PLoS ONE: Virkningerne af CA9 Gene polymorfier og miljøfaktorer har for Oral-Cancer modtagelighed og Clinicopathologic Karakteristika i Taiwan

Abstrakt

Baggrund

I Taiwan, kræft oral er kausalt været forbundet med miljømæssige kræftfremkaldende stoffer . Karboanhydrase 9 (CA9) er efter sigende overudtrykt i flere typer af carcinomer og er generelt betragtes som en markør for malignitet. Den aktuelle undersøgelse udforskede den kombinerede effekt af

CA9

gen polymorfier og eksponering for miljømæssige kræftfremkaldende stoffer på modtagelighed for at udvikle oral planocellulært karcinom (OSCC) og klinisk-patologiske karakteristika af tumorer.

Metode og hovedresultater Salg

Fire enkelt-nucleotid polymorfismer (SNP’er) i

CA9

gen fra 462 patienter med kræft i mundhulen og 519 ikke-cancer kontroller blev analyseret ved en real-time polymerasekædereaktion (PCR ). Mens de undersøgte SNPs (

CA9

rs2071676, rs3829078, rs1048638 og 376 Del) var ikke forbundet med modtagelighed for kræft i mundhulen, GAA haplotypen af ​​3

CA9

SNP’er (rs2071676, rs3829078, og rs1048638) var relateret til en højere risiko for kræft i mundhulen. Desuden fire

CA9

SNPs kombineret med betelnødder quid tygge og /eller tobaksforbrug kunne håndfast løfte modtagelighed for kræft i mundhulen. Endelig patienter med oral cancer, som havde mindst én G allel af

CA9

rs2071676 var i højere risiko for at udvikle lymfe-knude metastaser (p

=

0,022) sammenlignet med de patienter homozygote for AA.

konklusioner

Vores resultater tyder på, at haplotypen af ​​rs2071676, rs3829078, og rs1048638 kombineret har potentiale prædiktiv betydning i oral carcinogenese. Gene-miljø interaktioner af

CA9

polymorfier, rygning, og betel-quid tygge kan ændre oral cancer modtagelighed og metastase

Henvisning:. Chien MH, Yang JS, Chu YH, Lin CH, Wei LH, Yang SF, et al. (2012) Virkninger af CA9 Gene polymorfier og miljøfaktorer har for Oral-Cancer modtagelighed og Clinicopathologic Karakteristika i Taiwan. PLoS ONE 7 (12) e51051. doi: 10,1371 /journal.pone.0051051

Redaktør: Sevtap Savas, Memorial University of Newfoundland, Canada

Modtaget: August 27, 2012; Accepteret: 29 Okt 2012; Udgivet: December 4, 2012 |

Copyright: © 2012 Chien et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Taipei Medical University-Wan Fang Hospital (bevilge nr. 101swf03 til Dr. Chien og Dr. Yang). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mundtlige kræftformer kan have oprindelse i nogen væv i munden, men ca. 90% er planocellulært karcinom (SCCS). Sådanne kræftformer er kendt verden over for deres dårlig prognose og store onkologiske problemer [1]. Følsomheden af ​​en person til kræft i mundhulen er medieret af genetiske faktorer og kræftfremkaldende-eksponering adfærd [2], [3]. Blandt genetiske faktorer, single-polymorfier (SNP) er den mest almindelige type af DNA-sekvensen variation, som har indflydelse på forekomsten og progression af gen-relaterede sygdomme. En SNP er en variation i DNA-sekvensen, der opstår, når en nukleotid (A, T, C eller G) ændres i mindst 1% af en bestemt befolkningsgruppe. Når en SNP falder i en kodende sekvens, kan det bestemme en ændring af en aminosyre i det beslægtede protein sekvens. En sådan SNP kaldes ikke-synonyme. I overensstemmelse med degenereringen reglerne i den genetiske kode, kan en SNP også generere den samme aminosyre, som derefter kaldes en synonym SNP. Notatet flere grupper viste, at en SNP i en ikke-kodende region (3′-utranslateret region; UTR) af et gen også kan påvirke biologiske processer [4]

Kræft er et gen-defekt sygdom, og SNP’er. muligvis forudsige risikoen for kræft i mundhulen [5]. Derfor er strategier for genotypebestemmelse relaterede SNP’er og analysere deres distributions- frekvenser i et samfund ofte bruges til at forudsige risikoen og prognose af kræft. Betel-quid tygge, tobak, og alkoholforbrug er 3 fælles kræftfremkaldende-eksponering adfærd. Kombinationer af disse miljømæssige carcinogener og visse gen polymorfier kan øge en persons modtagelighed for cancer oral [5]. Således kan SNP’er i visse gener påvirke ens respons på stimulering mod carcinogenese fremmes af miljøfaktorer.

Hypoxi er et fælles træk ved humane faste tumorer [6]. Tumor hypoxi forårsager tumorceller til at undergå adaptive ændringer, der sætter dem i stand til at overleve og formere sig [7]. Hypoksiske tumorer er forbundet med aggressiv tumorvækst, metastase, og behandlingssvigt i flere typer af solide humane tumorer [8]. Udviklingen af ​​en markør for hypoxiske tumorer kunne muliggøre vurdering af den biologiske aggressivitet af individuelle tumorer, som kunne på sin side letter individuelt tilpassede behandlinger.

Karboanhydrase 9 (CA9), et glycoprotein, der tilhører en familie af zinkholdige enzymer, ikke udtrykkes i de fleste organer eller væv, men det er rigeligt udtrykt i talrige cancere og er blevet undersøgt som en endogen markør for tumor hypoxi [9], [10].

CA9

er placeret på kromosom 9p12-13, som består af 11 exons og koder for 459-aminosyre protein, CA9. CA9 er en membran-associeret protein, der katalyserer den reversible reaktion H

2O + CO

2↔H

++ HCO

3

-, som er afgørende for en bred vifte af processer, herunder pH-regulering [11]. Gennem denne aktivitet, CA9 bidrager til at opretholde en normal pH i tumorceller i et hypoksisk mikromiljø, som kan tillade tumorcelleproliferation [12]. Tidligere undersøgelser viste, at CA9 ekspression repræsenterer biologiske tumor aggressivitet og er forbundet med dårlige kliniske resultater i flere tumorer, herunder hoved og hals, cervix, nyre og lungecancere [13] – [16]. For nylig blev afvigende ekspression af CA9 i OSCC også vist at være korreleret med nodal metastase og dårlig prognose [17] – [19]. Disse forskellige resultater antyder, at CA9 spiller en vigtig rolle i OSCC progression.

Tidligere forskning rapporterede, at polymorfe variationer i exon region

CA9

var forbundet med den samlede overlevelse for metastatisk renalcellecarcinom [11 ]. Bortset fra denne undersøgelse, ingen rapporter med fokus på sammenhængen mellem

CA9

polymorfier og udvikling af solide tumorer. Den aktuelle undersøgelse undersøgte relationer mellem SNP’er (rs2071676, rs3829078, og 376del393) i exon og 3′-UTR (rs1048638) regioner i

CA9

gen og risikoen for oral cancer (figur 1). De påvirkninger af disse SNPs kombineret med betel-møtrik og tobaksforbrug, der fører til en modtagelighed for oral cancer, blev evalueret. Vi undersøgte også forholdet mellem genetiske påvirkninger og de klinisk-patologiske karakteristika oral cancer. Til vores viden, er dette den første undersøgelse for at demonstrere en signifikant sammenhæng mellem

CA9

polymorfier og oral carcinogenese i Taiwan.

Tal i diamanter repræsenterer parvis

D ‘

værdier. Dette plot blev genereret af Haploview programmet.

Resultater

Den statistiske analyse af demografiske karakteristika er vist i tabel 1. Vi fandt signifikant forskellige fordelinger af alder (

p

= 0,023), køn (

s

0,001), betel-quid tygge (

s

0,001), alkoholforbrug (

s

0,001 ), og tobak (

s

0,001) mellem kontrol- deltagere og OSCC patienter. For at mindske mulig interferens af miljøfaktorer, blev AORs med 95% CIs anslået af flere logistiske regressionsmodeller efter kontrol for andre kovariater i hver sammenligning.

Alle analyserede genmarkører i vores kontrolgruppe var statistisk verificeret som værende i HWE (

s

0,05). Data i tabel 2 viser, at for både OSCC patienter og kontroller, alleler med den højeste udbredelse frekvens var som følger: heterozygot A /G for 201 (rs2071676) locus og homozygot for A /A, C /C, og Ins /Ins henholdsvis for 1081 (rs3829078), 1584 (rs1048638), og 376 (376del393) loci af

CA9

gen. Efter justering for variabler, der var ingen signifikant forskel i at have oral cancer hos personer med rs2071676, rs3829078, rs1048638, og 376del393 polymorfier af

CA9

gen i forhold til vildtype (WT) individer.

Interaktion effekter mellem miljømæssige risikofaktorer og genetiske polymorfier af

CA9

er vist i tabel 3 og 4. Blandt 598 rygere, personer med mindst 1 G allel af rs2071676, 1 G allel af rs3829078 , 1 A allel af rs1048638, eller en Del allel af

CA9

376 og betel-møtrik-tygge vane havde respektive risici ved 23.90- (95% CI: 8.84-64.61), 14.25- (95% CI: 5,18-39,17), 16.80- (95% CI: 5,82-48,46), og 12,85 gange (95% CI: 6,19-26,68) for at have kræft i mundhulen. Personer med enten mindst 1 G allel af rs2071676, 1 G allel af rs3829078, 1 A allel af rs1048638, eller en Del allel af

CA9

376 eller som tygges betelnød havde respektive risici for 4.36- (95 % CI: 1,67-11,42), 15.18- (95% CI: 8,92-25,83), 10.65- (95% CI: 6,39-17,77), og 11,30 gange (95% CI: 6,50-19,64) for at have oral cancer sammenlignet til personer med WT homozygote, der ikke tygge betelnød (tabel 3).

Blandt 444 betel-møtrik forbrugerne i vores kohorte, rygning signifikant forhøjede den mundtlige kræftrisiko i deltagere polymorfe for rs2071676, rs1048638, og 376del393 polymorfier af

CA9

, sammenlignet med personer med WT-genet, der ikke ryger cigaretter (tabel 4). Desuden må folk, som enten var polymorfe for

CA9

i 4 loci (201, 1081, 1584, og 376), eller der røg var på en 4.13~22.71 gange risiko (

p

0,001) for at udvikle kræft i mundhulen, i forhold til mennesker med WT-genet, som ikke røg (tabel 4). Ovenstående resultater tyder på, at

CA9

gen polymorfier udøve en stærk indflydelse på oral-cancer modtagelighed, der tygger betel nødder og /eller røg cigaretter.

Vi nærmere haplotyperne at evaluere kombinerede effekter af de 3 polymorfier på oral-kræft modtagelighed. Distributions- frekvenser af

CA9

rs2071676, rs3829078 og rs1048638 haplotyper i vores rekrutterede personer blev analyseret. Den mest almindelige haplotype i kontrollen var AAC (46,6%), og det blev derfor valgt som reference. Sammenlignet med referencen, en

CA9

haplotype, GAA, signifikant (

s

0,001) øgede risikoen for OSCC ved 5,27 gange (95% CI: 1,13-24,55) (tabel 5).

for at udforske virkningerne af polymorfe genotyper af

CA9

på den kliniske status OSCC, vi klassificeret OSCC patienter i 2 undergrupper. I den første undergruppe havde patienterne homozygote WT alleler; i den anden undergruppe, de havde mindst en polymorf allel. For de genotypiske frekvenser af SNPs, kun

CA9

rs2071676 viste en signifikant sammenhæng med klinisk patologiske variabler i OSCC patienter. Sammenlignet med WT genotypen (A /A), patienter med mindst 1 polymorfe G allel af rs2071676 viste en højere risiko (1,69-fold; 95% CI: 1,00-2,84). For lymfeknudemetastaser (tabel 6)

Discussion

Sammenlignet med kontrolgruppen, en højere andel af patienter oral-cancer anvendes betel quid, tobak eller alkohol (tabel 1). Dette fund tyder på, at disse 3 miljømæssige carcinogener kan være forbundet med risici for oral cancer. Betel-quid og tobaksforbrug syntes at være særligt stærkt forbundet med oral cancer, en konstatering, der er kongruent med tidligere forskning [20]. Betel-quid tygning blev fundet at stimulere proteinniveauet af matrixmetalloproteinase (MMP) -9 i spyt hos raske mennesker [21]. Kalk-piper betel quid kan også øge proteinniveauer af c-fos og c-jun proto-onkogener [22]. Forbrug af tobak kan væsentligt inducere ekspressionen af ​​nukleare hypoxi-inducerbare faktor (HIF) -1α, der er en ugunstig prognostisk faktor i kræft i mundhulen [23]. Disse linjer af beviser tyder på, at eksponering af miljøet kræftfremkaldende stof er involveret i dannelsen eller patogenesen af ​​kræft i mundhulen.

CA9 udtryk er meget følsomme over for hypoxiske betingelser [24]. Den afvigende ekspression af CA9 blev observeret i cancerceller selv eller tumorassocierede stromale væv i OSCC patienter og korreleret med en dårlig prognose og nodal metastase [17], [18], [25]. CA9 katalyserer den reversible hydratisering af carbondioxid til kulsyre. Dette fører til intracellulær alkalose og ekstracellulære acidose i tumormikromiljøet, hvilket giver tumorer at overleve under hypoxiske betingelser. Endvidere kan ekstracellulær acidose bidrage til invasionsevne og dårlig prognose af high-stromale CA9-udtrykkende tumorer ved at aktivere ekstracellulære proteaser og forstyrrer celleadhæsionsmolekyle funktion [26] – [28]. CA9 reducerer E-cadherin-medieret celleadhæsion af en konkurrencedygtig interaktion med beta-catenin [28]; dette kan forstærke den metastatiske fænotype og bidrage til sammenhæng mellem høj stromale CA9 udtryk og lymfe-node metastaser. Således kan CA9 udtryk ved tumorer indikere tilstedeværelsen af ​​hypoxiske celler med mere-aggressiv adfærd og behandling modstand på grund af hypoxi-induceret cellulære ændringer [29], [30].

Stigende evidens for, at genomiske forandringer gradvist ændre den cellulære fænotype og kan føre celler til at udvikle sig fra en præ-neoplastisk stadie til kræft lettere [31]. Det blev rapporteret, at den orale slimhinde af personer med den

murine dobbelt minutter 2 (MDM2)

SNP 309 GG genotype er mere modtagelige for miljømæssig kræftfremkaldende eksponering og resulterer i en hurtigere indsættende tumordannelse [32]. Jo længere allel polymorfi af GT dinukleotid i

hæm oxygenase (HO) -1

promotor og funktionel polymorfi i

nuklear faktor kappa B1 (NFKB1)

promotor er begge relateret til risikoen for betel-quid- eller rygning relateret OSCC [5], [33]. Polymorfier af adskillige gener blev identificeret som værende forbundet med risiko for oral cancer [34], [35]. Det er klart, at genetiske komponenter spiller afgørende roller i carcinogenese. I vores undersøgelse,

CA9

gen SNPs (rs2071676, rs3829078, rs1048638, og 376del393) alene ikke bidrog til oral-cancer modtagelighed (tabel 2). Den synergistiske virkning af miljømæssig faktor (betelnødder quid og rygning) og

CA9

gen polymorfier på risikoen for oral cancer (tabel 3 og 4) er godt dokumenteret. Betel-quid og tobak kræftfremkaldende stoffer kan øge HIF-1α udtryk, og derefter ændre

CA9

promotor-aktivitet og opregulere CA9 udtryk. Derfor kan det opregulere ekstracellulære proteaser eller nedregulere E-cadherin at fremme udviklingen af ​​kræft i mundhulen.

Det blev rapporteret, at høj ekspression af CA9 var hyppigere med lymfe-knude metastaser i flere typer af solide tumorer, herunder kræft i mundhulen [25], [36], [37]. I nærværende undersøgelse blev en signifikant højere fordeling frekvens af lymfe-knude metastaser udstillet i OSCC patienter med mindst 1 polymorfe G allel af

CA9

201 sammenlignet med dem med WT genotypen (tabel 6). De 201 A /G polymorfi er kendt for at forårsage en ikke-synonyme substitution (valin til methionin), men udtryk og funktion CA9 som påvirkes af denne SNP er stadig ubekræftet. Selv om en undersøgelse af de Martino et al. viste, at dette ikke-synonyme SNP havde ingen signifikant effekt på CA9 protein udtryk [11], mener vi, at stikprøvestørrelsen i de Martino undersøgelse (

n

= 54) var for lille til at afgøre, om

CA9

201 SNP havde en signifikant effekt på CA9 udtryk og skal bekræftes i større prospektive studier.

en række SNPs kan være tavs, det vil sige, uden nogen direkte effekt på genprodukter. I kraft af koblingsuligevægt (LD), der findes på tværs af humane genom, kan de stadig anvendes som genetiske markører til at lokalisere tilstødende funktionelle varianter, der bidrager til sygdom. Når hver SNP konstruere haplotyperne har en ægte bidrag til modtagelighed for sygdom, selvom unapparent, kan haplotype analyser tilvejebringe større statistisk styrke og er undertiden fordelagtigt i forhold analyse af individuelle SNP’er til detektering af en associering mellem alleler og en sygdom fænotype [38]. Vi analyserede bidrag af forskellige haplotype kombinationer af 3

CA9

SNP’er (rs2071676, rs3829078, og rs1048638) til risikoen for oral cancer og til sidst fandt, at

GAA

haplotype viste en høj risiko for OSCC (tabel 5). Det er muligt, at

GAA

haplotype af

CA9

er i LD med andre funktionelle polymorfier, der er ansvarlige for modtagelighed for OSCC.

Fortolkninger af denne undersøgelse er begrænset, fordi oplysninger om visse oral-cancer risikofaktorer, såsom marihuana (hash) rygning, medicinsk nikotin brug, arvelighed, og familiære risici, var ikke tilgængelige for de rekrutterede prøver, og denne begrænsning kan begrænse justeringen af ​​disse muligvis forstyrrende faktorer. I denne undersøgelse, men de vigtigste risikofaktorer for kræft i mundhulen, af alkohol og tobak forbrug og betel-quid tygge, blev justeret efter for at vurdere virkningerne af gen-polymorfier på klinisk-patologisk udvikling af OSCC. Nogle indirekte reguleringer, såsom alder, køn og geografisk område, blev også brugt til at vurdere virkningerne af gen-polymorfier på kræft i mundhulen mellem raske kontrolpersoner og OSCC patienter til at reducere muligheden for falsk-positive resultater. I en kommende undersøgelse, øge prøven (blod og tumorvæv) nummer og tager flere OSCC risikofaktorer i betragtning i analysen kan præcist validere disse resultater.

Som konklusion, vores resultater tyder på, at gen-miljø interaktioner mellem

CA9

polymorfier og betel-quid tygge med rygning kan ændre modtagelighed for udvikling oral-cancer.

GAA

haplotype af 3

CA-9

SNPs (rs2071676, rs3829078, og rs1048638) kombineret viste også en høj risiko forening med OSCC. Oral-cancer patienter med

CA9

201 A /G polymorfi har en højere risiko for at få halsen lymfe-knude metastaser end gøre WT luftfartsselskaber.

Materialer og metoder

emner og Prøvetagning

Vi rekrutterede 462 patienter (444 mænd og 18 kvinder, med en gennemsnitsalder på 54,4 ± 11,4 år) på Chung Shan Medical University Hospital i Taichung, og Changhua Christian Hospital og Show Chwan Memorial Hospital i Changhua, Taiwan. Patienterne blev indskrevet som en sag gruppe i 2007-2010. Blandt de 462 sager blev tumorer placeret i mundslimhinden (n = 189), tunge (n = 148), gingiva (n = 48), gane (n = 30), gulvet i munden (n = 21), og andre (n = 26). I mellemtiden blev kontroller indskrevet fra fysisk undersøgelse i løbet af disse tre hospitaler, som også de faciliteter, sager blev indsamlet fra. I slutningen af ​​ansættelsen, blev i alt 519 deltagere (425 mænd og 94 kvinder, med en gennemsnitsalder på 52,4 ± 14,7 år), der hverken havde selvrapporterede historie for kræft i nogen steder inkluderet. Desuden blev individer med oral præcancerøse sygdom såsom oral submukøs fibrose, leukoplakia, erythroplakia, verrucous hyperplasi osv udelukket fra kontrolgruppen. Før påbegyndelse af denne undersøgelse blev godkendelse opnået fra Institutional Review Board of Show Chwan Memorial Hospital, og informeret skriftligt samtykke til at deltage i undersøgelsen blev opnået fra hver person.

For begge tilfælde og kontroller, vi brugte en spørgeskema for at indhente oplysninger om patienten udsættes for betel-quid tygge, tobak, og alkoholforbrug. Medicinsk information om de sager, blev opnået fra deres journaler, og omfattede TNM klinisk iscenesættelse, primær tumor størrelse, lymfeknude involvering, og histologisk klasse. Oral-cancer patienter klinisk iscenesat på tidspunktet for diagnosen i henhold til TNM af amerikanske Blandede Cancer (AJCC) Iscenesættelse Manual (7th ed.) [39]. Tumorer er klassificeret som fase I og fase II (n = 213) og fase III + stadie IV (n = 249). Metastase i lymfeknuder blev påvist i 164 tilfælde (35,5%). Whole-blodprøver indsamlet fra kontrol og OSCC patienter blev placeret i rør indeholdende ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), straks centrifugeres, og opbevares ved -80 ° C.

Udvælgelse af CA9 Polymorphisms

I dbSNP database, har over 30 SNPs blevet påvist i 11 exoner område af

CA9

gen, herunder tre SNP’er placeret i de kodende sekvenser af genet (exon 1, 7 og 11). For at opnå tilstrækkelig magt til vurdering af potentialet forening, vi undersøgte rs2071676 (G201A i exon 1), rs3829078 (A1018G i exon 7) og rs1048638 (C1584A i 3’UTR), dem med mindre allelfrekvenserne ≥ 5%. Endvidere anden SNP af

CA9

gen (en 18-bp deletion /insertion, +376 Del). Blev valgt i denne undersøgelse, da denne SNP blev fundet i cancerpatienter [11]

genomisk DNA Extraction

genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af QIAamp DNA blod mini kits (Qiagen, Valencia, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Vi opløste DNA i TE-buffer (10 mM Tris og 1 mM EDTA; pH 7,8) og derefter kvantificeres det ved måling af OD260. Det endelige præparat blev opbevaret ved -20 ° C og blev anvendt til at fungere som skabeloner for polymerasekædereaktionen (PCR).

Real-time PCR

Allel diskrimination af

CA9

201 (rs2071676), 1081 (rs3829078) og +1584 (rs1048638) allele polymorfier blev vurderet med en ABI StepOne ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), og analyseret med SDS vers. 3.0 software (Applied Biosystems) under anvendelse af TaqMan assay. Desuden blev de 376del393 allele polymorfier vurderet med PCR. Produkterne blev adskilt på en 3% agarosegel og derefter farvet med ethidiumbromid. Primersekvenserne og prober til analyse af de

CA9

gen polymorfier er beskrevet i tabel 7. Det endelige volumen for hver reaktion var 5 pi, indeholdende 2,5 pi TaqMan Genotypebestemmelse Master Mix, 0,125 pi TaqMan probe mix, og 10 ng genomisk DNA. I vores indledende undersøgelse, har en sådan reaktionsblanding (5 pi) vist sig at give identiske resultater til det i med et endeligt volumen på 20 pi anbefalet i producentens anvisninger. Real-time PCR omfattede en indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 15 s og derefter ved 60 ° C i 1 min. For at validere resultater fra real time PCR og PCR, blev omkring 10% af analyser gentagne og flere tilfælde af hver genotype blev bekræftet ved DNA-sekvensanalyse.

Statistisk analyse

Forskelle mellem de 2 grupper blev anset for signifikante, hvis

s

værdier var 0,05. Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) blev vurderet ved hjælp af en goodness-of-fit

Χ

2

-test for biallelmarkører. Mann-Whitney

U

-test og Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligning forskelle i fordelinger af patientens demografiske karakteristika mellem kræft-fri (kontrol) og oral-cancer grupper. De justerede odds ratio (AORs) og 95% konfidensintervaller (CIS) af sammenhængen mellem genotypefrekvenser og risiko samt klinisk-patologiske karakteristika blev estimeret ved hjælp af flere logistiske regressionsmodeller, efter kontrol for andre kovariater. Vi analyserede alle data med statistiske Analytic System (SAS Institute, Cary, NC, USA) software (vers. 9.1, 2005) til Windows.