PLoS ONE: Telmisartan inducerer væksthæmning DNA dobbelt-strenget Pauser og apoptose i human endometriecancer Cells

Abstrakte

Telmisartan, en angiotensin II-receptorantagonist type 1-blokker, bruges ofte som en antihypertension stof, og det er også blevet karakteriseret som en peroxisomproliferatoraktiveret receptor-gamma (PPARy) ligand. Formålet med denne undersøgelse var at belyse antitumorvirkninger af telmisartan på endometriecancer-celler. Vi behandlede tre endometriecancer cellelinjer med forskellige koncentrationer af telmisartan, og vi undersøgte virkningerne af telmisartan på celleproliferation, apoptose, og deres relaterede målinger in vitro. Vi administreres også telmisartan til nøgne mus med eksperimentelle tumorer at bestemme dens in vivo effekter og toksicitet. Alle tre endometriske cancercellelinier var følsom over for vækst-inhibitoriske virkning af telmisartan. Induktionen af ​​apoptose blev bekræftet i samråd med ændret ekspression af gener og proteiner relateret til apoptose. Vi bemærkede også, at DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) blev induceret i HHUA (human endometriecancer) celler ved telmisartan behandling. Desuden eksperimenter i nøgne mus viste, at telmisartan signifikant hæmmet human endometrial tumorvækst, uden toksiske bivirkninger. Vores resultater tyder på, at telmisartan kan være en ny behandlingsmulighed til behandling af livmoderkræft

Henvisning:. Koyama N, Nishida Y, Ishii T, Yoshida T, Furukawa Y, Narahara H (2014) Telmisartan inducerer Growth Inhibition DNA Double-strengbrud og apoptose i humane endometriecancer Cells. PLoS ONE 9 (3): e93050. doi: 10,1371 /journal.pone.0093050

Redaktør: Eric Asselin, University of Quebec på Trois-Rivieres, Canada

Modtaget: Indtil 30. juni, 2013; Accepteret: 28 Februar 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Koyama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en forskningsfond på skøn formand, Oita University (HN). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

livmoderkræft er de mest almindelige maligne tumorer i den kvindelige kønsorganer, og deres forekomst er steget i de senere år [1], [2]. Imidlertid har søgningen efter midler er effektive ved behandling af avancerede og tilbagevendende endometriecancere været skuffende [2], [3]. er således behov for innovative strategier til behandling af endometriecancer

Den nukleare hormon receptor peroxisomproliferatoraktiveret receptor-gamma (PPAR) og dets ligander inducere apoptose i flere typer af kræft, herunder endometriecancer [4]. – [6]. Telmisartan er en angiotensin II receptortype 1 (AT1R) blokker (ARB), som er almindeligt anvendt som et antihypertensivt lægemiddel. Benson et al. rapporterede en strukturel lighed mellem telmisartan og pioglitazon, en PPARy ligand [7]. Telmisartan fungerer som en partiel agonist af PPARy ligand, aktivering receptoren til 25% -30% af det maksimale niveau opnås ved fuld agonister pioglitazon og resiglitazone, hvor telmisartan handler uafhængigt via AT1R interaktion [7]. Telmisartan er blevet rapporteret at have antiproliferativ aktivitet i prostatacancer og nyrecellecancer [8] – [10]. Effekten af ​​telmisartan på gynækologisk kræftceller er endnu ikke blevet undersøgt.

Den foreliggende undersøgelse er designet til at afsløre, for første gang, den biologiske og terapeutiske virkninger af telmisartan på endometriecancer. Vi undersøgte, om denne forbindelse kunne mediere inhibering af celleproliferation og induktion af apoptose i endometriske cancercellelinier. Vi undersøgte, om DNA dobbelt-strenget pauser (DSBs) induceres i HHUA (human endometriecancer) celler ved telmisartan behandling. Vi har også testet evne telmisartan at hæmme spredningen af ​​HHUA celler in vivo, ved hjælp af en nøgen musemodel.

Materialer og metoder

cellelinier

HHUA menneskelige endometrie cancer cellelinje blev opnået fra Riken (Ibaraki, Japan). The Ishikawa humane endometriecancer cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Dr. Masato Nishida (Tsukuba University, Ibaraki, Japan) [11] – [13]. HEC-59 human endometriecancer cellelinje og normalt voksent menneske dermal fibroblast cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HHUA, Ishikawa, HEC-59 celler blev opretholdt som monolag ved 37 ° C i 5% CO

2 /luft i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Gibco, Rockville, MD). Normalt voksent menneske dermale fibroblastceller blev opretholdt som monolag i minimum essentielt medium (MEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) på samme betingelse som beskrevet ovenfor. Alle celler blev suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum. (FBS; Omega, Tarzana, CA)

Kemikalier Salg

Telmisartan, candesartan, losartan og valsartan blev opnået fra LKT Laboratories (St . Paul, MN, USA), og fremstillet som 10 mg /ml stamopløsninger i dimethylsulfoxid (DMSO). GW9662 og troglitazon blev opnået fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). GW9662 blev fremstillet som en 5 mg /ml stamopløsning i dimethylformamid. Troglitazon blev fremstillet som en 10 mg /ml stamopløsning i DMSO. Stamopløsningerne blev opbevaret som portioner ved -20 ° C.

Vurdering af celleproliferation og cellelevedygtighed

Celleproliferation og levedygtighed blev bestemt i 96-brønds plader ved en modificeret methylthiazol tetrazolium (MTT ) under anvendelse WST-1 (Roche Diagnostics, Penzberg, Tyskland) ved at følge fabrikantens protokol. Vi podet 5 x 10

3-celler i DMEM suppleret med 10% FBS i hver brønd i en 96-brønds fladbundet mikroplade (Corning, New York, NY) og inkuberes dem natten over. Mediet blev derefter fjernet, og cellerne blev inkuberet i 48 timer med 100 pi eksperimentel medium indeholdende forskellige koncentrationer af telmisartan, candesartan, losartan og valsartan. Derefter blev 10 pi WST-1 farvestof tilsat til hver brønd, og cellerne blev yderligere inkuberet i 2 timer. Alle eksperimenter blev udført i nærvær af 10% FBS. Celleproliferation blev vurderet ved at måle absorbansen ved 450 nm. Henvisningen bølgelængde var 620 nm. Data blev beregnet som forholdet af værdierne opnået for telmisartan-behandlede celler end dem, for de ubehandlede kontroller.

Anticancer Virkninger af Telmisartan via PPARy-afhængige vej

Dernæst undersøgte vi funktion af antitumorvirkninger af telmisartan gennem PPARy i HHUA endometriecancer celler in vitro under anvendelse af en WST-1 assay med 2 dages eksponering for både telmisartan ved 10 eller 50 pM og en PPARy-antagonist, GW9662, ved 10 uM. GW9662 blev anvendt som tidligere beskrevet [14], [15]. Før start stimulering, vi podet 5 x 10

3 HHUA celler i DMEM suppleret med 10% FBS i hver brønd i en 96-brønds fladbundet mikroplade (Corning, New York, NY) og inkuberet dem natten over. HHUA celler blev forbehandlet med GW9662 i 30 min før stimulering af telmisartan.

Måling af Apoptose (Flow-cytometrisk analyse med Annexin V /propidiumiodid Assay)

Cellerne blev belagt og dyrket natten indtil de nåede 80% sammenløb og derefter behandlet med telmisartan. Efter 48 timer blev løsnede celler i mediet opsamlet og de tilbageværende vedhæftende celler blev høstet ved trypsinisering. Cellerne (1 x 10

5) blev vasket med PBS og resuspenderet i 500 pi bindingspuffer (annexin V-fluoresceinisothiocyanat [FITC] apoptose afsløring kit fra BioVision, Palo Alto, CA) indeholdende 5 pi 50 ug /ml propidiumiodid (PI) og 5 pi annexin V-FITC, som binder til phosphatidylserin omplantes til ydersiden af ​​cellemembranen tidligt i apoptose samt under sent i apoptose. Efter inkubation i 10 minutter ved stuetemperatur i en lys-beskyttet område, blev prøverne analyseret på en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ). blev påvist FITC og PI-emissioner i FL-1 og FL-2 kanaler, henholdsvis. For hver prøve blev data fra 10.000 celler optaget i listen mode på logaritmiske skalaer. Efterfølgende analyse blev udført med CellQuest-software (Becton Dickinson).

mitokondrie transmembranpotentiale

Celler blev fremstillet til FACS som beskrevet ovenfor og farvet ved anvendelse af en Mitocapture Apoptose Detection kit fra BioVision med en fluorescerende lipofil kationisk reagens, der vurderer mitochondriemembranpermeabilitet, ifølge producentens anbefalinger.

caspase-3 og -7

i

​​Caspase-3 og -7 er vigtige medlemmer af cystein asparaginsyre-protease ( caspase) familie, der spiller afgørende effektor roller i apoptose i pattedyrceller. Aktiviteterne af disse caspaser blev målt ved anvendelse af en Caspase-Glo 3/7 Assay indkøbt fra Promega (Madison, WI), ifølge producentens anbefalinger.

enzymkoblet immunosorbentassay

Aktiveret spaltet poly-ADP ribose polymerase (PARP) ekspression blev beregnet ved anvendelse af et Pierce kolorimetrisk In-Cell ELISA-kit (Thermoscientific, Rockford, IL) ifølge producentens anbefalinger. Salg

Western blot-analyse

Celler blev vasket to gange i PBS og lyseret ved hjælp af M-PER pattedyrprotein ekstraktion reagens (Thermoscientific) ifølge producentens anbefalinger. Proteinkoncentrationer blev kvantificeret ved anvendelse af Pierce 660-nm-protein assayreagens (Thermoscientific) ifølge producentens foreslåede protokol. Helcellelysater (20 ug) blev opløst ved SDS-polyacrylamid gelelektroforese på 10% -15% geler og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Immobilon, Amersham, Arlington Heights, IL). Membraner blev derefter undersøgt sekventielt med antistoffer mod Bcl-2 (1:1,000, Epitomics, Burlingame, CA), Bd-XL (1:1,000; Cell Signaling Technology), Bax (1:1,000; Cell Signaling Technology), kløvet caspase- 3 (1:1000; Cell Signaling Technology), og GAPDH (1:10,000, Abcam, Cambridge, UK). Blottene blev fremkaldt under anvendelse af et forøget kemiluminescens-substrat (Western Lightning ECL Pro) kit (PerkinElmer, San Jose, CA).

Påvisning af DSB’er ved pulseret-felt-gelelektroforese (PFGE)

Subkonfluente kulturer af HHUA celler blev behandlet med 10 eller 100 pM telmisartan i 24 timer eller 48 timer. Celler blev høstet efter trypsinisering, og Agarosepropperne med 10

6-celler blev fremstillet med en CHEF engangs stik mug (Bio-Rad, Hercules, CA). Vi inkuberede stikpropper i lysispuffer (100 mM EDTA, 1% (vægt /volumen) natriumlaurylsulfat sarcosyne, 0,2% (vægt /volumen) natriumdeoxycholat, 1 mg ml

-1 proteinase K) ved 37 ° C i 24 h og derefter vasket dem med 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 100 mM ETDA. Elektroforese blev udført i 23 timer ved 13 ° C gennem 0,9% agarose i Tris-borat-EDTA-puffer under anvendelse af en Biometra Rotaphor apparat (Biometra, Goettingen, Tyskland) med følgende parametre: interval, 30-5 s log; vinkel, 120 ° -110 ° lineær; 180-120 V log). DNA blev farvet med ethidiumbromid og visualiseret ved hjælp af en Typhoon FLA 7000 scanner (GE Healthcare Life Sciences, Tokyo, Japan). De elektroforeseforhold blev specifikt designet til at komprimere lavere molekylvægt DNA-fragmenter (flere Mbp til 500 kbp) til et enkelt bånd, samtidig med at høj molekylvægt genomisk DNA i brønden. De lavere molekylvægt DNA-fragmenter er resultatet af DSB’er i det kromosomale DNA. Assayet muliggør således brudte DNA til let detekteres. Men i forbindelse med DSBs opstår under DNA-replikation i stå, assayet har begrænset følsomhed og er ikke kvantitativ. Når en DSB forekommer ved en DNA-replikation gaffel, er den brudte DNA stadig fastgjort til skabelonen kromosom. For at detektere DSB’er i analysen, to relativt tæt (flere MBP) fordelte uafhængige DSBs nødt til at forekomme [16], [17].

Immunfluorescerende Farvning af γ-H2AX

HHUA celler blev behandlet med eller uden telmisartan fikseret i 3,7% paraformaldehyd i 15 minutter, og derefter blokeret med 0,5% BSA i PBS. Cellerne blev inkuberet med kanin-monoklonalt anti γ-H2AX antistof (1:500, Millipore, Billerica, MA) i 90 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af Alexa488-konjugeret anti-kanin IgG (1:300; Molecular Probes, Carlsbad, CA) i 60 minutter ved stuetemperatur. DAPI blev anvendt til nucleus farvning. Cellerne blev observeret ved hjælp af en BZ-9000 (Keyence, Osaka, Japan).

In vivo

Animal Treatment Protocol

Protokollen blev godkendt af udvalget for den etiske af dyreforsøg ved universitetet i Oita (Permit Nummer: L029001). Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. Alle eksperimenter dyr blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health retningslinjer.

Seksten 6 uger gamle immundefekte BALB /c-nu /nu hunmus blev købt fra Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) og vedligeholdes under patogenfrie betingelser med bestrålet chow. I et eksperiment 5 × 10

6 HHUA celler i 0,1 ml Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA) blev bilateralt og subkutant injiceret i Stammerne af 16 mus, hvilket fører til dannelsen af ​​to tumorer per dyr. Behandlingen startede fra dagen efter injektionen af ​​disse humane endometriske carcinomceller og blev afbrudt efter 7 uger [18]. Kohorter (otte mus pr gruppe) fik enten diluent kun (kontrolgruppe) eller telmisartan (100 ug per dag) intraperitonealt i 5 dage om ugen. Tumorerne blev målt hver uge med skydelære. Vi beregnede tumor volumen ved hjælp af følgende formel: volumen = længde × bredde × højde × 0,5236. Venstre ventrikel (LV) trykket blev overvåget ved anvendelse af en tryktransducer (WS-681G: Nihon Kohden, Tokyo) for at optage toppen positive og negative første derivater af LV tryk. Data blev analyseret ved anvendelse LabChart software (ADInstruments, Colorado Springs, CO). Dyr blev aflivet ved bedøvelse med natriumpentobarbital, hvorefter omhyggelig resektion blev udført, og tumorvægte blev målt. Tumorer blev fikseret og farvet for histologisk analyse.

Immunhistokemi

Tumor prøver blev fikseret i 10% neutral bufferet formalin og indstøbt i paraffin før histologisk sektionering. Immunhistokemi foretaget studier formalin-fikserede sektioner af vævsprøver. Snit blev forbehandlet med trypsin (10 mg pr 50 ml i Tris-buffer, pH 8,1) i 10 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af inkubation med anti-Ki-67 monoklonalt antistof (1:1000 fortynding i PBS; Zymed Laboratories, San Francisco , CA) i 30 min. Objektglas blev derefter vasket i PBS og inkuberet sekventielt i 15 minutter med peroxidase-konjugeret svine-anti-muse-immunglobulin G (1:50 fortynding; Dako, København, Danmark). Farvning blev udført under anvendelse af en Dako Autostainer. Lokalisering af reaktionsprodukter blev udført under anvendelse af diaminobenziden reaktionen.

Terminal Deoxynucleotidyltransferase-medieret uridintriphosphat endemærkning Analyse

DNA strengbrud blev identificeret via en terminal deoxynucleotidyltransferase-medieret uridintriphosphat endemærkning ( TUNEL) -analyse under anvendelse af en in situ Celledød Detection Kit (Roche) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Statistical Analysis

Alle forsøg blev udført uafhængigt mindst tre gange in triplo pr eksperimentelt punkt . Alle numeriske data er udtrykt som middelværdi ± SD. Signifikans blev bestemt ved at gennemføre en

t

-test med Bonferroni korrektion. En

P

værdi 0,05 blev accepteret som signifikant

Resultater

Effekter af Telmisartan på spredning og levedygtighed endometriecancer cellelinier

in vitro

Vi undersøgte antitumor virkninger af telmisartan, candesartan, losartan og valsartan på tre endometriecancer cellelinjer in vitro ved hjælp af en WST-1 assay med et 2-dages eksponering for disse ARB’er. Tre endometriecancer cellelinjer (Ishikawa, HEC-59, og HHUA) viste signifikant følsomhed over for telmisartan behandling på 1-100 uM (fig. 1D). Ingen af ​​de andre tre ARB’er (candesartan, losartan og valsartan) påvirkede levedygtigheden af ​​endometriecancer cellelinier (Fig. 1A-C). Da vi fandt, at telmisartan kunne inhibere proliferationen af ​​disse cellelinier, undersøgte vi funktionen af ​​antitumorvirkninger af telmisartan gennem PPARy i HHUA endometriecancer celler in vitro, ved anvendelse af en WST-1 assay med 2 dages eksponering for både telmisartan ved 10 eller 50 uM og en PPARy-antagonist, GW9662, ved 10 uM. Vi fandt, at tilsætningen af ​​GW9662 inhiberede anticancer effekter af telmisartan ved 10 eller 50 pM (Fig. 1E).

Anticancer effekter af telmisartan via PPARy-afhængige vej. (A-D) Ishikawa, HEC-59, og HHUA endometriecancer cellelinier blev behandlet med telmisartan, candesartan, losartan eller valsartan i forskellige koncentrationer (1-100 uM) eller vehikel (kontrol) i 48 timer, og proliferation (% af kontrol) blev målt i en WST-1 assay. Resultaterne er middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg med tredobbelte skåle. *

P

0,05 vs. kontrol, **

P

0,01 vs. kontrol. (E) Effekt af GW9662 om telmisartan hæmning af HHUA celleproliferation. HHUA celler blev inkuberet med telmisartan (10 eller 50 uM) i 48 timer efterfulgt af præinkubering med GW9662 (10 uM) i 30 min. Vi fandt, at tilsætningen af ​​GW9662 inhiberede anticancer virkninger af telmisartan ved 10 eller 50 uM. Resultaterne repræsenterer de midler ± SD af tre uafhængige forsøg. Kolonner, midler; barer, SDS. *

P

0,05 vs. kontrol, **

P

. 0,01 vs. kontrol

Apoptotiske Ændringer i endometriecancer celler behandlet med Telmisartan

for at vurdere evnen af ​​telmisartan at inducere apoptose i cancerceller og til at skelne de forskellige typer af celledød, vi dobbelt-farvet telmisartan-behandlede celler med annexin V og PI og analyseret resultaterne ved anvendelse af flowcytometri. Annexin V binding kombineret med PI mærkning blev udført for sondringen af ​​tidlig apoptotiske (annexin V + /PI-) og sent apoptotiske (annexin V + /PI +) celler [19]. Efter behandling af endometriecancer celler med telmisartan ved 100 uM, vi registreret en samtidig stigning i både annexin V + /PI fraktion (tidlig apoptotisk) og annexin V + /PI + (sent apoptotisk) subpopulationer (tabel 1).

Tab af mitokondrie transmembranpotentiale i respons på behandling med Telmisartan

Tab af mitokondrie transmembrane potentiale (MTP) har vist sig at forekomme før cellekernekondensation og caspase aktivering, og er knyttet til cytochrom c-frigivelse i mange men ikke alle apoptotiske celler [20]. Behandling af endometriecancer celler med telmisartan resulterede i et fald i MTP (tabel 1).

Effekter af Telmisartan på ekspressionen af ​​Apoptose-relaterede Proteiner

Vi undersøgte effekten af ​​telmisartan på udtrykket af apoptose-relaterede proteiner i endometriecancer cellelinier ved en Western blot-analyse (fig. 2). Bcl-2-familien af ​​apoptose-regulerende proteiner tjener til enten at fremme (Bax, Bad, og Bak) eller inhibere (Bcl-2, Bcl-XL, og Mcl-1) den apoptotiske respons på en lang række stimuli, herunder kemoterapi og strålebehandling [21]. Telmisartan ved 100 uM i 48 timer faldt ekspressionen af ​​Bcl-2 og Bcl-XL, i hvilken spaltede fragmenter af caspase-3 blev påvist (fig. 2). Salg

HHUA celler blev behandlet med telmisartan ved 10 eller 100 pM, og cellelysater blev høstet efter 24 og 48 timer. En Western blot-analyse blev udført med en række antistoffer (Bcl-2, Bcl-XL, Bax, spaltet caspase-3 og GAPDH). Kontrol celler blev behandlet med køretøjet alene.

Effekter af Telmisartan på DNA skade responset og celledød

De udtryk for spaltet PARP blev undersøgt ved ELISA efter behandlingen af ​​HHUA celler med telmisartan i 48 timer. Telmisartan (100 uM) markant øgede niveauerne af spaltet PARP i HHUA celler (Fig. 3). At belyse aktivitet af effektorer i telmisartan-induceret apoptose, vi anvendte en Caspase-Glo 3/7 Assay, som måler caspase-3 og -7 aktiviteter. Efter behandling af HHUA celler med telmisartan ved 100 uM i 48 timer, caspase-3 og -7 aktiviteter blev opreguleret (fig. 4). Vi testede telmisartan-induceret DSB dannelse i HHUA celler. HHUA celler blev behandlet med 10-100 pM telmisartan i 24 eller 48 timer, og DSBs blev påvist under anvendelse pulseret felt-gelelektroforese (PFGE). Efter telmisartan behandlingen blev brudt DNA forøget på en dosis-afhængig måde i HHUA celler (Fig. 5). Dernæst udførte vi immunfluorescensfarvning af γ-H2AX at detektere DSB’er. Telmisartan-behandlede HHUA celler havde signifikant højere niveauer af fluorescens sammenlignet med de ubehandlede celler. Som vist i figur 6A, B, blev γ-H2AX opreguleret i de HHUA celler efter inkubering med telmisartan ved 10-100 uM i 24 eller 48 timer.

proteinekspression af spaltet PARP blev målt ved ELISA’er. HHUA celler blev behandlet med 100 pM telmisartan i 48 timer. Kontrolceller blev behandlet med bærer alene. Resultaterne repræsenterer de midler ± SD af tre uafhængige forsøg. Kolonner, midler; barer, SDS. **

P

. 0,01 vs. kontrol

aktiviteter caspase-3 og caspase-7 blev vurderet ved Caspase-Glo 3/7 Analyser. HHUA celler blev behandlet med 100 pM telmisartan i 48 timer. Kontrolceller blev behandlet med bærer alene. Resultaterne repræsenterer de midler ± SD af tre uafhængige forsøg. Kolonner, midler; barer, SDS. **

P

0,01 vs. kontrol

DSB dannelse blev analyseret ved PFGE.. HHUA celler opsamlet i Agarosepropperne, og deres DNA blev separeret efter størrelse på en agarosegel. Under elektroforese anvendte betingelser med høj molekylvægt genomisk DNA forblev i brønden, mens lavere molekylvægt DNA-fragmenter (flere Mbp til 500 kbp) migreret ind i gelen og blev komprimeret til et signal band.

(A) Tid og dosis afhængighed af histon H2AX phosphorylering med telmisartan. HHUA celler blev behandlet med 10 eller 100 pM telmisartan for angivne gange efterfulgt af immunfarvning anvendelse af et anti-γ-H2AX antistof. Deres kerner blev afsløret af DAPI-farvning. (B) Procentdel af γ-H2AX-positive celler. HHUA celler blev behandlet med 10 eller 100 pM telmisartan i 24 timer eller 48 timer. Kontrolceller blev behandlet med bærer alene. Telmisartan-behandlede celler havde signifikant højere niveauer af fluorescens sammenlignet med de ubehandlede celler. Resultater = middelværdier ± SD af tre uafhængige forsøg. Kolonner, midler; barer, SDS. *

P

0,05 vs. kontrol, **

P

. 0,01 vs. kontrol

antitumoraktivitet

in vivo

Vi testede evnen hos telmisartan til at inhibere proliferation af humane HHUA endometriale tumorer i immundefekte mus i løbet af 7 ugers behandling. Injektionen af ​​HHUA celler (5 x 10

6) førte til udviklingen af ​​robuste tumorer in vivo. Som vist i figur 7A, administration af telmisartan bemærkelsesværdigt undertrykt væksten af ​​disse tumorer. Alle behandlingsgrupper havde signifikant mindre tumorer sammenlignet med fortynder kontrolgrupperne (

P

0,01). Vi målte tumorvolumener på forskellige tidspunkter under hele behandlingen, og ved afslutningen af ​​undersøgelsen blev tumorerne dissekeres forsigtigt og vejes. Resultaterne med hensyn til vægt parallel lydstyrketasterne målinger (data ikke vist). Tumoren vægte var 77% lavere i behandlingsgrupperne end i kontrolgruppen kohorte (

P

0,01).

(A) HHUA celler (5 x 10

6) var bilateralt subkutant injiceret i stammerne af nøgne mus, danner to tumorer per mus. Musene blev inddelt tilfældigt i kontrol- og forsøgsgrupper. Telmisartan (100 ug /mus) eller fortyndingsmiddel (kontrol) blev indgivet intraperitonealt i 5 dage om ugen i 7 uger. Efter 7 ugers behandling blev tumorerne fjernet fra hver mus og vejet. Tumor vægt i de to grupper var signifikant forskellige. Kolonner, midler; barer, SDS. **

P

0,01 vs. kontrol. (B) Effekten af ​​telmisartan på HHUA tumorer i nøgne mus. De endometriske carcinoma celler fra mus behandlet med telmisartan udviste signifikant svagere farvning for Ki-67 sammenlignet med kontrol endometrisk carcinoma celler. (C) endometriekarcinom celler fra mus behandlet med telmisartan undergik apoptose (TUNEL-positive). Alle assays blev udført tre gange. Kolonner, midler; barer, SDS. **

P

. 0,01 vs. kontrol

I løbet af undersøgelsen blev alle mus vejet og deres LV tryk blev registreret en gang om ugen. Gennemsnitlige legemsvægte i behandlingsgrupperne var 91% -104% af den gennemsnitlige legemsvægt i kontrolgruppen (data ikke vist). Ved baseline, LV trykværdier de var ikke forskellige mellem grupperne (telmisartan gruppe, 52,8 ± 10,8 mmHg, kontrolgruppe, 52,6 ± 11,0 mmHg) (gennemsnit ± SD). En uge efter administration er den gennemsnitlige LV tryk af telmisartan gruppen var signifikant lavere end for kontrolgruppen (50,4 ± 7,1 mmHg vs. 68,8 ± 13,1 mmHg henholdsvis;

P

0,01). Ved afslutningen af ​​undersøgelsen, LV tryk for kontrolgruppen var 68,8 ± 6,3 mmHg og den for telmisartan gruppen var 58,0 ± 3,9 mmHg (

P

0,01)

. generelt på tværs af alle grupper, alle mus syntes at være sund. Ingen signifikante forskelle i gennemsnitlig vægt blev fundet mellem fortyndingsmiddel-behandlede mus og dem, der modtog 7 uger af behandlingen (data ikke vist). HHUA tumorer blev udtaget prøver til ekspression af Ki-67 ved en immunhistokemisk analyse, og en TUNEL-assayet blev udført på formalinfikserede, paraffinindlejrede sektioner. De HHUA endometrisk carcinoma celler behandlet med telmisartan udviste negativ eller fokal svag farvning for Ki-67 og syntes at undergår apoptose (dvs. de var TUNEL-positive). De kontrol HHUA endometrie carcinomceller fra ubehandlede mus viste stærk nuklear farvning for Ki-67 og var negative for apoptose (fig. 7B, C).

Diskussion

Fedme, overskydende østrogen, type II diabetes og hypertension er nogle af de vigtigste risikofaktorer for endometrisk carcinom [4], [22] – [24]. PPARy tilhører en familie af nukleare hormonreceptorer, der omfatter østrogen og skjoldbruskkirtel hormon-receptorer [25], [26]

De foreliggende resultater viste, at blandt de testede ARB’er.; kun telmisartan var i stand til at inducere inhibering af cellelevedygtighed for endometriecancer cellelinier. Den inhiberende virkning af telmisartan blev reduceret i nærvær af en PPARy-inhibitor, GW9662. Det blev rapporteret der er vigtigt krydstale mellem PPARy og østrogen receptor [25], [27], [28]. Ota et al. rapporterede, at PPARy-immunreaktivitet blev påvist i 65% af endometrisk carcinoma væv opnået fra patienter ved immunhistokemi. De fandt også, at en PPARy-ligand, 15d-PGJ

2, har antiproliferativ aktivitet i endometriecancer-celler (Ishikawa, Sawano, RL95-2 celler) [4]. Benson et al. rapporterede, at telmisartan fungerede som selektive PPARy partiel agonist, aktivering af receptoren til 25% til 30% af det maksimale niveau, der opnås ved den fulde agonister pioglitazon og rosiglitazon. Andre ARB’er mangler telmisartan potentiale for receptor-interaktion og har relativt ringe eller ingen virkning på PPARy-aktivitet [7]. Det ville derfor være en mulig mekanisme, der telmisartan har anticancer effekter via PPARy-afhængige vej.

Det er også blevet påvist, at telmisartan apoptose og DNA fragmentation i humane urologisk cancer [8], [9] , [29]. Her fandt vi, at behandling med telmisartan markant stigning i antallet af apoptotiske celler i alle endometriske carcinoma cellelinier undersøgt. I annexin V assay og MTP evaluering, telmisartan induceret apoptose i 48 timer behandling ved 100 uM. Denne virkning var forbundet med et fald i niveauerne af anti-apoptotiske proteiner bcl-2 og Bcl-XL. Caspase 3/7 aktivitet steg også som reaktion på stimulus af 48 timer telmisartan behandling ved 100 uM. Vores resultater vedrørende caspase-3 spaltning og PARP spaltning tyder på, at denne apoptosome pathway kan aktiveres efter behandling med telmisartan.

En række kaskader af signalering begivenheder indledes som reaktion på DSBs, til at udføre apoptose [30] , [31]. Brug af puls-felt-gelelektroforese og immunfluorescensfarvning af γ-H2AX, fandt vi, at telmisaratan inducerede DSB’er. H2AX er et medlem af histon H2A familien, og phosphorylering af H2AX i serin 139, som kaldes “γ-H2AX,” er relateret til DSBs [32] – [35]. En γ-H2AX protein anses for at være den mest genkendelige protein i assays til måling af DNA-beskadigelse [36]. En DSB er den mest kritiske DNA-beskadigelse [37], [38]. En DSB er tilstrækkelig til at dræbe en celle, når den ikke er repareret [37] – [39]. I den foreliggende undersøgelse forekom DSB’er i HHUA celler efter 24 timer af 10-pM telmisartan behandling. I modsætning hertil Western blotting viste, at caspase 3 spaltning ikke var klart ved 24 timer af 10-pM telmisartan behandling i HHUA celler. Disse data tyder på, at DSBs kunne induceres før apoptose med telmisartan behandling.

Vores in vivo data viste, at apoptose involverer tumor område fandt sted i de nøgne mus behandlet med telmisartan, og dette antitumoraktiviteten var ikke ledsaget af nogen større bivirkninger, øge muligheden at telmisartan kan tjene som en nyttig terapi til behandling af endometrisk carcinoma. Fordi vi startede telmisartan behandling dagen efter maligne celler blev injiceret i mus, kan vi ikke konkludere, at telmisartan er effektiv mod voluminøse tumorer, som ofte observeres i kliniske omgivelser; yderligere undersøgelser er nødvendige for at afklare dette spørgsmål. Ikke desto mindre fandt vi, at telmisartan viste dybe antitumoraktivitet in vivo, og vi bekræftede, at en lille tumorbyrde kan udryddes ved denne forbindelse i mus. Dette fund tyder på, at telmisartan terapi kan være særlig effektiv for personer, der har minimal residual sygdom efter kurativ kirurgi, kemoterapi og /eller strålebehandling. Selvom LV trykket af telmisartan gruppen faldt i disse eksperimenter, af telmisartan gruppe ikke blev ændret i syv uger og alle mus syntes at være sund (data ikke vist).

Den mekanisme, hvorved telmisartan udøver sin anticancer aktivitet er fortsat uklart. I urologiske cancerceller, kan telmisartan mediere potente anti-proliferative virkninger gennem PPARy [29]. I prostatacancerceller, telmisartan interageret med nogle signalveje; én til at blokere AT1R som ARB, og den anden som en transkriptionsfaktor virker som PPARy-ligand med PPARy afhængige og uafhængige interaktioner [10]. Som andre ARB’er inhiberer signaltransduktion gennem epidermal vækstfaktor (EGF) eller interleukin (IL) -6 signaler, telmisartan hæmmer også yderligere signaler af PPARy-aktivering [10], [40]. Yamamoto et al.