PLoS ONE: lavmolekylære procyanidiner fra vindruekerner øge virkningen af ​​5-fluoruracil Kemoterapi på Caco-2 Menneskelig Colon Cancer Cells

Abstrakt

Målsætning

Grape seed procyanidiner (PC) er flavan-3-ol oligomerer og polymerer er kendt for deres biologiske aktivitet i tarmen. Druekerneekstrakt (GSE) er blevet rapporteret at reducere intestinal skade i en rottemodel af mucositis. Vi søgte at undersøge virkningerne af oprensede PC fraktioner med forskellig gennemsnitlig polymerisationsgrad (MDP) kombineret med 5-fluorouracil (5-FU) kemoterapi på levedygtigheden af ​​colon cancerceller (Caco-2).

Design

SixPC fraktioner (F1-F6) blev isoleret fra Cabernet Sauvignon frø på to modenhedskriterier faser: pre-Veraison umodne (umodne) og modne (moden), udnytte tringradient, lavtryks kromatografi på en Sephadex LH-20 harpiks. Fraktioner blev testet på Caco-2-celler, alene og i kombination med 5-FU. Eluerede fraktioner blev karakteriseret ved phloroglucinolysis og gelpermeationschromatografi. Cellelevedygtighed blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) assay.

Resultater Salg

Alle isolerede fraktioner signifikant reduceret Caco-2 cellelevedygtighed sammenlignet med kontrollen (P 0,05), men F2 og F3 (MDP 2-6) var de mest aktive fraktioner (umodne F2 = 32% MDP 2.4, F3 = 35% MDP 5.8 og modne F2 = 13 % MDP 3.6 og F3 = 17% MDP 5,9; procentuelle andel af levedygtige celler tilbage) på Caco-2-celler. Når det kombineres med 5-FU, umodne fraktioner F1-F3 forbedret de celle toksiske virkninger af 5-FU med 27-73% (

P

0,05). Modne frø PC fraktioner (F1-F4) øget signifikant toksiciteten af ​​5-FU med 60-83% mod Caco-2-celler (

P

0,05). Desuden er nogle fraktioner alene var mere potent på at mindske levedygtigheden i Caco-2-celler (

P

0,05; umodne fraktioner = 65-68% og modne fraktioner = 83-87%) sammenlignet med 5-FU alene ( 37%).

konklusioner

pc’er af MDP 2-6 (umodne F1-F3 og moden F1 og F4) ikke kun forbedret effekten af ​​5-FU i drab Caco-2 celler, men også overgået standard 5-FU kemoterapi som en anti-cancer agent.The bioaktivitet PC derfor tilskrives primært lavere molekylvægt pc’er

Henvisning:. Cheah KY, Howarth GS, Bindon KA, Kennedy JA, Bastian SEP (og 2014) lavmolekylære procyanidiner fra vindruekerner øge virkningen af ​​5-fluoruracil kemoterapi på

Caco-2

Humane Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (6): e98921. doi: 10,1371 /journal.pone.0098921

Redaktør: Rajeev Samant, University of Alabama i Birmingham, USA

Modtaget: November 17, 2013; Accepteret: 7 maj 2014; Udgivet: 6 juni 2014

Copyright: © 2014 Cheah et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Professor Gordon Howarth understøttes af en South Australian Sundhed og Medicinsk Research Institute Cancer Råd Senior Research Fellowship. Den aktuelle undersøgelse blev udført under samarbejdet mellem Wine Science og Business Group, The University of Adelaide og Australian Wine Research Institute (AWRI). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft har den næsthøjeste dødelighed, og er den fjerde hyppigst diagnosticerede form for kræft i USA [1]. Den primære behandling for coloncancer involverer kirurgisk tarm resektion og kemoterapi, oftest med 5-fluoruracil (5-FU) [2]. Desværre kan kemoterapi ikke diskriminere mellem normale celler og cancerceller, og det rettet mod områder, hvor cellerne er erstattet med en høj hastighed, såsom i munden og tarmen [3]. Dette fører til udviklingen af ​​mucositis (gastrointestinal toksicitet). Aktuelle mucositis behandlinger er stort set ineffektive som de er rettet mod kun symptomerne, men ikke patogenesen af ​​tilstanden [3]. Således er det vigtigt at søge nye alternative behandlinger, som ikke kun er målrettet mucositis men også forbedre kemoterapeutisk tiltag uden at kompromittere trivsel patienter.

stigende vindruekerneolie ekstrakter (GSEs) bliver undersøgt på grund af deres rapporterede sundhedsmæssige fordele for en række lidelser, såsom cancer [4], kardiovaskulær sygdom [5], [6] og ulcerativ colitis [7], [8]. De gavnlige virkninger af GSE’er er blevet tilskrevet polyphenoliske procyanidiner (PC’ere) [9], der omfatter flavan-3-ol-underenheder. Polymeren længde PC er beskrevet af polymerisationsgraden (DP). På grund af deres polymeriseret struktur, er cellulær absorption begrænset til oligomerer med en lavere DP, forlader de større DP molekyler til adsorption i tarmlumen efter oral administration [10], [11]. En række undersøgelser har rapporteret polymerisation og galloylation af pc’er til at være ansvarlige for deres anti-proliferative virkninger på transformerede celler [9], [12], [13].

Der er stigende tyder GSEerne er effektive skal mindske spredningen af ​​cancerceller uden at være cytotoksisk for normale celler [14]. Derudover har GSE demonstreret delvis lindring af intestinal skade i en rottemodel af intestinale mucositis og har reduceret gastrointestinal celletoksicitet efter kemoterapi behandling i normale IEC-6 tarmceller [15]. Men de bioaktive komponenter i GSE fortsat ukendt. Det primære formål med den aktuelle undersøgelse var at identificere den kemiske sammensætning af de bioaktive pc fraktioner, og undersøge deres potentiale i kombination med 5-FU kemoterapi, for deres virkninger på levedygtigheden af ​​tyktarmskræft celler. Når i kombination med 5-FU, visse pc-fraktioner yderligere øget toksicitet i tyktarmen kræftceller.

Materialer og metoder

Etik udsagn

Cabernet Sauvignon drue prøver blev indhentet fra kommercielle vinmarker, Accolade Wines (Orlando) i Langhorne Creek voksende region i South Australia, som har en bredde 35 ° 16’11.56 “S og en længdegrad 139 ° 00’14.47” E, med en højde på ca. 28 m over havets overflade. Ingen tilladelser var nødvendige for den beskrevne undersøgelse, som overholdt alle relevante bestemmelser

Grape prøveudtagningen og forberedelsen

Drue prøver blev indsamlet på forskellige stadier af modenhed:. Umodne (preveraison, grønne frø) og moden (25-26 ° Brix, brune frø) i løbet af 2009 vækstsæsonen. Vindruer blev fremstillet ifølge en tidligere beskrevet metode [16], hvori druer blev opsamlet og opbevaret frosset ved -20 ° C. Mens stadig frosne, blev frøene fjernet fra kødet med en skalpel. Frø blev derefter tørres af kød med et stykke køkkenrulle og re-fryses ved -20 ° C før ekstraktion.

Forberedelse og udvinding af frø procyanidiner (pc’er)

PC udvinding påbegyndt ved at udtrække frø (100 g) natten over i 18 timer i 70% acetone (200 ml, v /v) og ascorbinsyre (1 g /l). Ekstrakten blev koncentreret under reduceret tryk ved 35 ° C (HeidolphLaborota 4011 rotationsfordamper, John Morris Scientific, Adelaide, Australien), og lyofiliseres til et tørt pulver (Dynavac FD3 frysetørrer, Dynavac Pty Ltd, Sydney, Australien). Udbytte i hvert prøver var: umodne 6,31 g og moden 10,29 g. PC frø pulver (5 g) blev opløst i 50 ml methanol (60%, v /v) indeholdende trifluoreddikesyre (TFA) (0,05%, v /v) og derefter påført (~18.3 ml /min) til en 300 mm x glaskolonne 21 mm (Michel-Miller, Vineland, NJ, USA) indeholdende Sephadex LH20 kromatografiharpiksen (Amersham, Uppsala, Sverige) til et omtrentligt lejevolumen på 93 ml, og vaskes i 250 ml methanol (60%, v /vol) indeholdende TFA (0,05%, v /v) for at fjerne lavmolekylære monomerer. PC blev derefter isoleret i 150 ml vandig acetone (70%, v /v), og ekstrakterne blev koncentreret i en rotationsinddamper ved 35 ° C til fjernelse af acetone. Den vandige opløsning blev ekstraheret med hexan for at fjerne resterende lipofilt materiale under anvendelse af en skilletragt. Det vandige ekstrakt blev frysetørret til pulver og genvundet beløb for to ekstrakter; umodne, 2,5 g og modne, 0,9 g hhv. Pulvere blev holdt under nitrogen og ved -20 ° C før fraktionering.

I fraktionering af pc’er, frø PC pulver (0,5 g) blev opløst i methanol (60%, v /v) indeholdende TFA (0,05% , vol /vol) og sat på den samme søjle under identiske betingelser. PC frø ekstrakt blev fraktioneret ifølge en trin-gradienteluering metode beskrevet tidligere [16] til fremstilling af 6 fraktioner med stigende gennemsnitlig polymerisationsgrad (MDP) og molekylvægte på pc’er betegnet som F1 til F6. De eluerede fraktioner blev koncentreret under tryk ved 35 ° C for at fjerne organiske opløsningsmidler og yderligere lyofiliseret til tørt pulver. De isolerede fraktioner blev opbevaret ved -20 ° C inden analyse. Vindruekerneekstrakt var en generøs gave fra Tarac Technologies (GraPex frø tannin, North Adelaide, South Australia) og blev inkluderet i undersøgelsen som en kontrol. GSE (1 g) blev opløst i methanol (60%, v /v) indeholdende TFA (0,05%, v /v) og fraktioneret i overensstemmelse hermed.

syrekatalyse af PC i nærvær af overskydende phloroglucinol (Phloroglucinolysis)

Phloroglucinolysis blev anvendt til bestemmelse underenhed sammensætning, MDP og galloylation af PC. Pholoroglucinolysis blev udført ifølge en tidligere beskrevet metode [16]. Seed fraktioner blev opløst i methanol (10 mg /ml, v /v) og lige store volumener (25 pi) af ekstrakt og phloroglucinol opløsning (0,2 N HCI og 100 g /L phloroglucinol og 20 g /l ascorbinsyre) for at give en endelig PC koncentration på 5 g /l. Den phloroglucinolysis reaktionen blev udført ved 50 ° C i 25 min og analyseret ved RP-HPLC under anvendelse af (-) -. Epicatechin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) som kvantitative standard

gelpermeationskromatografi ( GPC)

Gelpermeationskromatografi udførtes på grundlag af en tidligere beskrevet metode [16]. GPC teknik karakteriserer oplysninger om størrelsesfordelingen af ​​PC for hver fraktion. Fraktionerede prøver (10 mg /ml) blev opløst i methanol og yderligere fortyndet med 4 volumener HPLC mobil fase (

N, N-dimethylformamid

indeholdende iseddikesyre (1%, v /v), vand (5 %, vol /vol) og 0,15 M lithiumchlorid). Strømningshastigheden blev opretholdt ved 1 ml /min med en søjletemperatur på 60 ° C og eluering blev overvåget ved 280 nm. Den maksimale mængde PC injiceret på søjlen var 40 pg. PC frø fraktioner fra en tidligere undersøgelse [17] blev anvendt som standarder til kalibrering. Kalibreringskurver af fraktionerede pc’er med deres samlede massefordeling blev plottet og den gennemsnitlige molekylmasse af fraktionerne blev forudsagt på 50%.

Ferric reducere antioxidant effekt (FRAP) assay

Dette assay blev udført ud efter en modificeret protokol [18]. Kort fortalt blev FRAP reagens fremstillet (300 mM acetatpuffer, pH 3,6, 10 mM 2,4,6-tri [2-pyridyl] -s-triazin (TPTZ) opløsning i 40 mM HCI, 20 mM ferrochlorid; i 10: 1:01 v /v) og holdt i mørke ved 37 ° C inden analyse. Fraktioner blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) (0,1 mg /ml) og 15 pi blev tilsat til plader med 96 brønde. 15 pi af FRAP reagens blev tilsat til brøndene indeholdende fraktionerne, og pladen blev aflæst ved 593 nm efter 4 min (Multiskan Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Finland) under anvendelse Skanit software 2.2. Ferrosulfat (0,1-1 mM) blev anvendt til at konstruere en standardkurve og FRAP værdier af testforbindelser blev udtrykt som mMFe (II) /g prøve. Hver behandling blev testet tredobbelt og hele eksperimentet blev gentaget tre gange. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM af 3 uafhængige forsøg.

Cell forberedelse og eksperimentel behandling

Den humane coloncancer cellelinie, blev opnået Caco-2 fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Celler blev holdt i Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ved 37 ° C og i et CO 5%

2 incubator. Medier blev udskiftet to gange i hver uge. PC fraktioner blev opløst i DMSO og opbevaret ved -20 ° C inden analyse. Caco-2-celler blev podet ved 1000 celler /brønd i 96-brønds vævskulturplader (Grenier Bio-one, Victoria, Australien) og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 i 48 timer for at tillade binding. Efter 48 timers inkubation blev medierne erstattet med forskellige koncentrationer af frø fraktioner opløst i DMEM (ug /ml) indeholdende 0,025% (vol /vol) DMSO og 5-FU (100 uM) (DBL, Mayne Pharma Pty . Ltd, Victoria, Australien). Celler blev yderligere inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 for 24, 48 og 72 timer.

MTT assay

(3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl ) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) assay blev udført baseret på en tidligere beskrevet fremgangsmåde, med let modifikation [19]. Efter eksponering for behandlingerne (frøekstrakter og 5-FU), 50 pi MTT (1 mg /ml i Dulbeccos phosphatbufret saltvand) blev tilsat til hver brønd og inkuberes yderligere ved 37 ° C, 5% CO

2 for 4 timer. Efter 4 timer blev mediet aspireret, og 100 pi DMSO tilsat for at opløse formazan produkt. Pladerne blev anbragt på en rysteinkubator i 15 minutter og aflæst ved 570 nm med et UV-spektrofotometer. Hver behandling blev testet tredobbelt og hele eksperimentet blev gentaget tre gange. Dataene er udtrykt som middelværdi ± SEM af 3 uafhængige eksperimenter. Data blev udtrykt som antallet af levedygtige celler i forhold til procentdelen af ​​kontrolceller behandlet med serumfrit DMEM. Kontrolceller repræsenterer enten celle behandlet med serumfrit DMEM alene eller celle behandlet med 100 pM 5-FU.

Statistisk analyse

Hver cellebaseret forsøg blev udført mindst 3 gange. Statistiske analyser blev udført ved hjælp XLSTAT-version 12.0 til Windows eller PASW statistik-version 18. Statistisk analyse blev bestemt ved to-vejs ANOVA med Tukeys

post-hoc

test.

En Pearsons korrelationskoefficient blev beregnet at bestemme forholdet mellem celle levedygtighed, PC sammensætning og antioxidant værdi. Statistisk signifikans blev behandlet på

P

. 0,05

Kemikalier

Acetone, ascorbinsyre, methanol, trifluoreddikesyre (TFA), phloroglucinol, (-) – epicatechin, N, N-dimethylformamid, lithiumchlorid, natriumacetat (CH3COONa), 2,4,6-tri [2-pyridyl] -s-triazin (TPTZ) blev ferrochlorid og methanol indkøbt fra Sigma Chemical Co. Ltd, St Louis , MO. Saltsyre (HCI), iseddikesyre, Folin-Ciocalteau reagens og ferrosulfat blev indkøbt fra AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Australien. Vævskultur løsninger omfatter Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM), Dulbeccos phosphatbufrede saltvand, dimethylsulfoxid (DMSO) og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) blev købt fra Gibco BRL, Life Tehnologies Pty Ltd, Australia.Pty. Ltd

Instrumentation

En Agilent model 1100 HPLC (Agilent Technologies Australia Pty Ltd, Melbourne, Australien) blev anvendt med Chemstation software til kromatografiske analyser.

Resultater

Karakterisering af PC fraktioner

GSE blev medtaget i den aktuelle undersøgelse som en kontrol. PC sammensætning af GSE er illustreret i tabel 1. I forhold til Cabernet Sauvignon frøekstrakter, GSE havde lav masse omdannelse (23,8% vægt /vægt) og også en lavere molekylmasse, som målt ved phloroglucinolysis og GPC. De PC terminal underenheder i GSE meste domineret af (-) – epicatechin-3-

O

-gallate. På grund af den tilsyneladende lave bidrag pc’er i GSE, vi isoleret pc’er fra frisk frø Cabernet Sauvignon høstet på forskellige stadier som tidligere rapporter viste en høj masse konvertering i uforarbejdede drue frø [16].

Sammenligning renset PC fra begge frøprøver, det umodne frø havde højere masse omdannelse (87%) sammenlignet med modne frø (71%) (tabel 2). De oprensede pc’er blev yderligere fraktioneret i 6 fraktioner med stigende MDP eller molekylmasse. Massen omdannelsesudbytte til omdannelse af PC til kendte PC var 49%, bortset fra det højeste MDP F6 (ca. 37%). De store forskelle mellem umodne og modne frø fraktioner var at modne fraktioner havde en højere andel af (-) – epicatechin terminale underenheder (9-30%) i forhold til de umodne fraktioner (2-11%). Både modne og umodne frø fraktioner viste et lignende mønster af faldende (-) – epicatechin terminale underenheder med stigende MDP. Interessant, blev stigningerne i polymerisation eller molekylvægt primært styret af (-) – epicatechin-3-

O

-gallate forlængelse underenheder. Den galloylation af umodne fraktioner varierede fra 15-35% og modne fraktioner i området fra 9-24%. Umodne F2 havde den højeste galloylation (35%), primært drevet af en høj andel af (-) -. Epicatechin-3-

O

-gallate (88%)

Antioxidant kapacitet på frø fraktioner

antioxidant kapacitet af frø fraktioner blev målt ved FRAP assayet (figur 1). GSE, som indeholdt en blanding af oligomerer og polymerer af pc’er, blev inkluderet som en positiv kontrol for at bestemme den antioxiderende aktivitet af frø fraktioner. Sammenlignet med GSE (5 mM /g), alle fraktioner havde højere FRAP værdier, der spænder fra 5.4-8.8 mM /g. Antioxidant kapacitet af fraktionerne faldet i de mere polymeriserede PC fraktioner. De FRAP værdier blev negativt korreleret med MDP (r

2 = -0,81,

P

0,05).

Resultater udtrykkes som middel ± SEM for 3 uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev bestemt ved envejs ANOVA med Tukeys

post-hoc

test. Værdier med forskellige bogstaver (a, b, c) i hver kolonne er statistisk forskellige på P. 0,05

Virkninger af frø fraktioner på levedygtigheden af ​​Caco-2 celler

cytotoksiske virkninger af frø fraktioner på Caco-2-celler blev bestemt ved MTT-assayet (figur 2). Caco-2 celler blev udsat for frø fraktioner for 72 timer, og de data, udtrykt som IC

50, defineret som den dosis af hver forbindelse, der hæmmede cellelevedygtigheden til 50%, der repræsenterer middelværdien af ​​tre uafhængige forsøg. Alle fraktioner udviste en grad af giftighed som angivet ved faldet absorbansværdier. IC

50value (gennemsnit af de tre uafhængige forsøg) for umodne frø fraktioner (F1-F6) varierede fra 17.7-70.2 ug /ml (figur 2A). Antallet af levedygtige celler var positivt korreleret med MDP af umodne frø fraktioner (r

2 = 0,48,

P

0,05) dvs. fraktionerne med højeste MDP (F5 og F6) var mindre giftige til Caco-2-celler. Lignende tendenser i form af cytotoksiske virkninger blev også observeret for anvendelsen af ​​modne frø fraktioner (figur 2B), hvor antallet af levedygtige celler blev ligeledes korreleret med MDP af fraktionerne (r

2 = 0,50,

P

0,05). Modne frø fraktioner udviste stærkere cytotoksicitet sammenlignet med umodne frø fraktioner (figur 2A og 2B).

Data er udtrykt som IC

50 eller dosis (pg /mL) inhibering cellelevedygtighed til 50% (middelværdi ± SEM af) 3 uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev bestemt ved envejs ANOVA med Tukeys

post-hoc

test. Værdier med forskellige bogstaver (a, b, c) i hver kolonne var statistisk forskellige ved P. 0,05

Den kombinerede effekt af isolerede frø fraktioner og 5-FU på levedygtigheden af ​​Caco-2 celler

Den kombinerede virkning af frø fraktioner og 5-FU på Caco-2-celler blev undersøgt (figur 3). For umodne frø fraktioner blev levedygtigheden af ​​Caco-2-celler signifikant inhiberet af alle frø fraktioner (figur 3A). Sammenlignet med GSE (67%), F2 og F3 af umodne frøekstrakter var mere toksisk for Caco-2 celler (F2, 32% og F3, 35% af kontrolværdien,

P

0,05). Men når frø fraktioner var til stede med 5-FU (100 uM), de væksthæmmende effekter af 5-FU blev signifikant forøget (

P

0,05) (figur 3A). 5-FU væsentligt reduceret cellernes levedygtighed til 62% af kontrolværdier (

P

0,05). F1-F3 væsentligt forbedret vækstinhiberende aktivitet af 5-FU (27%, 73% og 56% sammenlignet med 5-FU-styring;

P

0,05). F2 kunne derfor betragtes som et mere potent kemoterapi agent end ufraktioneret kommercielt tilgængelige GSE, som kun forbedret væksthæmmende effekt af 5-FU med 55% (

P

0,05; sammenlignet med 5-FU-styring). Desuden har vi også fundet, at umodne F2 (32%) og F3 (35%) var mere potente end 5-FU (62% af kontrolværdien;

P

0,05) til at nedsætte Caco-2 levedygtighed.

data er præsenteret som procent af cellelevedygtighed i forhold til levedygtighed kontrolceller. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM af 3 uafhængige eksperimenter. Statistisk analyse blev bestemt ved to-vejs ANOVA med Tukeys

post-hoc

test. Værdier med forskellige bogstaver (a, b, c) i hver kolonne var statistisk forskellige ved P 0,05. * Angiver signifikant forskel i 5-FU-behandlede gruppe sammenlignet med 5-FU-styring.

modent frø fraktioner virker på en måde svarende til umodne frø fraktioner (figur 3B). Modne frø fraktioner betydeligt reducerede cellernes levedygtighed (

P

0,05). F2 og F3 var mere cytotoksiske til Caco-2-celler (13% og 17%,

P

0,05) end GSE (47%) (figur 3B). Når celler blev udsat for frø fraktioner og 5-FU, alle frø fraktioner forbedret kapacitet af 5-FU til at reducere cellernes levedygtighed. GSE forbedret signifikant vækstinhibering af 5-FU med 49%. Imidlertid F1-F4 væsentligt forbedret vækst inhibitoriske virkning af 5-FU (62%, 83%, 80% og 60% sammenlignet med 5-FU-styring;

P

0,05). Desuden F2 (13%), F3 (17%) og F4 (50%) fraktioner var mere potent end 5-FU alene (65% af kontrolværdien;

P

0,05) (Figur 3B ).

diskussion

vindruekerneolie pc’er er blevet rapporteret til at udøve sundhedsfremmende egenskaber, især i tarmen [14], [15], [20], [21]. Ud over dets anti-cancer virkning, har GSE blevet påvist at reducere gastrointestinal toksicitet efter kemoterapi behandling i sunde dyr og i normale intestinale celler [15]. Selv om der er voksende beviser til støtte for de kemoterapeutiske egenskaber GSE i tyktarmskræft, identifikation af bioaktive komponenter ansvarlige forbliver udefineret.

I den aktuelle undersøgelse, PC fraktioner isoleret fra kommercielt tilgængelige GSE viste forskellige tværfaglige partnerskaber og molekylære størrelser. Men disse fraktioner havde omdannelsesudbytter meget lav ( 37%), hvilket indikerer, at mindre end 40% af fraktionerne blev karakteriseret ved anvendelse af de udvalgte analyseteknikker, som var uacceptabel til denne undersøgelse. Forklaringen på det lave udbytte konvertering i PC fractionsmay have været på grund af oxidation forekommer under generering af GSE’er fra vinfremstilling processen. Det blev således besluttet at isolere pc fraktioner af friske druer, der er indsamlet ved forskellige løbetider: umodne (præ-Veraison) og modne (moden). Denne beslutning var baseret på den iagttagelse, at umodne frø har en højere konvertering udbytte end modne frø [22], underbygges af den aktuelle undersøgelse. Desuden er fremtidige forsøg med massespektrometri berettiget til yderligere at definere renheden af ​​pc’er isoleret fra vindruekerner.

De cytotoksiske virkninger af PC fraktioner på kræftceller er tidligere rapporteret [9], [12], [13 ]. Men om disse effekter forekom gennem ekstracellulær signalering eller efter optagelse af pc’er blev ikke forsøgt. Den foreliggende undersøgelse viste, at de mest aktive fraktioner påvirker levedygtigheden af ​​Caco-2-celler indeholdt mindre oligomerer: F2 og F3. De mere potente cytotoksiske virkninger observeret i Cabernet Sauvignon frø fraktioner i forhold til GSE kan have afspejlet en lavere PC udbytte i GSE (~24%) i forhold til PC isoleret fra friske druer (-60%).

Absorption af PC tværs cellemembraner var stærkt afhængig af deres tværfaglige partnerskaber [23], [24]. Kun bestemte lavere MDP pc’er optages under transit i tarmen, forlader de større MDP pc’er (MDP 7) deponeres i tarmlumen. Dette resultat understøtter de aktuelle data, hvorved F2 og F3 (MDP 2-6) og forventes at blive absorberet over cellemembranerne var mere potent end fraktioner med en højere MDP, som udøver en overflade kun effekt. Men F2 og F3 var, mere bioaktive end F1, muligvis på grund af deres højere procentdel af galloylation og andelen af ​​epicatechin-3-

O

-gallate som terminale underenheder, sammenlignet med F1. Dette resultat er i overensstemmelse med andre undersøgelser, hvor PC fraktioner med højere galloylation var mere cytotoksisk end PC fraktioner med lavere galloylation når testet på tyktarmskræft celler [9], [25]. Men det faktiske mekanisme af pc’er på cellevækst forbliver ukendt. Absorberet pc kan spille en afgørende rolle i at forstyrre celle signalveje. Pc’er er blevet rapporteret at være inhibitorer af androgen receptorer i prostatacancerceller [26], [27] og epidermal vækstfaktor receptorer på coloncancerceller [28]. Desuden er PC’er kendt at dæmpe PI3-kinase (serin /threoninproteinkinase) pathway [14], som kan føre til induktion af standsning af cellecyklus ved G1-fasen [20] og aktivering af apoptoseinducerende pathway [29]. Fremtidige studier, der undersøger endepunkterne for cellevækst og apoptose herunder PI-optagelse, caspase 3-aktivitet og sub-G1 DNA-indholdet er berettiget.

Tidligere resultater har vist, at de cytotoksiske virkninger af pc’er er afhængige af deres MDP [9] , [13]. Ikke desto mindre den nuværende undersøgelse viste, at fraktioner med højere MDP (7-16) undlod at udøve cytotoksiske virkninger på kolon kræftceller. Men den nuværende undersøgelse anvendte et andet opløsningsmiddelsystem at isolere PC fraktioner i forhold til andre undersøgelser [9], [30]. Dette opløsningsmiddelsystem isolerer PC fraktioner med en bredere vifte af molekylmasse (619-6063 g /mol) og MDP (2-9) i forhold til andre metoder (molekylmasse på 552-1232 g /mol, MDP 1-4); hvilket indebærer, at de tidligere undersøgelser kun målt begrænsede PC fraktioner ( 1200 g /mol). for deres biologiske aktiviteter

antioxidant kapacitet af pc’er er i høj grad afhængig af deres grad af polymerisering og galloylation [9]. Reduktionen af ​​metalioner, som målt ved FRAP assay menes at være positivt korreleret med antallet af hydroxylgrupper til stede i molekylerne, og at fastgørelsespunkterne til overgangsmetalioner i flavonoidmolekyler er på

o

-catechol gruppe af ring B [31]. Dette var imidlertid ikke tilfældet i den aktuelle undersøgelse. PC fraktioner med højere MDP var svagere antioxidanter, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [32], [33]. Fraktioner med større underenheder tendens til selv-aggregat og forårsage stereokemiske hindring [33], [34], og derved udsætter færre hydroxylgrupper for radikaler aktiviteter. bør udføres Fremtidige undersøgelser af antioxidant egenskaber vindruekerneolie pc’er, herunder indvirkningen på cellulære antioxidant status.

Den aktuelle undersøgelse blev udført baseret på grundlag af et tidligere studie af GSE og kemoterapi på levedygtigheden af ​​tyktarmen cancerceller [35]. Doserne af vindruekerneolie fraktioner i den aktuelle undersøgelse blev udvalgt baseret på grundlag af denne tidligere undersøgelse. 5-FU er et anti-metabolit lægemidler, som blokerer DNA-syntese via hæmning af thymidylatsyntase [3] .Når frø ekstrakt fraktioner blev kombineret med 5-FU, de ikke kun forbedret virkningen af ​​5-FU i drab Caco-2-celler, men også overgået 5-FU som et anti-cancer middel. I den aktuelle undersøgelse blev virkningerne af PC fraktioner og 5-FU på Caco-2 cellelevedygtighed undersøgt over 24-72 timer. 5-FU (100 uM) reducerede signifikant cancer celler levedygtighed til 60-80%, gastrointestinal toksicitet hos cancerpatienter. Eksponering af PC fraktion og 5-FU til celler i 24-48 timer faktisk viste en tendens til en synergistisk virkning, men var ikke signifikant (data ikke vist). Endvidere større tid eksponering (72 timer) til PC fraktioner og 5-FU medførte største reduktion af cellelevedygtighed. Den aktuelle undersøgelse viste også, at modne frø fraktioner var overlegen i forhold til umodne frø fraktioner som kemoterapeutiske midler mod tyktarmskræft

in vitro

. Den kemiske profil af de modne frø fraktioner viste, at disse virkninger kunne være drevet af deres højere andel af (-) – epicatechin som terminale underenheder i forhold til det umodne frø ekstrakt. En anden mulig forklaring kunne have været fordelingen inden for hver del af en højere andel af materiale med lav molekylvægt i de modne frø end umodne frø.

Den nuværende undersøgelse viste, at de mest aktive fraktioner grad truer levedygtigheden af ​​Caco-2 var F2 og F3. Men om disse effekter forekom gennem ekstracellulær signalering eller efter optagelse af pc’er er ikke kendt. Yderligere undersøgelser er berettiget til at bestemme den intestinale absorption af pc-fraktioner i normale tarm cellelinjer. TheMTT assay er et indirekte mål for cellelevedygtighed baseret på metabolisk aktivitet. Reduktionen af ​​cellelevedygtighed observeret i den aktuelle undersøgelse kunne tilskrives en virkning på cellecyklussen eller celleproliferation. Derfor yderligere undersøgelser undersøger cellecyklus, celledeling og celledød aktiviteter (Annexin V /PI farvning, LDL release assay, caspase-3 og Bcl-2 kvantificering) kunne dokumentere virkningen af ​​bestemte størrelser af pc’er oncell signalering. Test PC fraktioner i andre kolon cellelinier (normale og neoplastiske) kan udelukke generel toksicitet og giver yderligere beviser på PC potentiale.

Som konklusion, er yderligere undersøgelser berettiget til at bestemme den molekylære mekanisme af F2 og F3 på cellulære veje forbundet med colon neoplasi. Modne frø PC ekstrakter har ikke kun potentielle anvendelser i menneskers sundhed, men alsoin gengæld value-add til vinproducerende industrien, da de modne drue frø er den største biprodukter fra vinfremstilling. Vores data giver overbevisende dokumentation for, at der kombinerer pc fraktioner og 5-FU kan være en potentiel kemoforebyggende agent i tyktarmskræft behandlingsregimer; dog yderligere bekræftende

in vitro

undersøgelser er påkrævet med forskellige klasser af kemoterapi narkotika, efterfulgt af

in vivo

kræft model forsøg på bedre at definere potentielle rolle drue frø pc’er mod tyktarmskræft.