PLoS ONE: Modulation af ErbB2 Blokade i ErbB2-Positiv Kræft: rolle ErbB2 mutationer og PHLDA1

Abstrakt

Vi satte os for at studere de vigtigste effektorer for modstand og følsomhed over for ErbB2 tyrosinkinasehæmmere, såsom lapatinib i ErbB2-positive bryst og lungekræft. En cellebaserede

in vitro

mutagenese lapatinib modstand model identificeret adskillige mutationer, herunder gatekeeper ErbB2 mutationen ErbB2-T798I, som medierende modstand. ErbB2-T798I manipuleret celle modeller faktisk vise modstand mod lapatinib men forbliver følsomme over for irreversible EGFR /ErbB2-inhibitor, PD168393, tyder på potentielle alternativ behandlingsstrategier til at overvinde modstand. Genekspression profilering undersøgelser identificeret en udvalgt gruppe af downstream mål reguleret af ErbB2 signalering og definere PHLDA1 som en umiddelbart nedreguleret gen på onkogen ErbB2 signalering hæmning. Vi finder betydelig nedregulering af PHLDA1 i primær brystcancer og PHLDA1 er statistisk signifikant mindre udtrykt i ErbB2 negativ sammenlignet med ErbB2 positive tumorer i overensstemmelse med dens regulering af ErbB2. Endelig PHLDA1 overekspression blokke AKT signalering, hæmmer cellevækst og forbedrer lapatinib følsomhed yderligere støtte en vigtig negativ vækst regulator funktion. Vores resultater tyder på, at PHLDA1 kan have vigtige hæmmende funktioner i ErbB2 drevet lunge og brystkræftceller og en bedre forståelse af sine funktioner kan pege på nye terapeutiske muligheder. Sammenfattende vores studier definerer nye måder at modulere følsomhed og modstandsdygtighed over for ErbB2 inhibering i ErbB2-afhængige kræftformer

Henvisning:. Li G, Wang X, Hibshoosh H, Jin C, Halmos B (2014) Modulation af ErbB2 blokade i ErbB2-Positiv kræft: rolle ErbB2 mutationer og PHLDA1. PLoS ONE 9 (9): e106349. doi: 10,1371 /journal.pone.0106349

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: September 17, 2013; Accepteret: August 6, 2014; Udgivet: 19 September, 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af American Cancer Society (give Ingen RSG-08-303-01-TBE til BH) og NIH /National Cancer Institute Specialized Program for Forskning Excellence i human Lung Cancer tilskud P50 CA90578-04 (BH). Histopatologi bistand blev leveret af Molekylær Patologi Shared Resource, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ErbB2 er en cellemembran overfladebundet receptortyrosinkinase og er involveret i signaltransduktionsveje, der fører til cellevækst og proliferation. Dette gen er amplificeret i 10-20% af brystcancere, og amplificeringen resulterer i protein-overekspression, hvilket betegner en aggressiv fænotype [1] – [4]. Overekspression, amplifikation og lejlighedsvis aktiverende mutationer af ErbB2 forekommer også i andre cancere, herunder ikke-småcellet lungecancer [5], [6]. Det humaniserede antistof trastuzumab (Herceptin) mod overudtrykte ErbB2 er vist sig at være effektivt i behandling bryst- og gastriske cancere med ErbB2 amplifikation [7]. Desuden blev somatiske mutationer i kinasedomænet af ErbB2 opdaget i forskellige faste cancerformer, herunder lunge- og brystcarcinomer [8] – [12]. For nylig er dobbelt EGFR /ErbB2 tyrosinkinaseinhibitorer også vist sig lovende i kliniske undersøgelser. En dobbelt, reversibel EGFR /ErbB2-inhibitor, lapatinib (Tykerb) især har vist betydelig aktivitet i ErbB2-positive brystkræft, og nu er godkendt til brug i denne indikation [13]. https://en.wikipedia.org/wiki/HER2/neu – cite_note-3Inhibition i ErbB2 tyrosin-autophosphorylering af lapatinib ophæver nedstrøms Ras-Raf-ERK1 /2 og PI3K-AKT vækst /overlevelse signalering i ErbB2 overekspression brystcancercellelinjer og hos patienter med ErbB2-overekspression brystkræft [14].

Den ensartede udvikling af erhvervet resistens over for lapatinib desværre begrænser dets kliniske effekt. I analoge indstillinger, sekundære mutationer, såsom KIT exon 17 mutationer i imatinib-resistente GIST og EGFR T790M i EGFR-muteret lungekræft er fælles resistensmekanismer [8], [15]. Der er ingen in vivo nuværende data om potentielle resistensmekanismer til lapatinib. I et in vitro modelsystem, det sekundære mutation, ErbB2 T798I bibringer den stærkeste lapatinib resistens effekt i Ba /F3-celler og er analog med den epidermale vækstfaktor receptor T790M [16] – [18]. En nylig undersøgelse viser, at udviklingen af ​​co-afhængighed ER-signalveje i in vitro modelsystemer kan være en anden potentiel mekanisme til lapatinib modstand [19]. Der er også data, der tyder inddragelse af AXL aktivering i lapatinib-resistens i ErbB2 positiv brystkræft [20]. Det er klart, findes andre mekanismer også. Da det er vanskeligt at opnå primær patientprøver, er det vigtigt at konstruere eksperimentelle cellulære systemer til screening for relevante resistensmekanisme, der derefter tillade afprøvning af alternative inhibitorer at overvinde modstand. Det er skarpskåret at AKT /PI3K og ERK /MAPK pathways er centrale umiddelbare nedstrømseffektorer af ErbB2 onkogen signalering. Men deres målretning har alvorlige mangler med hensyn til toksicitet og et snævert terapeutisk indeks givet deres vigtige fysiologiske roller. Derfor bør en bedre forståelse af hele systemet af downstream ændringer tillade identifikation af nye handlingsrettede mål og udvikling af mere effektive og holdbare strategier til behandling af ErbB2-positive kræftformer.

I vores undersøgelse, vi har sat ud til den dobbelte mål at fremme vores forståelse i begge disse centrale områder af onkogen ErbB2 signaling- erhvervede resistens og nedstrøms effektor og modulator veje. Først vi etableret følsomhed over for lapatinib behandling af ErbB2-positive lunge- og brystkræft cellelinier, identificerede en række formodede erhvervede resistente mutationer og viste, at mutationer af ErbB2-T798 fører til modstand, som kan overvindes ved den irreversible ErbB2 inhibitor, PD168393. Dernæst afsluttede vi en genekspression profilering undersøgelse identificerer en vigtig gruppe af tidlig ErbB2 målgener og identificere PHLDA1 som en ny nedstrøms mål for ErbB2 signalering med en funktionel rolle i negative feedback-mekanismer til at finjustere outputtet af ErbB2 signalering og dermed en væsentlig styrkelse følsomheden af ​​ErbB2-positive brystkræft celler til lapatinib. Vores undersøgelser giver en række nye muligheder for at udvide fordelene ved ErbB2 hæmning i forvaltningen af ​​ErbB2-afhængige kræftformer.

Materialer og metoder

Patient Materiale

brystkræft væv og den normalt brystvæv omgiver tumoren blev opnået fra samme patient. De formalin-fikserede væv blev anvendt til immunhistokemi undersøgelse. Projektet blev godkendt af den etiske komité i New York Presbyterian Hospital i Columbia University, og patienterne gav skriftligt samtykke i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen.

Reagenser

EGF blev købt fra Sigma- Aldrich (St. Louis, MO), PD168393 og CL387,785 blev indkøbt fra Calbiochem (Billerica, MA), blev lapatinib indkøbt fra Selleck Chemicals (Houston, TX). Lægemidler blev opløst i DMSO til opnåelse af en 10 mmol /l stamopløsning og den endelige DMSO-koncentration i alle eksperimenter var. 0,1%

Cell Culture

Calu3, HCC827, H1975, HCC202, HCC1569, HCC1937 og T47D-celler blev opretholdt i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS, blev SKBR3 celler holdt i McCoys medium tilsat 10% FBS. MDA-MB-468 og MDA-MB-436-celler blev holdt i Leibovitz L-15 medium suppleret med 10% FBS, blev MCF-7-celler opretholdt i DMEM-medium suppleret med 10% FBS. Alle celler blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 og var i den logaritmiske vækstfase ved indledningen af ​​alle forsøg. MCF-7, MDA-MB-468 og MDA-MB-436 celler leveres her med tilladelse af Dr. Matthew Maurer (Columbia University). Alle cellelinjer blev oprindeligt købt fra ATCC (Manassas, VA)

ErbB2 mutagenese, bibliotek generation, og lægemiddelresistens skærm

Plasmidkonstruktionen pcDNA3.1. (-) – ErbB2-HA var frembragt som beskrevet tidligere [8]. Vi introducerede et nyt enzym site-Agel ved position 1457 i ErbB2 cDNA. Derefter blandes vi hele transmembran- og tyrosinkinase bindende domæne af ErbB2 af Agel-AfeI fordøjelse (AfeI websted-position 3191). Brug af muterede pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA plasmid, udførte vi vilkårlig mutagenese ved anvendelse af primere spænder over 1457-3191 region i nærvær af 50 mmol /l MnC

2. Subkloning i p-GEM-T Easy vektor og sekventering af individuelle kolonier viste, at i det væsentlige alle PCR-produkter indeholdt mutationer, med 50% af de produkter, der indeholder en 1-bp forandring. Puljen af ​​amplificerede DNA-fragmenter blev spaltet med Agel og AfeI og religeret ind rygraden pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA-vektoren. Parentale SKBR3 celler blev transficeret med de mutageniserede biblioteker. Cellekloner blev selekteret med frisk medium indeholdende 500 ug /ml G418 og 1 pmol /L lapatinib efter 24 timers transfektion. En måned senere blev cellekolonier isoleret og yderligere amplificeret i tilstedeværelsen af ​​både G418 og lapatinib og derefter tyrosinkinasedomænet af ErbB2 blev resequenced. Sequence alignment og analyse blev udført med DNASTAR og Mutation SURVEYOR software (SoftGenetics, State College, PA).

Generation af ErbB2 T798I plasmidet konstruere

ErbB2 T798I ekspressionsvektoren blev genereret af site- rettet mutagenese (QuickChange mutagenese kit, Stratagene, Santa Clara, CA) i pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA plasmidkonstruktion. De anvendte primere til site-directed mutagenese var T798I, 5′-CACGGTGCAGCTGGTGATACAGCTTATGCCCTATG-3 ‘(sense) og 5′-CATAGGGCATAAGCTGTATCACCAGCTGCACCGTG-3’ (antisense). Den korrekte sekvens af den genererede konstruktion blev bekræftet ved resekventering. Vi konstrueret også en ErbB2 vildtype ekspressionskonstruktionen som kontrol for transfektionsbestemmelser. Med transient transfektion undersøgelser blev udført under anvendelse af COS-7 celler med disse rekonstruerede plasmider. Western blot-analyse blev anvendt til at bekræfte vellykket transfektion med anvendelse af et anti-hæmagglutinin-tag-antistof. G418 (500 ug /ml) blev anvendt til at vælge stabilt transficerede celler og isolerede kolonier blev opsamlet under anvendelse af kloningsringe og fortsatte med at dyrkes i nærværelse af G418. Ekspression af ErbB2 T798I mutantprotein blev bekræftet ved påvisning af ekspressionen af ​​hæmagglutinin-tag som ovenfor.

cellevækstinhiberingen Analyse

Celler blev udpladet i hver brønd i plader med 96 brønde i celle-medium indeholdende 10% FBS. 24 timer efter udpladning blev cellerne behandlet med specificerede koncentrationer af inhibitorer. Koncentrationen af ​​DMSO i mediet blev justeret til 0,1%. Efter 72 timers inkubering blev antallet af levedygtige celler målt ved anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2

H

-tetrazolium, indre salt (MTS; absorption af formazan ved 490 nm; CellTiter96, Promega, Madison, WI) ifølge producentens protokol. Hvert assay bestod af tre gentagne brønde i den samme medikamentkoncentration. IC50 blev bestemt ud fra dosis-respons-kurver.

immunblotting

For at vurdere ErbB2 signaling aktivering blev cellerne udsultet i 12 timer og derefter inkuberet med lapatinib eller PD168393 i 3 timer efterfulgt af EGF ( 100 ng /ml) eller heregulin (20 ng /ml) stimulation i 15 minutter. Hele cellelysater blev adskilt på 8% SDS-polyacrylamidgeler, overført til nitrocellulose, og proteinekspression blev påvist ved anvendelse af Western Lightning Kemiluminescens Reagent (Perkin-Elmer Life Science, Wellesley, MA). Phospho-Akt (Ser473), phospho-ERK 1/2 (T202 /Y204), total-Akt, total-ERK og GAPDH antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Antistoffer mod ErbB2 (C-18), PHLDA1 [21] – [23] og hæmagglutinin-tag (F-7) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistof rettet mod phospho-ErbB2 (Y1248) blev indkøbt fra R 24 timer efter udpladning blev mediet opfrisket til bestemte koncentrationer af inhibitorer, derefter inkuberet i yderligere 72 timer. Celler blev derefter trypsiniseret, vasket med PBS, resuspenderet i Annexin /propidiumiodidfarvning puffer (Roche Applied Science), og derefter analyseret ved flowcytometri. Data blev analyseret med FlowJo software (Tree Star, Ashland, OR). Brom-deoxyuridin (BrdU) celleproliferation blev udført ifølge producentens instruktioner (FITC BrdU Flow Kit, BD Pharmingen, San Diego, CA). Kort fortalt blev Calu3 celler behandlet med lapatinib ved forskellige koncentrationer (slutkoncentration: 0, 0,1, 1, 3, og 10 pmol /l) i 3 dage, derefter pulsmærket i 60 minutter med 10 uM BrdU, opsamlet ved trypsinisering og permeabiliseret med BD cytoperm buffer, farvet med fluorescerende anti-BrdU-antistof, modfarvet med 7-amino-actinomycin D for total DNA indhold og analyseret ved flowcytometri. Forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Oligonucleotid array analyse

Calu3 og SKBR3 celler blev dyrket til 60% konfluens i dyrkningsmedium og derefter blev behandlet med lapatinib (1 um), eller DMSO ( 0,01%) som en kontrol i 6 timer. Totalt cellulært RNA blev isoleret under anvendelse af RNAeasy mini kit (Qiagen, Germantown, MD). RNA kvalitet blev vurderet ved anvendelse Experion Automated Elektroforese Station (Bio-Rad) og kvantificeres ved fiberoptiske spektrofotometri ved anvendelse af NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Inc., Wilmington, DE, USA). cDNA blev syntetiseret, mærket og hybridiseret til Affymetrix HG-U133A mikroarrays og scannet. Udtrykket værdi for hvert gen blev beregnet ved hjælp af Affymetrix GeneChip software og Robust Multichip Gennemsnitlig (RMA) metode for signal udvinding.

Forbehandling, filtrering og Statistisk analyse

De microarray data blev analyseret og den falske opdagelse blev beregnet under anvendelse af SAM (Stanford University, CA). Array normalisering og beregning af ekspressionssystemer værdier af chippen blev udført under anvendelse af DNA-chip Analyzer (dchip). For annotation af de resulterende gener blev genet ontologi browser NetAffymetrix (https://ww.affymetrix.com), der anvendes. De differentielt udtrykte gener med ≥2 eller ≤0.5 fold ændring, q-værdi ≤1% blev analyseret ved hjælp af t-test og grupperet med softwarepakken klynge 3.0 [24].

Kvantitativ PCR Assay

Total RNA fra tredobbelte prøver blev isoleret ved hjælp RNAeasy mini kit (Qiagen). cDNA blev syntetiseret med M-MLV revers transkriptase (SuperScipt III revers transkriptase, Invitrogen, Grand Island, NY) med anvendelse af oligo (dT) primere fra Invitrogen. Alle prøver blev analyseret ved Roche LightCycler hjælp af Syber grønne prober. Primersekvenser er vist i tabel S1. Niveauer af GAPDH-ekspression blev anvendt som interne referencer til at normalisere input cDNA. Forhold mellem niveau af hvert gen til GAPDH blev derefter beregnet.

Immunhistokemi

Formalin-fikseret primær brysttumorvæv snit blev deparaffineret og rehydreret og inkuberes med 0,6% hydrogenperoxid i methanol. Target Retrieval Solution, pH 9,0 (Dako, Carpinteria, CA) blev anvendt til antigen-genvinding. Objektglassene blev inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C efterfulgt af farvning hjælp af R.T.U Vectastain Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) med hematoxylin nukleare kontrastfarvning. Endelig dias var dehydreret sekventielt i ethanol, ryddet med xylener. Den anti-PHLDA1 antistof blev anvendt i fortynding 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). Intensiteten af ​​farvningen af ​​PHLDA1 blev scoret af en bord certificeret brystkræft patolog som 0 (ingen ekspression), 1+ (svag ekspression), 2+ (moderat ekspression) og 3+ (stærk ekspression) og den procentvise (0-1,0 ) af positivt farvede tumorceller blev også vurderet til at generere en sammensat H-score (intensitet score X procent positive, rækken af ​​mulige værdier 0-3.0). Sølv in situ hybridisering (SISH) blev anvendt til bestemmelse ErbB2-status i humane brystcancerceller prøver [25]. Forholdet mellem ErbB2 /kromosom 17 blev beregnet ved at dividere den samlede score for ErbB2 med det samlede score for kromosom 17. Et forhold på 1,8 tilkendegivet, at ErbB2 gen ikke blev forstærket, mens et forhold mellem 2.2 angivne forstærkning af genet . For sager med et forhold mellem 1,8 og 2,2, blev signaler fra 20 flere tumor kerner tælles i hvert dias og et nyt forhold blev beregnet.

Plasmid konstruerer og cellulære transfektion

Fuld længde cDNA sekvens af human PHLDA1 blev amplificeret fra genomisk DNA af HCC827 celler. PHLDA1 blev derefter modificeret med en HA-tag ved C-terminalen ved overlappende PCR for at skelne plasmid afledt fra native protein og blev subklonet ind i pcDNA3.1 (-) backbone vektor. Nøjagtigheden af ​​konstruktionen blev bekræftet ved direkte DNA-sekventering. SKBR3-celler blev transient transficeret med tom pcDNA3.1 (-) (pcDNA3.1 (-) – EV) eller PHLDA1 (pcDNA3.1 (-) – PHLDA1) ekspressionsvektorer ved Fugene 6 (Roche Applied Science). Stabilt transficerede subkloner blev udvalgt med G418 ved en koncentration på 500 pg /ml startende 48 timer efter transfektion

Forankringsuafhængig vækst assay og migration assay

I forankringsuafhængig vækst assay pcDNA3.1 (. – ) -EV og pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 stabile transficerede celler blev trypsiniseret, talt to gange under anvendelse af et hæmocytometer og udpladet ved 5000 celler /ml i top propper bestående af 0,4% SeaPlaque agarose (FMC Bioproducts, Rockland, ME) i McCoys 5A medium. Efter 25 dage blev kolonierne fotograferet og talt. Eksperimentet blev gentaget tre gange med triplikater hver. Gennemsnitlige antal kolonier fra hvert eksperiment blev plottet. For migration assays, sammenflydende monolag af pcDNA3.1 (-) – EV og pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 stabile transfekterede celler blev ridset med en steril 10 pi pipettespids. Pladerne blev derefter vasket og inkuberet ved 37 ° C i 10% FBS /McCoys 5A-medium i 48 timer

Klonogen overlevelse assay

To tusinde pcDNA3.1. (-) – EV og pcDNA3 .1 (-) – PHLDA1 SKBR3-celler blev udpladet på 6 cm plader og fik lov til at komme sig i 24 timer. Celler blev derefter behandlet med 0,1 uM eller 0,5 uM lapatinib og lodes vokse i 10 dage. Derefter blev pladerne farvet med methylenblåt i 4 timer, og antallet af kolonier med mere end 50 celler i hver plade blev bestemt. Et sæt af ubehandlede plader blev inkluderet som kontroller for at bestemme udpladningseffektiviteten for individuelle cellelinier. Det faktiske antal celler /plade blev bestemt på grundlag af udpladningseffektiviteten af ​​hver cellelinie og antallet af celler udpladet pr plade. Disse tal blev derefter anvendt til at beregne den procentvise overlevelse. Også hver behandling blev udført i triplikater for at bestemme SD for hvert datapunkt.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført under anvendelse chi-squared test eller to stikprøver

t

-tests det er relevant, med

P

-værdi af 0,05 betragtet som statistisk signifikant. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Dataene er repræsentative for tre separate eksperimenter.

Resultater

Lapatinib og PD168393 fremkalde væksthæmning og apoptose i ErbB2-positive Calu3 og SKBR3 celler

Vi først gennemført MTS cellevækst assays for at undersøge, om inhibering af ErbB2 med lapatinib, en reversibel dual EGFR /ErbB2 tyrosinkinaseinhibitoren eller PD168393, som irreversibelt inhiberer ErbB2, kan føre til væksthæmning af ErbB2-positive cancerceller, såsom ErbB2-positive Calu3 lungekræft og SKBR -3 brystcancercellelinier. Vi fandt, at både lapatinib og PD168393 betydeligt hæmmede væksten af ​​Calu3 og SKBR3 celler (Fig. 1A). Yderligere undersøgelse ved hjælp af Annexin V farvning viste, at både lapatinib og PD168393 induceret fremtrædende apoptose i både Calu3 og SKBR3 celler (Fig. 1B og 1C). BrdU-inkorporering blev udført for at vise den reducerede proliferation af disse to cellelinier ved lapatinib behandling. Den lapatinib behandlede Calu3 celler viste en signifikant højere G

1 befolkning i overensstemmelse med G

1 anholdelse i forhold til kontrol-celler (fig. 1d), og dette blev yderligere bekræftet i SKBR3-celler (Figur S1). Disse resultater antyder, at lapatinib inducerer standsning af cellecyklus i G

1 fase og efterfølgende apoptose i Calu3 og SKBR3 celler. For at bestemme virkningen på nedstrøms signalveje, blev phosphoryleringsniveauerne af MAP-kinase og AKT pathways vurderet i disse to ErbB2-positive celle modeller, og robust blokade af begge signalveje blev fundet (Fig. 1E, fig S2). Dette fund blev korreleret med resultaterne af væksten inhiberingsassays gjort, hvilket tyder på, at væksten hæmning forårsaget af lapatinib og PD168393 kan reguleres gennem effektiv blokade af MAP-kinase og AKT veje.

A. Cellulær spredning af Calu3 og SKBR3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af lapatinib og PD168393 som fastsat af MTS analysen. B. Lapatinib og PD168393 inducerer cellulær apoptose i Calu3 og SKBR3- celler. Repræsentative Annexin V /propidiumiodid flowcytometri; tallene repræsenterer procentdelen af ​​celler i den passende kvadrant. C. Kvantificering af apoptose. D. Lapatinib inducerer cellecyklusstop i Calu3 celler som påvist ved BrdU og 7-ADD assay. R1-G1-fasen; R2-G2 fase; R3-S-fase; R4-G0 fase. E. Dosis respons lapatinib og PD168393 på fosforylering af ErbB2, AKT og ERK i Calu3 og SKBR3- celler som reaktion på EGF behandling. p-ErbB2: phosphoryleret ErbB2; t-ErbB2: total-ErbB2; p-AKT: phosphoryleret AKT; t-AKT: total AKT; p-ERK: phosphoryleret ERK; t-ERK:. total ERK

Karakterisering af resistens mutant ErbB2-T798I

Dernæst vi forfulgte en tilfældig mutagenese strategi for at vurdere sekundære mutationer af ErbB2, der kan føre til funktionelle modstandsdygtighed over for lapatinib. Først blev hele transmembrane og tyrosinkinasedomæne i ErbB2 (positionerne 1457-3191) tilfældigt mutageniseret. Derefter blev mutageniseret ErbB2 blandet igen i en pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA rygraden og transficeret ind SKBR-3-celler. Vi genererede lægemiddelresistente SKBR-3 cellekloner i nærværelse af både 500 ug /ml G418 og 1 pmol /l lapatinib identificerede 9 distinkte aminosyresubstitutioner påvirker 5 rester fra isolerede klonale derivater. Udskiftninger på fem positioner blev identificeret: P944L (3 tilfælde), T798I (2 sager), T798M (1 tilfælde), C576S (1 tilfælde), R487P (1 tilfælde), og E542G (1 tilfælde). Den kritiske gatekeeper threoninrest i tilfælde af ErbB2 er T798- som svarer til T790 af EGFR samt T315 af ABL-kinase. Baseret på nukleotidsekvensen af ​​ErbB2, er det langt mere sandsynligt, at en mutation ville ændre den sekvens, der T798I (kræver et basepar ændring) versus T798M (kræver to baseparændringer). Derfor T798I blev valgt til yderligere undersøgelser.

T798I blev regenereret ved site-directed mutagenese og anvendt til forbigående transfektionsundersøgelser i Cos-7-celler. I pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt COS7-celler, 1 pmol /L lapatinib signifikant inhiberede phosphorylering af ErbB2. I modsætning hertil i pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I transfektanter, blev vedvarende ErbB2 phosphorylering noteret i nærvær af lapatinib ved koncentrationer i området fra 0,1 til 10 mmol /l, hvilket bekræfter skiftet i lægemiddelfølsomhed svarer til resultaterne af MTS assays (fig. 2A). For at bekræfte denne observation, vi frembragte også en stabilt transficeret Calu3 celleklon med pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I-HA plasmidkonstruktion og fundet meget konsekvent resultat (Fig 2B.). Vi vurderede niveauet af modstand, pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I tillægges lapatinib ved at generere dosis-respons kurver af MTS assays på pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I stabile transfektanter. Celler blev dyrket i nærværelse af stigende koncentrationer af lapatinib intervallet mellem 0 og 10 mmol /l. pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt Calu3 celler blev kraftigt inhiberet af lapatinib (IC

50, 2,3 mmol /l). Calu3 celler, der udtrykker pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I var mindre følsomme over for lapatinib med en IC

50, 6,5 mmol /l (figur 2C.)

A.. Dosis respons lapatinib og PD168393 på phosphorylering af ErbB2 i Cos7 celler efter 24 timers kortvarig transfektion med ErbB2-wt og ErbB2-T798I vektorer. Total ErbB2, HA og GAPDH ekspressionsniveau som kontrol. B. Dosis respons lapatinib og PD168393 på fosforylering af ErbB2, AKT og ERK i ErbB2-wt og ErbB2-T798I stabil Calu3 celle kloner. Total ErbB2, total AKT, total ERK, HA og GAPDH ekspressionsniveau som kontrol. C. Dosisafhængig vækstinhibering fremkaldt af behandlingen af ​​lapatinib og PD168393 i 72 timer i ErbB2-wt og ErbB2-T798I stabil Calu3 cellekloner som påvist af MTS-assayet. D. Lapatinib og PD168393 inducere cellulær apoptose i ErbB2-wt og ErbB2-T798I stabil Calu3 cellekloner efter 72 timer behandling. E. Kvantificering af apoptose.

Vi analyserede yderligere de funktionelle konsekvenser af T798I ved at vurdere cellulær apoptose induceret af lapatinib som defineret af Annexin /propidiumiodid apoptose analyser. Behandling af pcDNA3.1 (-) – ErbB2-vægt Calu3 celler med en pmol /l af lapatinib resulterede i en fremtrædende stigning i procentdelen af ​​apoptotiske celler, mens de samme koncentrationer havde fremkaldt signifikant mindre apoptose i pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I stabile transfektanter (fig. 2D og 2E). Disse resultater var i overensstemmelse med forbigående transfektion studere i SKBR3-celler (figur S3, S4 og S5).

En alternativ ErbB2 inhibitor PD168393 kan overvinde modstanden

Dernæst testede vi de T798I Calu3 kloner mod den irreversible ErbB2 /EGFR inhibitor PD168393. Vi gennemførte standard MTS analyser efter 72 timers narkotikabehandling ved hjælp af en række koncentrationer mellem 0 og 10 mmol /l. Vores data viser, at PD168393 kunne overvinde T798I induceret resistens mod lapatinib (fig. 2C). Denne inhibitor var så effektiv over pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I mod pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt transfektanter. I signaling undersøgelser fandt vi, at PD168393 fuldstændig hæmmer AKT og ERK-phosphorylering ved koncentrationer så lave som 0,03 umol /L, således at for bedre at vise den nedstrøms signalering ændring anvendte vi en række koncentrationer fra 0 til 0,1 pmol /l. Signaling undersøgelser viste, at behandling med PD168393 kan kraftigt inhiberer nedstrøms signalering korrelerer såsom phospho-AKT og ERK (fig. 2B). ErbB2 phosphorylering niveau i celler med mutant ErbB2 blev ændret, men i mindre grad af PD168393 inhibering antyder partiel inhibering (fig. 2B). Annexin /propidiumiodid undersøgelser viste endvidere induktionen af ​​apoptose ved denne forbindelse i både pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt og pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I Calu3 cellekloner (. Figur 2D og 2E). Disse resultater tyder på, at T798I kunne være en vigtig modstand mekanisme i lapatinib-behandlede tumorer, men også foreslå potentielle effekt af irreversible ErbB2-hæmmere.

Gen-ekspression profilering af lapatinib-behandlede celler

Dernæst vi sat ud for at studere en omfattende vifte af downstream ændringer som følge af effektiv ErbB2 hæmning. Tidligere i lignende undersøgelser, vi har vist, at så tidligt som ved 6 timers signalering hæmning, den irreversible EGFR-inhibitor, CL-387.785 kunne fremkalde en betydelig ændring af transkription i en lille og repræsentativ gruppe af centrale nedstrømseffektorer af onkogen EGFR-signalering, herunder vigtige pathway komponenter såsom cyclin D1, DUSPs etc i EGFR mutant lungecancere [1], [26], [27]. På en analog måde, vi satte sig for at identificere de tidlige effektorer af ErbB2 induceret genekspression ændringer i ErbB2-positive celler. Udpege de centrale gener udtrykkes differentielt i SKBR3 celler behandlet med lapatinib (1 pmol /l) i 6 timer, blev et gen ekspressionsprofil undersøgelse udført i triplikater på totalt cellulært RNA ved anvendelse Affymetrix HG-U133A chips. De rå udtryk data blev forbehandlet skaleret, filtreret og analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. Generne ændret af lapatinib behandling er vist i tabel S2. Denne analyse viste, at 110 markørgener blev nedreguleret og 73 gener var opreguleret med de strenge kriterier for en mindst 2 gange ændring og Delta værdi 5, når lapatinib-behandlede prøver blev sammenlignet med vehikelbehandlede celler (den Delta-værdi er en tuning parameter, der dynamisk kan ændre tærskler for signifikans).

en sammenligning af dette gen liste med vores tidligere data, der identificerer gen ændringer efter EGFR hæmning i EGFR-afhængige lungekræft celler [27], [28 ] viste en bemærkelsesværdig overlapning mellem de væsentligt modulerede gener i de to uafhængige forsøg (tabel 1). Mere end halvdelen af ​​de identificerede gener i vores tidligere undersøgelse af genregulering af EGFR blokade var signifikant moduleret på ErbB2 hæmning i ErbB2-positive kræftceller samt tyder meget delte onkogene veje. Seks af de øverste ErbB2 /EGFR-regulerede gener, DUSP6, DUSP4, PHLDA1, PHLDA2, CCNG2 og DRE1 blev udvalgt og bekræftet at være stærkt reguleret af kvantitativ revers transkription-PCR-analyse på RNA opnået fra lapatinib-behandlede celler (fig. 3) .

Kvantitativ PCR-analyse af genregulering af lapatinib behandling i 6 timer i SKBR3 og Calu3 celler. Fold induktion i forhold til 0 timer kontrol blev afbildet efter normalisering af GAPDH. Δ: p 0,05; ×: p 0,01; †: p 0,005; *: P 0,001

PHLDA1 nedreguleres ved EGFR /ErbB2 hæmning

Derefter besluttede vi at fokusere på en roman nedstrøms target gen, PHLDA1 som et protein. der tidligere blev ikke identificeret til at deltage i ErbB2 /EGFR drevet veje. Dette gen tilhører gruppen af ​​pleckstrin-homologi domæne proteiner, og er spekuleret at fungere gennem forstyrre funktionen af ​​PI3-kinase hæmmer derved AKT aktivering baseret på arbejde på et andet familiemedlem, PHLDA3 [29]. F.eks.