardensitet og tumorvækst [2, 3].

VEGF-A-genet er lokaliseret på kromosom 6p12 og omfatter en 14-kb kodende region, består af otte exoner og udviser alternativ splejsning for at danne en familie af proteiner. Den VEGF-A genet indeholder Hypoxi Responsive elementer (hres) i sine 5`and 3`UTRs. VEGF-A opreguleres under hypoxiske betingelser ved bindingen af ​​HIF-1 (hypoxi inducible factor -1) til HRE [4]. Hypoxi medierer også stabiliseringen af ​​VEGF-A-mRNA ved binding af uidentificerede faktorer være sin 3`UTR. VEGF-A er også moduleres af en række forskellige vækstfaktorer og cytokiner. Således genet er underlagt multilevel modulering af ekspression under hypoxi [5]. Genet er meget polymorf og en hel del undersøgelser har vist noget af SNPs at modulere genekspression og fremkalde højere VEGF-A plasmaniveauer.

Mange studier har undersøgt den rolle, VEGF-A polymorfier som en genetisk determinant for modtagelighed og resultat i bryst-, prostata-, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), og tyktarmskræft. Globalt blev flere undersøgelser af foreningen af ​​disse polymorfier med risiko og behandlingsresultater gjort, men opnåede resultater blandt forskellige racer og kræft var meget varierende. For eksempel rs3025039 »T« allel bibringes beskyttelse mod brystcancer men omvendt, øget risiko for kolorektal cancer. Ligeledes rs2010963 C allel forudsagde højere risiko for NSCLC og prostatakræft, men forudsagt nedsat risiko for kræft i tyktarmen, [6]. Den manglende konsensus om den rolle, disse SNPs kunne være på grund af deres samspil med andre obskure faktorer eller fordi disse SNP’er modulere ekspression af genet som helhed, som har flere isoformer, der omfatter både pro og anti-angiogene isoformer gør en 2 -vejs modulation muligt af disse SNPs. Måske vil samarbejde med haplotyper være mere forudsigelig end individuelle SNPs. Øget forståelse af funktionaliteten af ​​disse polymorfier og deres rolle i tumor biologi er vigtigt at skelne årsagerne til uoverensstemmelser i litteraturen, som også kan bidrage til udformningen af ​​associationsstudier i fremtiden.

Polymorphisms inkluderet i denne undersøgelse er rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963, rs1413711 og rs3025039 og er almindeligt kendt som VEGFA-2578 A /C, -1154G /A, -460 C /T, 405 G /C, 674 C /T og 936 C /T hhv. VEGFA-2578 A /C er opkaldt efter dens position i forhold til translationsstartstedet (-1540 bp i forhold til transkriptionsstartsitet), og er placeret i promotorregionen. Ligeledes 405 G /C er også kendt som -634 G /C. Navnene for andre polymorfier er baseret på de positioner i forhold til transkriptionsstarten (-460, 405) eller ende (936) site, og at disse SNP er placeret i promotoren, 5′-utranslaterede (UTR) og 3 ‘ -UTR regioner, henholdsvis. 674 C /T er til stede i intron 1 region af genet. De SNPs i dette papir betegnes med deres respektive dbSNP id-numre. Disse SNP’er er i tæt nærhed til HRE regionen og signalering sekvensen af ​​peptidet i genet. Dette sætter dem i rampelyset for mulighederne for genekspression modulation afhængigt af allel til stede.

De 6 polymorfier af VEGF-A-genet er medtaget i vores case-control studie af epitelial kræft i æggestokkene med målsætningen om undersøge betydningen af ​​de genetiske varianter som diagnostiske eller prognostiske redskaber og deres korrelation med sygdomsstatus og klinisk-patologiske faktorer. Vi præsenterer en første sådan undersøgelse beskæftiger befolkning fra det indiske subkontinent i Sydøstasien.

Resultater

Foreningen af ​​polymorfier med sygdom

De seks polymorfier genotypede i 300 tilfælde og 320 kontroller blev alle fundet at være i Hardy-Wienberg ligevægt. Den allele distribution og foreningen er vist i figurerne 1 og 2 i form af OR og 95% konfidensinterval. rs 1570360, rs 833.061, rs 2010963 og rs 3.025.039 udstillet meget stærk sammenhæng (p-værdi 0,001) med sygdomsstatus. rs 1413711 udviste signifikant sammenhæng med sygdommen samt (p-værdi 0,01). rs 699.947 viste ingen sammenhæng med sygdommen tilstand i undersøgelsen kohorte. Den genotypiske fordeling af SNP’er er vist i figur 3 og en vurdering i henhold til både den dominerende og recessive modeller for Foreningen blev beregnet. Blandt de testede modeller, viste den dominerende model højere betydning af association med sygdommen (data vist i S1 tabel). Vejviser

Foreningen af ​​polymorfier med malignitet og andre klinisk-patologiske faktorer

i alt elleve klinisk-patologiske faktorer blev medtaget i undersøgelsen som den alder, diagnose, menstruation status, FIGO stadie, grad, histopatologi, bilateral lidelse af æggestokkene, præ-operative plasma CA-125 niveauer, tumortype , tilstedeværelse eller fravær af ascites, tilstedeværelse eller fravær af tilbageværende sygdom og fornyet inden for en periode på et år efter operation kirurgi. (S2 Tabel hverver de klinisk-patologiske faktorer indgår i undersøgelsen). Post-op CA125 niveauer blev også vurderet for samarbejde med de polymorfier at korrelere med prognose sammen tilbagefald, selvom dataene for alle prøverne ikke kunne hentes. Ikke desto mindre blev en forening test udført for tilgængelige data delmængde. På en forening analyse for hele sagen kohorte mellem polymorfier og klinisk-patologiske faktorer, SNPs rs 699947 og rs 1.413.711 viste ingen sammenhæng med malignitet eller sygdomsstatus. Alle andre SNPs viste signifikant sammenhæng med malignitet med en p-værdi på 0,001. Tabel 1 opsummerer de opnåede resultater for foreningen af ​​polymorfi med hver af de klinisk-patologiske faktorer.

Lift data og haplotype foreninger

Vi kunne ikke observere nogen signifikant sammenhæng mellem nogen af polymorfier (Fig 4). Selvom rs1413711 og rs3025039 udviser en rimelig grad af sammenkædning med en D ‘værdi på 0,605, men det er langt bagefter standard afskåret antaget i D’ på 0,8 eller senere. Vurdering af haplotyper, herunder alle SNPs ikke give nogen klar forløber så godt. Når en haplotype analyse blev kørt eksklusive rs699947 og rs1413711, et sæt af 5 haplotyper fra 16 genereres via FASE havde en frekvens på 5%. De haplotyper under kontrol omfattede SNPs rs833061, rs1570360, rs2010963 og rs3025039. TGGC (37%), CGGC (19%), CGCC (9%), TGCC (12%) og TAGC (8%) tegnede sig for 85% af undersøgelsespopulationen. Tabel 2 formoder disse haplotyper, deres hyppighed i case-kontrol kohorter og testede foreningen p-værdi på disse haplotyper med sygdommen. Af disse TGGC blev observeret ved 50% af den samlede befolkning i kontrol, men kun 24% i tilfælde og tilhørende betydeligt som afskærmning faktor. CGCC blev observeret til at være på 11% i tilfælde, men kun på 6% i kontroller og tilhørende betydeligt med sygdomsstatus.

Virkningen af ​​haplotyper på sygdom aggression og malignitet

de haplotyper førnævnte blev gennemgået for enhver forbindelse med sygdom aggression og malignitet. Haplotypen TGGC forbundet meget betydeligt som en beskyttende faktor (p-værdi 0,001) i sin homozygot tilstand. Den heterozygote TGGC tilstand viste ingen effekt eller forening. CGCC forbundet signifikant med malignitet (p-værdi 0,0198). Det blev også observeret, at høje ondartede potentialitet blev observeret i bærere af CGCC haplotyper i homozygot tilstand, men heterozygoti havde ingen signifikant effekt. Dette giver anledning til forestillingen om, at haplotyperne TGGC og CGCC kan have en kopi-nummer eller dosisafhængig effekt. Vi observerede, at patienter vært til CGCC viste højere forekomst af tilstedeværelsen af ​​ 500ml ascites (statistisk signifikans ikke opnået) og højere præoperative plasma CA-125 niveauer (p-værdi 0,017). Værter til haplotyper CGCC og CGGC udviste også en højere tilbøjelighed til aggressiv sygdom og malignitet. Tabel 3 giver en oversigt over haplotypefrekvenser i deres homozygot og heterozygot forhold og deres tilknytning til sygdomsforekomst er indskrevet med Yates ‘korrektion. Der var ingen observeret sammenhæng mellem nogen af ​​haplotyper med tilbagefald af sygdom inden for en periode på et år blev heller ikke forbundet med residual sygdomsstatus i den aktuelle undersøgelse.

Diskussion

behov for en vaskulær support system er afgørende for vækst, det være sig tumorceller eller normale celler. Tumor angiogenese er en primær begivenhed, der opfylder dette behov, uden hvilken tumorceller ikke kan vokse ud over 2 mm og bo hvilende [7]. En indviklet balance mellem pro og anti angiogene faktorer er nødvendig for en sund angiogenese. EOCs, er angiogenese-afhængige, kræver en angiogen switch, der vipper balancen begunstige angiogenese [8]. Ved fremskreden æggestokkræft, VEGF-A induceret patologisk angiogenese fører til ondartet ascites produktion og eventuel sygdomsprogression og behandlingssvigt. Et væld af SNP’er i VEGF-A-genet er blevet opdaget, at der er forbundet med modulering niveauer af VEGF-A proteinekspression og modtagelighed for forskellige carcinomer [9-13]. Undersøgelser forhører effekten af ​​polymorfier og test deres gyldighed som prognostiske markører eller risikofaktorer er langt og få, og de fleste af dem i kaukasiske racer. Undersøgelser under anvendelse den asiatiske delmængde er sparse.

Blandt de få studier i ovariecancer, blev rs3025039 observeret at være forbundet som en risikofaktor i en undersøgelse [14] og var forbundet med bedre prognose i en anden undersøgelse [15] . Vores undersøgelse impliceret SNP med dårlig prognose og risikofaktor som i den tidligere undersøgelse. rs2010963 forbundet kraftigt med bedre prognose, men svag sammenhæng i tilfælde af rs803361 [16]. Undersøgelsen viste også, at zygositet holdt uafhængig prognostisk betydning. En undersøgelse, herunder rs2010963, rs1570360 og rs699947 viste ingen signifikant sammenhæng af polymorfier med eventuelle klinisk-patologiske parametre, men er forbundet med væsentlig ændring af VEGF-A udtryk, men ingen sammenhæng med progressionsfri overlevelse eller prognose og foreslog betydelig koblingsuligevægt blandt disse polymorfier [17 ]. Den haplotypeanalyse i undersøgelsen viste ingen signifikant sammenhæng med klinisk-patologiske parametre selv om en af ​​deres haplotyper AGCGC (rs699947, rs1570360, rs833061, rs2010963 og rs3025039) viste signifikant sammenhæng med progressionsfri overlevelse.

SNPs i vores undersøgelse dog udstillet stærk forening med status sygdom, viste ikke nogen signifikant sammenhæng mellem dem selv som rapporteret i flere andre undersøgelser [18-22]. Flere af SNPs inkluderet viste signifikant association med visse klinisk-patologiske parametre. rs3025039 viste signifikante sammenhænge med malignt potentiale, Figo stadier, bilateral lidelse, post-op CA125 plasmaniveauer, ascites og tilbagefald indikerer det at være lovende markør for dårlig prognose. rs1413711 og rs2010963 forbundet betydeligt med tilstedeværelse af ascites men signifikans blev ikke set med øgede niveauer af ascites. rs833061 forbundet med bilateral lidelse af æggestokke og endnu stærkere inden den maligne delmængde af case prøver. rs699947 viste ingen association til sygdomsstatus eller andre klinisk-patologiske parametre.

tvetydighed i polymorfi data på tværs af befolkningsgrupper kunne dels ekspliciteret i form af positioner disse godt rapporterede polymorfier og de isoformer af VEGF-A, som er kendt for at være anti-angiogen. Så meget som en angiogen switch sker ind for angiogenese i tilfælde af tumorigenese, er der også en selvregulerende mekanisme i forhold til VEGF-A-genet, der opretholder en fin balance mellem pro- og anti-angiogene isoformer af VEGF -A-genet.

Exon 8 i VEGF-a-genet har en unik evne til at producere både pro og anti angiogene isoformer af VEGF-a. Mens exon 8a giver pro-angiogenecity, exon 8b giver anti-angiogenecity. Alternativ splejsning, der producerer mRNA med 8b kodoner producere et helt sæt isoformer af VEGF-A, som er fuldstændig modstridende virkningerne af mRNA 8a delmængder. Perrin et al har rapporteret, at ekspression af VEGF-A

xxxb isoformer bidrager til kompetitiv inhibering ved binding til receptorerne, men ikke stimulerende tyrosinphosphorylering afgørende for downstream angiogen aktivitet som er forårsaget af VEGF-A

xxxa isoformer. Den VEGF-A

xxxb isoformer er dermed endogene antiangiogene midler dannet af alternativ splejsning og siges at være påvirket af andre forhold vækstfaktor og splejse faktor disponible. VEGF-A

165b isoformer er blevet rapporteret at blive nedreguleret i forskellige cancere, såsom renalcellecarcinom, prostata- og colon carcinoma [23-25].

Dette særlige aspekt af VEGF-A splejsning og alternativ isoform produktion er absolut værd en detaljeret undersøgelse, da eksplorative undersøgelser af SNPs verdensplan har ikke givet en konsensus data, der er implicative. Del grund til dette er den varierende in vivo hos cancerpatienter. EOCs er endnu mere kompliceret, da en nylig rapport viste, at de af flere blandet oprindelse snarere end blot overfladeepitelet [26]. Denne heterogene invivo mileu gør modulering af VEGF-A genekspression meget indviklet.

SNPs rs 699947, rs 833061 og rs 1550360 ved promotor-regionen er fælles for både VEGF-A

xxxa og VEGF -A

xxxb isoformer og dermed en sammenslutning af disse SNPs med sygdommen kunne betyde enten måder. One, kunne det enige om, at de pro-angiogene isoformer stigende udtrykkes eller det kan også betyde, at de antiangiogene isoformer undertrykkes. SNP rs 2010963 er inden for 5 ‘UTR region. VEGF-A-genet er ental i, at det har en 1038bp 5’UTR region, der har 2 IRES (Interne ribosomale entry sites) elementer (IRES-A og IRES-B), som er differentielt taget i brug, afhængigt af de intracellulære betingelser af normoxi og hypoxi [27]. Derfor virkningen af ​​RS 2010963 kunne slå utydelig overvejer det hidtil ukendte forhold, at en lang form for VEGF-A-mRNA (med et tilsat 180 aminosyresekvens) fremstilles som modulerer yderligere ekspression af VEGF-A-mRNA’er. rs 1413711 er, indgår i denne undersøgelse, er ikke godt undersøgt som de andre polymorfier men endnu værd et ur, bliver i intron 1 region. I vores undersøgelse, var det ikke udøve nogen signifikant sammenhæng med de klinisk-patologiske faktorer men forbinder med stor betydning (p = 0,01) med status sygdom. SNP rs 3025039 er veldokumenteret, at være i 3’UTR region af VEGF-A-genet. Det er kendt for at påvirke de udskilte niveauer af VEGF-A-protein og har vist sig at have signifikant association i de fleste tilfælde-kohortestudier. Denne SNP, i vores undersøgelse også udstillet meget stærk sammenhæng med sygdomsstatus og dårligere prognose.

Denne efterforskningsmæssige undersøgelse er en første i sit forsøg i denne population, og i resumé viser rs3025039 at være forbundet som en yderst lovende markør for prognose mens andre polymorfier i undersøgelsen var forbundet med et par klinisk-patologiske parametre og var resultatløse om deres prognostiske evner. De polymorfier gjorde viser en stærk sammenhæng med malignitet og dermed kan impliceret som risikofaktorer. Dette summarisk er den eneste papir, der omhandler effekten af ​​VEGF-A polymorfier i epitelial ovariekræft i det sydøstlige asiatiske befolkning, specielt pan-indisk.

Materialer og metoder

prøvetagning

i alt 300 patienter diagnosticeret med primær epitelial æggestokkræft på Kidwai Memorial Institute of Oncology, Bangalore, Indien, blev inkluderet i undersøgelsen.

den oprindelige institutionelle diagnose af epitelial ovariekræft blev bekræftet af gennemgang af patologiske slides af højtstående patologer. Af de 300 sager, 202 (67,3%) var maligne tilfælde, 31 (10,3%) var grænsetilfælde eller lave maligne potentiale (LMP) tumorer og 67 (22,4%) var godartede tumorer. Af disse antal præ-mensus prøver lå på 88 (29,3%) og post-mensus prøver på 212 (70,7%). 320 raske kontrolpersoner, matchede for alder og overgangsalderen status, blev rekrutteret til undersøgelsen. Gennemsnitsalderen for tilfælde kohorte var 51 ± 12 år og 48 ± 17 år for kontrol. 30,9% (99/320) af kontroller var præmenopausale og 69,1% (221/320) var postmenopausale. 65,8% tilfælde var høje scene og høj kvalitet, og 63,8% tilfælde var serøse epitelial ovariecancer. 64.9% tilfælde havde bilateral lidelse og 86,6% tilfælde udviste høje CA125 niveauer. Ascites blev observeret i 80% tilfælde. S2 Tabel i giver en in-detalje billede af demografien i de sager, der tages i undersøgelsen. 5 ml blod blev opsamlet fra alle fag, før behandling, i heparin vacutainere og behandles straks der efter. Cellepelleten blev opbevaret i -20 ° C til DNA isolation og genotype.

Alle tumorer blev gradueret efter WHO kriterier og iscenesat efter sammenslutningen af ​​gynækologi og obstetrik (FIGO) klassificering. Oplysninger om kræftdiagnose, sygdom etape (FIGO), histologisk kvalitet og undertype, pre operative CA-125 niveauer, residual sygdom og tilbagefald blev der indvindes fra medicinske journaler.

Undersøgelse godkendelsen blev givet af Institutional bestyrelse og revision af Medicinsk etiske komité og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle deltagere.

DNA isolation

Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifert blod prøve ved hjælp QIAamp® DNA-ekstraktion kits (Qiagen) som pr producentens protokol. DNA-koncentrationen blev målt ved NanoDrop fra Thermo Scientific.

Genotypebestemmelse

polymerasekædereaktion-restriktionsfragmentlængde-polymorfisme (PCR-RFLP) blev anvendt til bestemmelse af 6 VEGF-A polymorfier under anvendelse af tidligere publicerede protokoller med mindre modifikationer.

PCR blev udført i et 30 pi reaktionsblanding med 50-100ng template DNA, 1U Taq Polymerase enzym (Bangalore Genei) og 1X puffer leveres sammen med enzym. 0.3μM af respektive primere (Sigma), 0,5 mM dNTP mix og 1,5 til 2 mm MgCl

2 udgjorde PCR mix. PCR blev udført i en Eppendorf PCR thermal cycler med en indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 35-40 cyklusser af denaturering ved 95 ° C i 40 sekunder, annealing i 40 sekunder, forlængelse ved 72 ° C i 20 -40 sekunder og en afsluttende forlængelse i fem minutter ved 72 ° C. PCR primerne og respektive annealing temperaturer, der anvendes for hver SNP i anført i tabel 4.

De opnåede DNA ampliconer blev spaltet natten over med restriktionsenzymet. Restriktionsenzymerne blev anskaffet fra New England Biolabs og begrænsning temperaturforhold fulgte fabrikantens protokol. De enzymer, der anvendes var BgIII (rs699947), BstUI (rs833061), MnlI (rs1570360), BsmFI (rs 2010963), BaeGI (rs 1413711) og NlaIII (rs3025039). BstUI blev anvendt ved 2U koncentration, mens resten af ​​enzymerne blev anvendt i en koncentration 1U i en reaktionsblanding volumen på 25 pi. De fordøjede ampliconer blev separeret i en ethidiumbromid-gel, der er 1,5 til 3% agarose afhængigt af amplikonstørrelse. Bandet størrelser blev konstateret med brug af en 50bp og 100bp stigen.

Linkage, haplotype og statistisk analyse

kobling og haplotypeanalyse blev udført ved hjælp haploview 4.2 og fase 2.1.1 version. Den χ

2 test blev anvendt til at bestemme, om de genotype distributioner var i Hardy-Wienberg ligevægt. Chi square og logistiske regressionsanalyser blev anvendt til at undersøge sammenhængen mellem transport af markører og sygdom status og andre klinisk-patologiske faktorer. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 21.

Støtte oplysninger

S1 Table. En analyse af polymorfier i de dominerende og recessive modeller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0131190.s001

(DOC)

S2 Table. Demografi og klinisk-patologiske aspekter af sager (i alt 300)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0131190.s002

(DOC)

Tak

Vi er taknemmelige for patienterne med hvis samarbejde denne undersøgelse var muligt. Vi takker Dr. V. Shanmugam, Ms Lakshmi Subramaniam og fru Anisha Raju for deres værdifulde input og bistand i dataanalyse.