PLoS ONE: Selektiv Aflivning af kræftceller ved Ashwagandha Leaf Extract og sine Withanone Involverer ROS Signaling

Abstrakt

Baggrund og formål

Ashwagandha er en populær ayurvedisk urt bruges i indisk traditionelle hjem medicin. Det er blevet tildelt en række sundhedsfremmende effekter af hvilke mekanismer forbliver ukendte. Vi har tidligere rapporteret selektivt drab af cancerceller ved blad ekstrakt af Ashwagandha (i-ekstrakt) og dens oprensede bestanddel Withanone. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi dens mekanisme ved tab af funktion screening (ophævelse af i-ekstrakt induceret cancercelledrab) af de cellulære mål og gen veje.

Metode /vigtigste resultater

Randomiseret ribozym bibliotek blev indført i cancerceller før behandlingen med i-ekstrakt. Ribozymer blev udvundet fra celler, der overlevede i-Extract behandling. Genmål de valgte ribozymer (som forudsagt af databasesøgning) blev analyseret ved bioinformatik og pathway analyser. Målene blev valideret for deres rolle i i-ekstrakt induceret selektiv drab af kræftceller ved biokemiske og molekylære analyser. Femten genprodukter mål blev identificeret og blev undersøgt for deres rolle i specifikke cancercelledrab aktivitet i-ekstrakt og dets to hovedkomponenter (Withaferin A og Withanone) ved at gennemføre den shRNA-medieret gen silencing tilgang. Bioinformatik på det udvalgte gen-mål afslørede inddragelse af p53, apoptose og insulin /IGF signalveje knyttet til ROS signalering. Vi undersøgte inddragelse af ROS-signalering komponenter (ROS niveauer, DNA-skader, mitokondriestruktur og membranpotentialet), og vise, at det selektive drab af kræftceller medieres af induktion af oxidativt stress.

Konklusion

Ashwagandha blad ekstrakt og Withanone forårsager selektiv drab af kræftceller ved induktion af ROS-signalering og dermed er potentielle reagenser, der kunne rekrutteres til ROS-medieret cancer kemoterapi

Henvisning:. Widodo N, Priyandoko D, Shah N, Wadhwa R, Kaul SC (2010) Selektiv Killing af kræftceller ved Ashwagandha Leaf Extract og sine Withanone Involverer ROS Signaling. PLoS ONE 5 (10): e13536. doi: 10,1371 /journal.pone.0013536

Redaktør: Vladimir N. Uversky, Indiana University, USA

Modtaget: Juli 20, 2010; Accepteret: September 23, 2010; Udgivet 21. oktober, 2010

Copyright: © 2010 Widodo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af tilskud fra den Nye Energi og Industrial Technology Development Organization (Japan). N. S. er en modtager af MEXT Scholarship, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

indiske traditionelle hjem medicin-system, Ayurveda er kendt for sin ældste historie i verden. Ashwagandha (

withania somnifera

, Solanaceae) urt, stolt kaldet dronning af Ayurveda, er en af ​​de mest almindeligt anvendte planter i Ayurveda for en række effekter, der spænder fra smertestillende, astringerende, adaptogen, anti-inflammatorisk, anti -stress, antispasmodic, anti-diabetes, Immunstimulerende og hjertebeskyttende [1] – [4]. Uddrag fra forskellige dele af planten, herunder roden, skyde, frø og bær har været i brug i forskellige hjem-retsmiddel opskrifter; rod er særligt en fælles kilde til sundhedsfremmende alkaloider, withanolides og antioxidanter. De vigtigste aktive bestanddele af Ashwagandha blade er alkaloider og steroide lactoner (almindeligvis kendt som withanolides) [5] – [7]. Vi havde tidligere undersøgt den biologiske aktivitet i et alkoholisk ekstrakt af Ashwagandha blade ekstrakt (i-ekstrakt) og viste, at det har en stærk anti-cancer-aktivitet. Ved kemisk fraktionering blev aktiviteten tildelt sit konstituerende Withanone (i-faktor), der blev vist at forårsage aktivering af tumorsuppressorprotein p53 i cancerceller kun [8], [9]. Normale humane fibroblaster viste nedregulering af p53-funktion og forsinket ældning [10].

I den foreliggende undersøgelse, vi forventede, at den selektive cancer celledræbende virkning af I-ekstrakt eller Withanone sandsynligvis være medieret af mere end én gener /veje og dermed foretaget en uvildig tab af funktion tilgang, hvor gen knockdown blev opnået ved hammerhaj ribozymer. Ribozym befolkning reddet fra randomiserede ribozym bibliotek-inficerede humane brystkræftceller, der overlevede i-Ekstrakt behandling blev karakteriseret. Bioinformatik, biokemiske og visuelle analyser blev anvendt til at undersøge de identificerede gen-mål og til at afsløre deres involvering i i-Extract-induceret kræft celle drab. Vi viser, at det selektive drab af kræftceller ved i-ekstrakt og dets komponent Withanone involverer ROS signalering.

Resultater og Diskussion

Hammerhead ribozymer (HH-RZ) er de små katalytiske RNA, der besidder konserveret hammerhoved lignende sekundær struktur. De fold til den aktive konformation ved binding til metalioner og hydrolysere phosphodiesterbindinger af RNA-strenge på bestemte steder (NUX, hvor N kan være hvilket som helst nukleotid og X kan være A, C eller U), og dermed er kendt som “RNA-saks” [ ,,,0],11], [12]. HH-Rz har været i brug som genera- lyddæmpende værktøjer på grund af deres funktioner såsom høj substrat bindingsspecificitet, autokatalytiske aktivitet, som ikke kræver andre enzymer, fleksibel struktur, som tillader manipulationer og manglende interferon respons i pattedyrceller [13], [ ,,,0],14]. For at generere en genspecifik ribozym, er dens arme anerkendelse (7-9 nukleotider, der flankerer målområdet) designet til at omfatte sekvens komplementær til mål-mRNA’et. Randomisering af disse 7-9 nukleotider i hver arm giver en lang række ribozym stand til at målrette multiple mRNA substrater [11]. Sådan pulje af degenererede ribozymer udtrykkes fra en exogen promotor er blevet anvendt som et værktøj til identifikation af gener involveret i apoptose, migration, invasion, differentiering og sygdomme [15] – [20]. For at identificere de cellulære mål involveret i kræft celle cytotoksiciteten af ​​Ashwagandha blade ekstrakt (i-Extract), vi inficerede de MCF7 celler med retrovirus drevet randomiseret ribozym bibliotek inden behandlingen. Som vist i figur 1, når vektor inficerede (kontrol) celler behandlet med i-ekstrakt resulterede i celledød viste ribozym bibliotek inficeret kultur celleoverlevelse. Ribozymer blev reddet fra disse overlevende cellepopulation og karakteriseret ved kloning og sekvensanalyse. Gene mål for de isolerede ribozymsekvenser blev bestemt ved databasesøgning (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). De potentielle gen-mål for de ribozymsekvenser, der blev isoleret flere gange, er opført i figur 1C. For at validere inddragelse af disse gener i i-ekstrakt induceret cancercelledrab, vi foretog to-vejs-analyser (i) gen specifikke shRNA-medieret lyddæmpning og (ii) bioinformatik og systembiologi rettet sti undersøgelse. Vi forberedte 7 gen (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 og ING1) specifikke shRNAs og undersøgt deres involvering i i-ekstrakt og dets komponenter (Withanone og Withaferin A) induceret MCF7 celle drab. Selv under effektiviteten af ​​transfektion i området fra 40-60%, som bestemt ved transfektion af en GFP-udtrykkende plasmid, silencing af fire gener (gruppe 1 – TPX2, ING1, TFAP2A og LHX3) var associeret med signifikant (20-40%) stigning i celleoverlevelse efter i-Extract behandling (figur 2). De andre tre gener (Gruppe 2 – IGF2R, SREBF2 og AKAP11) viste kun mindre (2-8%) stigning i overlevelse. Endvidere celler kompromitteret til ekspression af fire Gruppe 1-gener undslap den cytotoksiske virkning af både Withanone og Withaferin A. Disse data tydede på, at disse fire gener medierer cytotoksicitet i-ekstrakt. Dog kan de ikke være kritisk involveret i selektiv toksicitet i-ekstrakt og Withanone til kræftceller, som beskrevet i vores tidligere undersøgelser viser inddragelsen af ​​p53 tumor suppressor pathway i dette fænomen [8]. Disse data indikerede, at cancercelledrab af i-ekstrakt var medieret, i det mindste delvist, ved TPX2, ING1, TFAP2A og LHX3. TPX2 er en mikrotubulus-associeret protein, der fungerer som en allosterisk regulator af Aurora-A, et onkogen med væsentlig rolle i centrosom modning og kromosom segregering under mitose kræver montering og vedligeholdelse af en bipolar spindel [21] – [23]. Det overudtrykkes i flere humane cancere og er blevet foreslået som et attraktivt mål anti-cancer [24]. TFAP2A spiller afgørende rolle i tumorvækst og fremadskriden ved regulering af E-cadherin, MMP-2, c-kit, p21

WAF-1, HER-2, BCL-2, insulinlignende vækstfaktor-receptor-1 og Smad signalering [25]. LHX3 er en homeodomæne transkriptionsfaktor og spiller positiv rolle i fosterudviklingen, celle skæbne beslutsomhed og onkogenese [26], [27]. På den anden side, ING1, en ING familie protein, er involveret i human cellulær senescens, tumor suppression og apoptose [28], [29]. ING1 har vist sig at modulere p53 aktivitet og dens nedstrømseffektorer, p21

WAF1 og Bax ved acetylering og stabilisering [30]. Tilsammen data foreslog, at kræftcellen drab af i-ekstrakt kan indebære undertrykkelse af TPX2, TFAP2A og LHX3, og aktivering af ING1 funktioner; mekanismen og selektivitet til kræftceller stadig remian uklar.

Skematisk præsentation af tab af funktion screening ved hjælp af randomiserede ribozym bibliotek. Kontrol celler behandlet med i-ekstrakt viste cytotoksicitet (

A

). i-ekstrakt behandlet overlevende celler blev indsamlet (

B

). Ribozymer blev reddet fra de overlevende celler ved kloning og blev karakteriseret ved sekvensanalyse (

B

). Kandidat gen mål er vist i (

C

).

Celler blev transficeret med vektorer udtrykker shRNA for angivne gener. Effekten af ​​I-ekstrakt blev bedømt ved celleviabilitetstest. Resultaterne repræsenterer middelværdien af ​​tre eksperimenter. Statistisk signifikans blev beregnet ved variansanalyse (ANOVA) test.

For at identificere vigtige cellulære mål, vi næste foretog bioinformatik og systembiologi tilgang og undersøgt netværket /veje for de identificerede gen mål beskrevet ovenfor (figur 3). Analyserne viste inddragelse af isolerede genmål i flere slags biologiske processer såsom onkogenese, cellecyklus, DNA-reparation og nukleinsyre metabolisme (figur 3A). De øverste to identificerede veje var p53 tumor suppressor (gen mål – DDB2, CDKN1A, CDKN2B) og apoptose (gen mål – IGF2R og HSPA9). Notatet analyserne viste, at 33% af de involverede i p53 pathway og dets regulering, og 7% af de involverede i apoptose gener gener blev identificeret tyder på, at cellen drab af i-ekstrakt involverer vækst anholdelse eller apoptose, medieret ved aktivering af tumor suppressor p53 pathway. Hertil kommer, Ras, insulin /IGF, angiogenese og cytoskelettet regulering veje, der er tæt forbundet med apoptose og tumor udvikling blev også identificeret. Disse resultater viste, at nedregulering af målgener ophæver i-Extract medieret celledrab ved at beskytte cellerne mod DNA-skade, cellecyklusstop og apoptose. Netværk interaktion analyse af målgener udtænkt fire gen-klynger – CDK4, TFAP2A, CDKN1A-p21 og ING1 forbundet af p53 og PCNA. Inddragelse af disse gen-klynger i i-ekstrakt induceret cytotoksicitet tyder på, at det kunne karakteriseres som cellulære responser, herunder stress respons (HSPA9, CDKN1A) og DNA skader og reparation respons (ING1, DDB2 og TFAP2A), der kulminerede i enten cellecyklus arrest eller apoptose (figur 3D). Baseret på disse parametre identificeret af bioinformatik analyse, vi forudså, at i-ekstrakt kan forårsage en aktivering af cellulært stress signalering af ROS-medierede pathways initieret på to niveauer (i) mitokondrie stress fører til ændring i membranpotentiale og (ii) DNA-skader stress, der fører til aktivering af DNA-skader og reparation maskiner (figur 3E). Notatet fleste identificerede genmål syntes at passe ind i de forudsagte signalveje (figur 3e). For at teste denne hypotese undersøgte vi, om CDKNIA-p21 er den kritiske regulator af i-Extract medieret cancercelledrab. Som vist i figur 4 blev i-ekstrakt medieret vækststandsning i MCF7-celler (figur 4A) i forbindelse med en aktivering af CDKN1A-p21 (figur 4B). Vi undersøgte også at undersøge, om CDKN1A-p21 var en kritisk mediator af i-ekstrakt induceret selektiv cancercelledrab. Som vist i figur 4B og 4C, hvorimod CDKN1A-p21 blev forøget i MCF7-celler, forblev uændret i normale (TIG-3) celler som respons på enten i-ekstrakt eller Withanone behandling. I modsætning hertil Withaferin A forårsagede cytotoksicitet til både kræft og normal celle og blev set til at aktivere CDKN1A-p21 (figur 4C). Derefter undersøgte vi aktiveringen af ​​CDKN1A-p21 i kontrol og i-ekstrakt behandlet MCF7-celler efter transfektionerne af fire shRNAs der ophævede i-ekstrakt induceret MCF7 celledrab, i det mindste delvist (figur 2). Som vist i figur 4D og 4E, fandt vi, at i-Extract inducerede stigning i CDKN1A-p21-ekspression blev ophævet ved knockdown af hver af disse fire målgener. Disse data viste, at CDKN1A-p21 er en kritisk mediator af i-ekstrakt induceret selektiv vækst anholdelse i kræftceller. Vi endelig testet denne hypotese ved at ansætte isogen p53

+ /+, p53

– /-, p21

+ /+ og p21

– /- HCT116 kolon kræftceller. Vi fandt, at mens p53

+ /+ og p53

– /- celler viste sammenlignelig følsomhed over for i-ekstrakt (data ikke vist), p21

– /- celler var to-tre gange mere tolerante over for i-ekstrakt behandling sammenlignet med p21

+ /+ -celler (Figur 4F) der godkender at CDKN1A-p21 er faktisk en afgørende mediator af vækststandsning induceret af i-ekstrakt i cancerceller. Dataene var i overensstemmelse med vores model foreslået i figur 3E.

Biologiske processer, der var involveret i i-ekstrakt medieret celledød blev forudsagt at omfatte onkogenese, celledeling og cellecyklus (

A

) og involverede p53, apoptose, og insulin /IGF signalveje (

B

). De fleste fremherskende blandt disse veje var p53 og apoptose (

C

). De målgener optrådte som fire klynger (CDK4, p21, ING1 og TFAP2A), der var forbundet med p53 og PCNA, involveret i cellecyklus, DNA-skader reaktion og DNA-reparation gen (

D

). Baseret på de udvalgte gen mål, blev det forudsagt, at i-Extract medieret kræft celledræbende involveret ROS- medieret skade på DNA og mitokondrie niveau med CDKN1A som en kritisk mediator (

E

).

i-ekstrakt induceret vækst anholdelse af MCF7-celler skyldtes deres anholdelse på G2 cellecyklus fase (

A

). En stigning i CDKN1A-p21-ekspression blev set i MCF7-celler, når de behandles med i-ekstrakt og Withanone. Ingen stigning i CDKN1A-p21-ekspression blev set i normale celler i tilstedeværelse af enten i-ekstrakt eller Withanone (

B

og

C

). Knockdown af hver af de fire angivne gener, kompromitteret i-ekstrakt induceret cytotoksicitet reverterede også i-Extract induceret CDKN1A-p21 opregulering (

D

og

E

). HCT116 p21

– /- celler var mindre følsomme over for i-ekstrakt i forhold til deres isogene p21

+ /+ celler. Cellelevedygtighed som reaktion på de serielt stigende koncentrationer af i-ekstrakt (

F

).

Som forudsagt ved pathway analyse (figur 3E), Derefter undersøgte vi involvering af DNA-skader og reparation-signalvejen i i-ekstrakt induceret kræft celle drab. Som vist udviste MCF7-celler induktion af γH2AX (en tidlig markør for DNA beskadigelse respons) som reaktion på behandlingen med i-ekstrakt, Withaferin A og Withanone (figur 5A og 5B). Vi undersøgte også phosphoryleringen af ​​γH2AX ved immunofarvning med en phosphorylering specifikt antistof og fandt, at antallet af celler indeholdende phosphoryleret γH2AX var 70% højere i i-Uddrag behandlede celler sammenlignet med kontrollen (figur 5B). Ud fra følgende betragtninger Withaferin En behandling induceret γH2AX i både normale og cancerceller, i-ekstrakt og Withanone induceret γH2AX kun i kræftceller (figur 5A og 5C). Tilsammen viste disse data, at den selektive cancercelledrab af i-ekstrakt og Withanone blev medieret af induktion af DNA-skader og CDKN1A-p21, som forudsagt i figur 3E.

DNA skader foci (

A

), induktion og γH2AX fosforylering (

B

) -assessed ved farvning med phospho-specifikt antistof (100-200 celler pr slide blev talt) blev påvist i MCF7 celler behandlet med i-ekstrakt, Withaferin A og Withanone. Normale celler viste DNA-skade responset på behandling med kun Withaferin A (

A

og

C

).

Vi næste undersøgt inddragelse af stress respons indledt på mitokondrier i i-ekstrakt induceret MCF7 celle drab. Som vist i figur 6A og 6B, induktion af ROS i nærvær af i-ekstrakt blev påvist ved både immunfarvning og fluorescens Probe (HPF) metoder. I overensstemmelse med cytotoksicitet af de to komponenter (Withaferin A og Withanone) af i-ekstrakt, blev ROS induktion opdaget af begge komponenter i MCF7-celler og kun ved Withaferin A i TIG-3 celler. Disse data viste, at behandlingen med i-ekstrakt og Withanone fører til induktion af ROS, selektivt i cancerceller, kunne derfor være ansvarlig for selektiv cancercelledrab. Vi analyserede dernæst mitokondrielle membranpotentiale, der er stærkt påvirket af ROS-niveauer. Som vist i figur 6C og 6D, var der et fald i mitokondrie membranpotentiale i MCF7-celler som set af både JC-1-farvning og Rho-123 udelukkelse assay. Ved behandling med I-ekstrakt, MCF7 celler viste skift i JC-1-farvning fra rødt til grønt (figur 6C) og negativ for Rho-123 farvning. Af note, normal (TIG-3) celler var refraktære over for disse ændringer, når de behandles med enten I-ekstrakt eller Withanone (figur 6C). Disse data gjort os til at tro, at i-ekstrakt induceret selektivt drab af cancerceller, der er involveret ROS stress og skade på mitokondrier. For at opnå mere klare beviser undersøgte vi ultrastruktur kontrol og i-ekstrakt behandlet MCF7-celler ved enkeltcelle-niveau. Som vist i figur 6E, styre MCF7 celler viste typiske mitokondrie morfologi, kendetegnet ved en dobbelt membran indeholdende en homogen matrix og et system med parallel cristae. Withanone behandlede celler viste opsvulmede mitokondrier med en ændret morfologi hvilken afkortning og reduktion i antallet af cristae var tydelige (figur 6E).

MCF7 celler viste induktionen af ​​ROS, når de behandles med i-ekstrakt, Withaferin A eller Withanone (

A

og

B

). Normale celler viste ROS induktion kun i overværelse af Withaferin A (

A

). Tab af mitokondrie membran potentiale i MCF7 cancerceller, som set af JC-1 farvning blev detekteret med i-ekstrakt kun (

C

). Differentieret induktion af tab af mitokondrie trans-membran potentiale i MCF7-celler påvises ved flowcytometri hjælp RHO-123 steg fra 0,2% af befolkningen i kontrol til 44% af befolkningen er behandlet med i-ekstrakt (

D

). Skade på mitokondrier blev påvist i Withanone-behandlede MCF7-celler. (

E

), Transmission elektron mikroskopiske billeder af kontrol og Withanone-behandlede MCF7-celler. Kontrol celler viste normale aflange mitokondrie (M) med parallel cristae (a) (forstørret boxed billede,

b

), Withanone-behandlede celler viser opsvulmede mitokondrier med reduceret antal af cristae (c) (forstørret boxed billede,

d

). N, Nucleus.

ROS er kemisk reaktive molekyler, der har væsentlig rolle i signaltransduktion, cellevækst og differentiering, regulering af enzym-aktiviteter og immunreaktion herunder inflammation og cytokinproduktion. Betragtninger en moderat stigning i ROS fremmer celledeling og differentiering, dens stor mængde forårsager uoprettelige oxidative skader på DNA, proteiner og lipider, der fører til celledød. Cancerceller ofte udviser høj oxidativt stress og øget produktion af reaktive oxygenarter (ROS) sammenlignet med de normale modstykker. Denne højere grad af ROS tjener som et selektivt terapeutisk mål ved at gøre cancerceller sårbare over for ROS-producerende reagenser, der foreslås som kemoterapeutiske reagenser [31]. Et lille antal undersøgelser har fremlagt beviser for ROS- medieret selektiv drab af kræftceller. Disse omfatter, selektiv apoptose i cancerceller ved avocado ekstrakt [32], beta-phenylethyl isothiocyanat (PEITC) [33], thalidomid analoger [34] og MKT077 [35] – [36]. Interessant er de fleste af disse reagenser er blevet vist at forårsage mitochondrial dysfunktion [31] – [39]. Vi har vist, for første gang, at Ashwagandha blade ekstrakt (i-Extract) og dens komponent, Withanone fungere som ROS-producerende stoffer forårsager DNA og skade på mitokondrier discriminately til kræftceller, og dermed er gode kandidater til sikker kræftbehandling.

Materialer og metoder

Celler og randomiseret hammerhovedribozym bibliotek screening

Humane normale fibroblaster (TIG-3), bryst carcinom (MCF7), colon carcinom (HCT116- p53

+ /+, p53

– /-, p21

+ /+ og p21

– /-) og muse-pakkeceller, PLAT-E blev opnået fra japansk Collection of Research Bioressourcer (JCRB) Cell bank og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM) som tidligere beskrevet [8] – [10]. Celler blev behandlet med i-ekstrakt, Withanone og Withaferin A i 48-72 timer for levedygtighed, biokemisk og visuelle analyser. Randomiseret ribozym bibliotek (pMX-puro /Rz) blev fremstillet og inficeres i MCF7-celler som tidligere [15] beskrevne. Inficerede celler blev selekteret i puromycin (2 ug /ml) -supplemented medium i 24-48 timer og blev derefter behandlet med i-ekstrakt. RNA blev fremstillet under anvendelse af Isogen (Invitrogen), fra overlevende celler efter 4-5 dage, hvor alle cellerne i kontrol skålen var død. Totalt RNA (2 ug) blev anvendt til RT-PCR. Revers transskription blev udført med lavere primer (5′-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTG GTA C-3 ‘) og MMLV transkriptase (42 ° C, 90 minutter) og RT-produktet blev underkastet PCR-amplifikation under anvendelse af øvre (5’ -tcc CCG GTT CGA aac CGG GCA-3 ‘) og lavere primere (94 ° -52 ° -72 ° /30 sek hver, 20 cyklusser). Det amplificerede PCR-produkt (-150 bp) blev klonet ind i en TA-kloningsvektor (Promega) og sekventeret under anvendelse af T7 primer. Salg

genspecifikke shRNA-vektor klonings- Salg

shRNA ekspressionsvektorer til 7 gener (IGF2R, SREBF2, AKAP11, TFAP2A, LHX3, TPX2 og ING1) blev fremstillet som beskrevet [15]. To målsteder blev udvalgt til hver af genet. De målsekvenser udvalgt til ING1 var ATATGAAGTTTAAATTCTA og GCCAAGACCTCCAAGAAGA for TPX2 var GCAAGAAGGATGATATTAA og GGGGAAGAATGGAACTGGA, for TFAP2A var GGAGGAAGATCTTTAAGAG og GATCAAACTGTAATTAAGA for AKAP11 var GAGTGAAGCTTTATCAAAT og GCACAAACATGGAAAGTCA for SREBF2 var GCCTCAACCTCAAACTCAG og ATGCAAAGGTCAAAGATGA, for LHX3 var GCGACGAGTTCTACCTCAT og GGGAGAGCGTTTACTGCAA og for IGF2R var GGCAGAAACCCAAACTGAA og GGAGGAAATACTACATTAA.

Cellelevedygtighed assay

human brystcancer (MCF-7) -celler blev transficeret med 50 ng af det angivne plasmid-DNA. Efter 24 timer blev celler behandlet med i-ekstrakt (6 ug /ml), Withaferin A (1 uM), Withanone (25 ug /ml) i 48 timer. Tomme shRNA vektor blev anvendt som kontrol. Cellernes levedygtighed blev overvåget ved WST-baserede celleproliferationsassay (Roche). Doserne til I-ekstrakt og Withanone blev udvalgt baseret på selektiv aflivning af cancerceller som beskrevet tidligere (8-10). Lavere doser af i-ekstrakt og Withanone blev set til at fremkalde differentiering af glioblastom og neuroblastomceller [40, og data ikke vist].

Western blotting

Hele cellelysat (10-20 ug) i NP40 lysepuffer opnået ved centrifugering ved 10.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C blev anvendt til immunblotning som beskrevet [8]. Anvendte antistoffer var p53 (DO-1, Santa Cruz Biotechnology), anti-Mortalin [8], p21 (C-19; Santa Cruz Biotechnology) og anti-γH2AX-Phosphoryleret (Ser139) antistof (Biolegend)

Immunfarvning Salg

Celler blev vasket med phosphatbufret saltvand (PBS), fikseret med methanol: acetone (1:01), permeabiliseret i 0,2% PBST, blokeret med 2% BSA (bovint serumalbumin) /PBS og inkuberet med første og andet antistof fortyndet i 2% BSA /PBS [8]. For γH2AX farvning blev cellerne fikseret med 4% formaldehyd og permeabiliseret med KCM-opløsning (120 mM KCI, 20 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 0,1% Triton). Blokering og antistofpræparatet blev udført i Abdil opløsning (2% BSA, 0,2% gelatine, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 20 mM Tris pH 7,5, 0,1% natriumazid i MilliQ vand).

Påvisning af reaktive ilt arter

de reaktive ilt arter blev opdaget af fluorescerende farvning hjælp af Image-iT ™ LIVE Grøn reaktive ilt arter (ROS) Detection Kit (Molecular Probes Inc, USA). Celler blev dyrket på dækglas placeret i 12-brønds plader og behandlet med angivne reagenser i 48 timer og farvet for ROS følge proceduren anbefalet af producenterne. Kvantificering af ROS produktion med FACS-analyse var baseret på HPF (2- [6- (4′-hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-0n-9-yl] benzoesyre) fluorescens. Kort fortalt blev MCF-7-celler dyrket i 6-cm skål indtil 50% konfluens, behandlet med i-ekstrakt i 12 timer efterfulgt af tilsætning af HPF (10 mM). Efter 4 timer blev cellerne vasket med PBS, høstet med celleskraber. Cell fluorescens blev målt ved Coulter Epic XL flowcytometer (Beckman).

Mitokondriel membranpotentialet

mitrokondriemembranen for kontrol og behandlede celler blev undersøgt af JC-1 og RHO-123 [35] baserede celle-farvende assays. For JC-1-farvning, MCF7-celler dyrket i plader med 24 brønde (50-60% konfluens) blev behandlet med i-ekstrakt i 48 timer efterfulgt af inkubering med JC-1-farvning (10 ug /ml) i 15 minutter ved 37 ° C i CO

2 inkubator. Cellerne blev vasket med PBS og behandlet til mikroskopi. For RHO-123 assay blev MCF-7-celle dyrket i 6 cm skål indtil 50% konfluens, behandlet med i-ekstrakt i 48 timer. De behandlede celler blev inkuberet med Rho123 (1 mM) -supplemented medium i 1 time. Celler blev vasket med PBS og høstet med celle-skraber. Ændringer i mitochondriemembranpotential blev overvåget af Coulter Epic XL flowcytometer (Beckman).

Enkelt celle ultrastrukturelle analyse

MCF7-celler blev udsået på dækglas. Ved 60% konfluens, blev celler behandlet med Withanone i 24 timer. Kontrol og behandlede celler blev vasket med PBS og derefter fikseret med 1,2% glutarldehyde i 4 ° C i 1 time. Efter post-fiksering med 1% OSO

4 ved 4 ° C i 1 time blev cellerne vasket i PBS og dehydratiseret gennem graduerede ethanolkoncentrationer med sidste inkubation i n-butyl glycidyel ether i 15 minutter. Prøverne blev indlejret i Epoxy harpiks (TAAB) og blev skåret i ultra-tynde sektioner med en Reichert ultramikrotom (Leica). Snittene blev farvet med uranylacetat og bly citrat og undersøgt med et Hitachi H-7000-elektronmikroskop. At vurdere mitokondrie ændringer blev -50 celler pr prøve observeret fra to uafhængige forsøg.

Bioinformatik og statistiske analyser

Pathway analyse og biologisk proces forening blev kortlagt ved hjælp PANTHER-Expression dataanalyse [41] , [42], et begrebsmæssigt simpel binomialtest at sammenligne klassifikationer af flere klynger af valgte liste med en referenceliste (NCBI:

Homo sapiens

Gener) til statistisk bestemme over- eller underrepræsentation af kategorier PANTHER klassificering. Biologisk proces resultat blev valgt baseret på overrepræsentation værdi og P-værdi mindre end 0,5. Protein-protein interaktioner for målgener blev udført med Osprey baseret på den generelle Respository for interaktion Datasæt (nettet) og Gene onthology (GO) [43].