PLoS ONE: Syntese og Biologisk vurdering af Novel folinsyre Receptor-Målrettet, β-cyclodextrin-Based Drug komplekser for Cancer Treatment

Abstrakt

Drug målretning er et aktivt område for forskning og nano-skaleret lægemiddelafgivelsessystemer hold enormt potentiale til behandling af neoplasmer. I denne undersøgelse har en hidtil ukendt cyclodextrin (CD) -baseret nanopartikel lægemiddelafgivelsessystem blevet samlet og karakteriseret til terapi af folat receptor-positive [FR (+)] cancer. Vandopløselige folinsyre (FA) -konjugerede CD bærere (FACDs) lykkedes syntetiseret og deres strukturer blev bekræftet ved 1D /2D kernemagnetisk resonans (NMR), matrix-assisteret laser desorption ionisering time-of-flight massespektrometer (MALDI- TOF-MS), HPLC (HPLC), Fourier-transformation infrarød spektroskopi (FTIR) og cirkulær dikroisme. Drug komplekser af adamatan (ADA) og cytotoksisk doxorubicin (Dox) med FACD blev let opnås ved blandet udfældningsopløsningsmiddel. Den gennemsnitlige størrelse af FACD-Ada-Dox var 1,5-2,5 nm. Værten-gæst forening konstant

K

et var 1639 M

-1 som bestemt af induceret cirkulær dichroisme og hydrofiliciteten af ​​FACDs blev stærkt forbedret i forhold til umodificeret cd. Cellulær optagelse og FR bindende konkurrencedygtige forsøg viste en effektiv og fortrinsvis målrettet levering af Dox i FR-positive tumorceller og en vedvarende stof frigivelse profil blev set

in vitro

. Leveringen af ​​Dox i FR (+) kræftceller

via

endocytose blev observeret ved konfokal mikroskopi og narkotika optagelse af de målrettede nanopartikler var 8 gange større end for ikke-målrettet drug-komplekser. Vores docking resultater tyder på, at FA, FACD og FACD-Ada-Dox kunne binde menneskelig pindsvin interagerende protein, der indeholder en FR domæne. Mus cardiomyocytter samt fibroblast behandlet med FACD-Ada-Dox, havde signifikant lavere niveauer af reaktive oxygenspecies, med forøget indhold af glutathion og glutathionperoxidase aktivitet, hvilket indikerer en reduceret potentiale for Dox-induceret kardiotoksicitet. Disse resultater indikerer, at den tilsigtede lægemiddelkomplekset besidder højt lægemiddelindhold forening og vedvarende lægemiddelfrigivelsesegenskaber med god biokompatibilitet og fysiologisk stabilitet. Romanen FA-konjugeret β-CD baseret stof kompleks kan være lovende som en anti-tumor behandling for FR (+) kræft

Henvisning:. Yin JJ, Sharma S, Shumyak SP, Wang ZX, Zhou ZW, Zhang Y, et al. (2013) Syntese og Biologisk vurdering af Novel folinsyre Receptor-Målrettet, β-cyclodextrin-Based Drug komplekser for Cancer Treatment. PLoS ONE 8 (5): e62289. doi: 10,1371 /journal.pone.0062289

Redaktør: Caterina Cinti, Klinisk Institut Fysiologi, c /o Toscana Life Sciences Foundation, Italien

Modtaget: December 6, 2012; Accepteret: 19 marts 2013; Udgivet: Maj 2, 2013 |

Copyright: © 2013 Yin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dr. JJY understøttes af en postdoc stipendium fra College of Pharmacy, University of South Florida, 12901 Bruce B Downs Blvd., Tampa, Florida. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft er en førende dræber af mennesker i hele verden, der tegner sig for 7,6 millioner dødsfald (ca. 13% af alle dødsfald) i 2008 [1]. Samlet set en anslået 12,7 millioner nye kræfttilfælde og 7,6 millioner kræftdødsfald fandt sted i 2008, med 56% af nye kræfttilfælde og 63% af kræftdødsfald forekommer i de mindre udviklede regioner i verden [2]. De mest almindeligt diagnosticeret kræft verdensplan er lunge (1,61 mio, 12,7% af totalen), bryst (1,38 mio, 10,9%) og colorektale cancere (1,23 mio, 9,7%). Nye, sikre og effektive behandlinger er klart og presserende behov for at begrænse disse høje dødelighed statistik. De fire store moduler af kræftbehandling omfatter kirurgi, stråling, kemoterapi og immunterapi [3]. Men disse behandlinger er kun lykkes, når kræften opdages på et tidligt stadium, eller begrænset til visse former for kræft (fx leukæmi). På grund af den manglende evne til at detektere cancer på et tidligt stadium, de fleste patienter stede i fremskredent stadium med omfattende lokal infiltration og metastase. Til avancerede tumorer, især de tumorer udvikles fra epitelvæv såsom lunge-, tyktarms-, bryst-, prostata- og bugspytkirtel, disse terapier er mindre vellykkede. Kemoterapi er en af ​​de vigtigste midler til cancerbehandling, som sigter mod at dræbe tumorceller eller til at inhibere deres proliferation samtidig bevare de normale celler i kroppen [3]. Kemoterapeutiske midler generelt har en snæver sikkerhedsmargin, og anvendes i kombination sædvanligvis ved en maksimal tolereret dosis for at opnå maksimal aflivning cancercelle [4]. De dræber tumorceller ved direkte cytotoksicitet, eller aktivere værtens immunrespons, inhibering af proliferationen processer tumorceller, og inducere apoptose [5]. Men de fleste patienter ikke reagerer på disse lægemidler, og de oplever ofte alvorlige bivirkninger såsom alvorlig diarré og tab af hår. Den primære årsag til dette er fordi stoffet dræber både normale celler og tumorceller som følge af lav drug selektivitet og lægemiddelniveauer i tumorceller er for lave. Drug modstand og dosisbegrænsende toksiciteter er de store problemer for succes cancer kemoterapi [6]. I det seneste årti har nano-skaleret, målrettet lægemiddeladministration tiltrukket megen opmærksomhed som et middel til at forbedre helbredende virkning af eksisterende kemoterapeutiske midler samtidig reducere de negative virkninger [7], [8]. Den seneste dramatiske udvikling inden for nanoteknologi har skabt et utal af anticancer nano-lægemidler; Men de fleste nuværende nano-drug-systemer kommer til kort i let rensning, reproducerbarhed og batch-til-batch konsistens [9], [10]. Forberedelsen og karakterisering af nano-lægemiddelformuleringer især for vandige lægemiddelkomplekserne fortsat en stor udfordring.

anthracyclinglycosid antibiotikum, doxorubicin (Dox), er en potent, bredspektret middel mod cancer, der virker ved interkalerende inden DNA og inhibering af DNA-syntese [11]. Dox bruges ofte til at behandle nogle leukæmier og Hodgkins lymfom, samt cancere i blæren, brystet, maven, lunge, ovarier, skjoldbruskkirtel, og bløddelssarkom. Ved de sædvanlige kemoterapeutiske doser, Dox er kardiotoksisk og det kan også øge risikoen for leukæmi, især når det gives i høje doser eller sammen med visse andre kemoterapeutiske stoffer eller strålebehandling [11] – [16].

Formålet med denne rapport er at præsentere en metode til at syntetisere en ny og effektiv medicin kompleks for målrettet levering lægemiddel (figur 1). Kombinere rettet mod molekyler, narkotika luftfartsselskaber og cytostatika i en kompleks bør garantere stabilitet konjugat i omløb og forsikre til spaltning til frigivelse af lægemidlet. Den β-CD blev vektoriseret med folinsyre (FA) for at målrette folatreceptorer (FR’er) på tumorcelleoverfladen. Dox-holdige FR-targeting p-cd’er blev syntetiseret ved en flertrins reaktion, hvor a- og y-amid monomerer samt di-CD substitueret FA bærer blev oprenset og fuldt karakteriseret ved et panel af spektrale teknikker.

in vitro

medikamentfrigivelsesprofilen blev bestemt ved dialyse og fluorescens måling, og målrettet drug bindende

in vitro

blev kvantificeret ved flowcytometri og konfokal mikroskopi. Cytotoksiciteten af ​​de forskellige narkotika komplekser blev målt, og de biomarkører relateret til gratis Dox-induceret kardiotoksicitet blev også undersøgt på celleniveau.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

β-cyclodextrin-hydrat og cerim (IV) sulfat-tetrahydrat blev indkøbt fra Acros Organics (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Ammoniummolybdat (para) tetrahydrat blev købt fra Alfa Aesar Inc. (Ward Hill, MA).

s

toluensulfonylchlorid,

N

,

N

‘-dicyclohexyl-carbodiimid (DCC), folinsyre (FA),

N

hydroxysuccinimid (NHS), doxorubicinhydrochlorid, 1-adamantancarbonylchlorid, ammoniumbicarbonat, natriumazid, triphenylphosphin, 2 ‘, 7′-dichlorfluorescein-diacetat (DCFH-DA), 5, 5’-dithiobis (2-nitrobenzoesyre) (DTNB), reduceret glutathion (GSH), hydrogenperoxid, kaliumhydroxid, natriumhydroxid, phosphorsyre, ammoniak hydroxid, ninhydrin, saltsyre, iod, svovlsyre, eddikesyre, deuteriumoxid, chloroform-d, dimethylsulfoxid-d

6, og CM Sephadex C

25 blev alle anskaffet fra Sigma-Aldrich Chemicals Co. (St. Louis, MO). Paraformaldehyd blev opnået fra EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ). Den bicinchoninsyre (BCA) assaykit blev indkøbt fra Pierce (Rockford, IL). CM-H

2DCFDA blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA). Pro-prep (TM) Protein udvinding kit blev købt fra intron Biotechnology Inc. (Kyungki-Do, Korea). Den glutathionperoxidase (GPX) assaykit blev opnået fra BioVision Inc. (Milpitas, CA). Spectra /Por dialysemembran med en molekylvægtafskæring på 3000 Da blev indkøbt fra Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA). Alle opløsningsmidler til kromatografisk isolation var af analytisk kvalitet. HPLC-kvalitet acetone, butanol, acetonitril (ACN), ethylacetat (EtOAc), hexan, methanol, 1-propanol (1-PA), 2-propanol, dichlormethan (DCM), pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid ( DMSO) og tyndtlagskromatografi plader (1.000 um og 200 um) blev indkøbt fra Fisher Scientific Co. (Fair lawn, NJ). Varmeinaktiveret føtalt bovint serum, føtalt bovint serum, og serum fra nyfødte kalve blev indkøbt fra Hyclone Laboratories Inc. (Logan, UT). FR og β-actin-antistof blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). HRP muse anti-kanin IgG-monoklonalt antistof blev købt fra Prosci Inc. (San Diego, CA). Pierce ECL western blotting substrat blev indkøbt fra Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA).

Celler og cellekultur

JEG-3 og JAR (begge afledt fra human placenta choriocarcinom), HT -29 (human tyktarmskræft), MCF-7 (human brystcancer), H9c2 (2-1) celler (muse cardiomyocytter) og 3T3 (mus fibroblast) cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . JEG-3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) med 10% serum fra nyfødte kalve; JAR og MCF-7-celler blev dyrket i RPMI-1640 med 10% nyfødt kalveserum; HT-29 celler blev dyrket i McCoys 5A med 10% nyfødt kalveserum; og 3T3-celler blev dyrket i DMEM med 10% føtalt kalveserum. Alle cellelinier blev inkuberet i 5% CO

2 og 90-100% relativ fugtighed ved 37 ° C. Fornyelse af mediet blev udført 2-3 gange om ugen, og celler blev videredyrket når de opnået 80-90% konfluens. For præparatglaspræpareringsprotokol, 2 × 10

4-celler blev udpladet på 0,7 cm x 0,7 cm Nunc mærke chamber slides fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Celler blev vasket tre gange i phosphatbufret saltvand (PBS) og overlagt med Vectashield mærke montering medium indeholdende 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) indkøbt fra Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA).

Western blot assay

proteinindholdet blev bestemt under anvendelse af BCA-metoden efter proteinekstraktion fra cellerne. Ekspressionsniveauet af FR i JAR, HT-29, MCF-7 og 3T3-cellelinier blev bestemt ved Western blot-assay. Kort fortalt blev cellemonolag vasket med PBS og derefter lysaterne blev kogt i 10 min, og en alikvot blev anvendt til at evaluere proteinindhold ved BCA-assay. En alikvot af totalt protein (0,2 mg) blev analyseret ved 12% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Efter elektroblotting af geler på polyvinylidendifluorid (PVDF) ark (Millipore, Bedford, MA), filtrene blev blokeret ved stuetemperatur med Tris-pufret saltopløsning Tween-20 (TBST) puffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 % Tween 20, og 150 mM NaCl) indeholdende 10% fedtfri tørmælk og inkuberes derefter i TBST-puffer natten over ved 4 ° C med en 1:200 fortynding af FR-antistof og 1:10,000 fortynding for β-actin antistof. Efter vask med TBST-buffer, blev blots inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med muse anti-kanin IgG monoklonalt antistof fortyndet 1:3,000 i TBST-puffer og derefter afsløret ved forøget kemiluminescens (ECL).

Kemisk syntese af Folic Acid Receptor-Målrettet, β-cyclodextrin-Based Drug Komplekser

For at syntetisere mono-6-deoxy-6 – (

s

tolylsulfonyl) -β-cyclodextrin (Ts-CD), en opløsning af

s

toluensulfonylchlorid (846,3 mg, 4,44 mmol) i 5 ml ACN sattes til 80 ml vandig opløsning af β-CD (5,0 g, 4,44 mmol) og NaOH (434,8 mg, 10,8 mmol) dråbevis i løbet af 15 min. Efter omrøring i 4 timer ved 0 ° C i N

2 atmosfære blev opløsningen neutraliseret ved tilsætning af 0,6 ml 2,0 N vandig saltsyre, og produktet blev omkrystalliseret ved 4 ° C natten over og derefter vasket med acetone. Ts-CD blev opnået i et udbytte på 84,6% (figur 2 og figur S1 S2).

Mono-6-azido-6-deoxy-β-cyclodextrin (N

3 -CD) blev opnået ved omsætning af Ts-CD og natriumazid i 5 timer ved 80 ° C med et udbytte på 91,5%. Mono-6-deoxy-6-aminoβ-cyclodextrin (NH

2-CD): N

3-CD og triphenyl phophine blev opløst i DMF, og ammoniakopløsning blev tilsat, og opløsningen blev omrørt i 3 dage ved 50 ° C. Den endelige opløsning blev omkrystalliseret i acetone for at give forbindelsen NH

2-CD i 79% udbytte (figur 2 og figur S3), som blev oprenset ved ionbytningssøjle med deioniseret vand og 0,1 M (NH

4)

2 CO

3.

Ada-COCI blev opløst i anhydrat DCM blandet med ET

3N, og derefter omrørt ved stuetemperatur i 3 timer under N

2. Doxorubicinhydrochlorid blev derefter tilsat, omrørt natten over og adskilt ved præparativ tyndtlagschromatografi (TLC). Ada-Dox blev opnået og oprenset ved flashsøjlekromatografi med et udbytte på 80,5% (Figur 2 og Figur S4). Salg

En blanding af folinsyre (20 mg, 0,045 mmol), 1,2 ækvivalenter DCC (11 mg , 0,054 mmol) og 1,2 ækvivalenter NHS (6 mg, 0,054 mmol) i vandfrit DMF (5 ml) blev omrørt ved stuetemperatur under en nitrogenatmosfære og i et mørkt i 3 timer. Derefter blev 50 mg af NH

2-CD (1 ækvivalent) og 0,8 ml pyridin, og blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i mørke i 8-40 timer. Reaktionsblandingen blev derefter udfældet med 50 ml acetone og skylles successivt tre gange med 50 ml acetonitril, ethylacetat og ethanol til fjernelse af hydrofobe biprodukter. Det resulterende gule bundfald (48 mg) blev opsamlet ved centrifugering og opløst i 20 ml deioniseret vand. En klar, vandig opløsning (15 ml) blev opnået ved vakuumfiltrering, som blev dialyseret ekstensivt mod deioniseret vand i en uge, med dialyse vand bliver fornyet hver dag. Den vandige opløsning blev koncentreret ned til 5 ml og blev kromatograferet på en CM sephadex C

25 ionbytning flashsøjle med deioniseret vand og efterfulgt af præparativ tynd væskekromatografi elueret med 1-PA: EtOAc: H

2O: NH

3H

2O (6:1:2.5:1). Produkterne indeholdt folinsyre konjugater og en anden olieagtig gul biprodukt med polaritet svarende til det ønskede produkt. Endelig blev diastereomererne totalt oprenset ved omkrystallisation i acetone tre gange og tørres i en vakuum ovn natten over. Dette resulterede i produkterne, mono-6-deoxy-6- (γ- (2

S

) -2 – [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yl) methyl ] amino} phenyl) formamido] pentandisyre) -β-cyclodextrin (γ-FACD) 11,6 mg (figurerne S5 S5) i 41,6% udbytte (mørkegult pulver), mono-6-deoxy-6- (α- ( 2

S

) -2 – [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yl) methyl] amino} phenyl) formamido] pentandisyre) -β-cyclodextrin (α-FACD ) 3,2 mg (fig S7 S8) i 11,4% udbytte (lysegult pulver), samt spormængde af di-mono-6-deoxy-6 – ((2

S

) -2- [(4 – {[(2-amino-4-hydroxypteridin-6-yl) methyl] amino} phenyl) formamido] pentandisyre) -β-cyclodextrin (FA-di-CD) 3,4 mg (fig S9) i 7,1% udbytte (figur 2).

dannelsen af ​​gæst-vært inklusionskomplekser mellem Ada-Dox og folinsyre-konjugeret cyclodextriner blev fremstillet ved co-udfældning og tørremetode med 01:01 støkiometri. FACDs (1 ækv) blev opløst i vand, og DMSO-opløsningen for Ada-Dox (1 ækv) blev tilsat til cyclodextrin-opløsning og derefter omrørt natten over ved 4 ° C efterfulgt af delvis fordampning. Bundfaldet blev opsamlet ved filtrering.

kernemagnetisk resonans (NMR) og Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisering Time-of-Flight Mass Spectrometer (MALDI-TOF-MS)

høj opløsning

1H NMR-spektre blev optaget på et digitalt NMR Spectrospin Bruker Avance 600 MHz og 800 MHz (Bruker BioSpin Co, The Woodlands, TX). Kinetikken af ​​lægemidlerne frigivelse blev målt ved anvendelse af et Perkin-Elmer Lambda 2 UV /Vis dobbelt stråle-spektrofotometer. Fluorescens mikroskopi billeder blev opnået med Applied Precision DeltaVision systemet (Issaquah, WA) udstyret med et Olympus inverteret mikroskop IX 70 (Tokyo, Japan). Billedet arbejdsstation omfatter SoftWoRx software til digital billedfangst, deconvolution, og optisk skæring.

Massespektre blev opnået ved et Bruker Daltronics Autoflex MALDI-TOF (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA), med α-cyano -4-hydroxykanelsyre (CHCA) som matrix (10,0 mg /ml, fra Thermo Scientific Pierce). Dataanalyse blev udført med mMass programmet.

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

HPLC analyser blev udført på en Agilent 1260 Infinity HPLC-system (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, Californien ), der omfattede G1312C solvent levering binære pumper, et G1379B afgasser, et G1329B auto-sampler, et G4212B foto-diode array detektor, en G1321B Fluorescensdetektor samt Chemstation operativsystem software (Rev. B. 04. 03). HPLC var udstyret med en Agilent Eclipse Plus C

18-søjle med en partikelstørrelse på 3,5 um og kolonne størrelse på 100 mm x 4,6 mm, som blev anbragt i en kolonne ovn (G1316A) under en konstant temperatur ved 25 ° C . Den mobile fase bestod af acetonitril og vand (gradient). Søjlen Strømningshastigheden blev sat til 1,0 ml /min, medens HPLC trykket blev kontrolleret mellem 260-290 bar.

HPLC-UV /evaporativ lysspredningsdetektor (ELSD) og HPLC-DAD /fluorescens separation var som følger: eluent A, vand; eluent B, acetonitril; gradient, 0-6 min (10-15% B), 6-50 min (15-40% B), 50-60 min (40-80% B), og derefter ækvilibreret med 10% B i 8 minutter ved en flow på 1,0 ml /min. ELSD blev fastsat til en probe temperatur på 70 ° C, en gevinst på 7 og nebulizer gas nitrogen justeret til 2,5 bar.

Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)

Instrumentet anvendes til FTIR analyse var et Perkin-Elmer 1725 series FTIR spektrometer (Perkin-Elmer Co., Norwalk, CT) udstyret med en rumtemperatur deutereret triglycinsulfat sulfat detektor og kontrolleres af et Perkin-Elmer 7300 PC. Den bruges til opsamling af FTIR data software var Spectrum-version 5.3.1.

cirkulær dikroisme Analyse

cirkulær dikroisme spektra blev registreret ved 25 ° C i en Aviv model 215 cirkulær dichroisme spektrometer (Aviv Biomedicals Inc., Lakewood, NJ) under anvendelse af en 0,1 cm celle for tre scanninger med 0,1 nm båndbredde. Koncentrationen af ​​lægemidlerne var 50 pM i DMF medmindre andet er angivet. Synergy H4 hybrid multi-mode mikropladelæser blev købt fra BioTek Instruments Inc. (Winooski, VT).

Transmission Electron Microscopy (TEM) og Atomic force mikroskopi (AFM)

morfologi og størrelse FACD-Ada-Dox supramolecules blev evalueret ved transmissionselektronmikroskopi (TEM) og atomic force mikroskopi (AFM). En vandig opløsning af FACD-Ada-Dox blev direkte dryppede på en 300-mesh kobber gitter og tørret i en vakuumovn ved 35 ° C i 4 timer, derefter billeder blev observeret ved TEM (JEM 100CX, JEOL Ltd., Tokyo, Japan) med en accelererende spænding på 160 kV. For AFM billeder blev prøven opløst i dobbelt deioniseret vand (1,0 mg /ml), blev en prøve af opløsningen (5,0 pi) spottet på en frisk spaltet glimmer overflade og opvarmet ved 37 ° C i 3 timer. Billeddannelse blev udført på en multimode Nanoscope AFM i aflytning tilstand, under anvendelse af en fluid celle, J scanner og 200 um cantilevere med 1 nm Si

3N

4 tips.

3- (4, 5- dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) Assay

JAR, HT-29 og 3T3-celler blev podet i 96-brønds vævskulturplader og opretholdt natten over i DMEM-medium. Celler blev derefter behandlet med Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox, eller NFACD-Ada-Dox ved forskellige koncentrationer og inkuberet i 24 timer ved 37 ° C. Absorbansen blev målt efter tilsætning af MTT. MTT reduceres af mitokondrielle dehydrogenaser i levende celler til et blåt mageta farvet formazan bundfald. Absorbansen af ​​opløst formazan i det synlige område korrelerer med antallet af intakte aktive celler. Cytotoksiciteten blev evalueret med henvisning til IC

50 værdi, der blev defineret som den koncentration nødvendig for en reduktion af overlevelse på 50% baseret på overlevelseskurverne. IC

50-værdier blev beregnet ud fra dosis-respons kurver (dvs. celleoverlevelse fraktion

vs

. Lægemiddelkoncentration) opnået i multi-replikerede eksperimenter.

Drug frigivelsesassay

in vitro

release profiler og kinetik den målrettet drug FACD-Ada-Dox og prodrug Ada-Dox blev bestemt ved en dialyse metode. Kort beskrevet 3 ml vandig lægemiddel blev tilsat til 1 ml PBS (pH 7,4, 0,01 M). Blandingen blev suspenderet i en dialysepose (molekylvægtafskæring: 3.000 Dal) og dialyseres mod 10 ml PBS indeholdende 50% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C under forsigtig omrystning i tre dage. En 20 pi alikvot af prøven blev udtaget fra inkubationsmediet på angivne tidspunkter og opbevaret nedfrosset til analyse. Den frigivne Ada-Dox blev kvantificeret ved mikropladelæser ved λ

Ex

= 490 nm og λ

Em

= 600 nm. En kalibreringskurve blev fremstillet under anvendelse af forskellige koncentrationer af frit Ada-Dox.

Flowcytometri

Flowcytometrisk analyse blev udført på en FACS (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) ved at tælle 10.000 begivenheder. At evaluere apoptose af celler behandlet med forskellige lægemidler ved ækvivalente koncentrationer blev Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox og NFACD-Ada-Dox i en slutkoncentration på 5,0 uM tilsat til de fremstillede 35 mm petriskåle indeholdende 2 × 10

5 HT-29, MCF-7 eller JAR-celler i 3,0 ml dyrkningsmedium. Cellerne blev inkuberet i 2 timer for at tillade optagelse af lægemidlerne. Før analyse blev cellerne omhyggeligt vasket med PBS tre gange, trypsinbehandlet og resuspenderet i mediet efter inkubation. De opsamlede celler blev igen dispergeret i 500 pi frisk PBS og farvet med 20 pi DAPI ved 1,0 uM til flowcytometrisk analyse. Fluorescensen af ​​Dox-relateret molekyle blev målt med λ

EX

ved 490 nm og λ

EM

ved 600 nm. De ubehandlede celler inkuberet med DMEM alene (indeholdende 10% FBS, suppleret med 1% penicillin) blev anvendt som kontroller.

Folat receptorbindende-test

I lægemiddeloptagelse konkurrence-assay JAR-celler (FR positiv) blev podet i 35 mm petriskåle indeholdende 5 × 10

5-celler og inkuberet ved 37 ° C med FACD-Ada-DOX ved 2 uM i 5 timer i nærvær af FA på 5, 10 eller 50 uM. Derefter blev cellerne vasket med PBS tre gange, trypsinbehandlet og resuspenderet i PBS. De opsamlede celler blev igen spredt og fluorescensintensiteterne blev bestemt ved flowcytometer.

Konfokal Laser Scanning Mikroskopi

Konfokal billeder blev optaget med en PerkinElmer UltraView ERS spinning disk konfokal mikroskop (PerkinElmer Inc. , Waltham, MA). JAR eller JEG-3 celler blev podet på dækglas i to brønde og dyrket natten over. Celler blev derefter inkuberet med eller uden 5,0 uM lægemidler til 2 timer. Cellerne blev vasket med PBS tre gange for at fjerne ubundne stoffer og fikseret i 2 ml 4% paraformade ved stuetemperatur i 15 min. Fikserede celler blev vasket tre gange og derefter monteret med medium indeholdende DAPI (1,5 ug /ml). Objektglas blev hærdet natten over i mørke. For at undersøge optagelsen af ​​lægemidler over 2 timer i celler behandlet med forskellige lægemiddelkomplekserne blev cellerne eksponeret for lægemidler med forskellige inkubationstider (15 min tilvækst). Billederne blev indsamlet og analyseret.

Molekylær Docking af bindingen af ​​FA og dens Konjugater Human Hedgehog interagerende protein (HHIP)

Desværre krystalstrukturer af menneskers og dyrs RCF /SLC19A1, FR /FRα /FLOR1, FRβ /FLOR2, FRγ /FLOR3, FRδ /FLOR4 og PCFT /SLC46A1 er ikke blevet løst hidtil. Ingen strukturer af bakterie- og gær homologer er blevet rapporteret og det er således usandsynligt, at opbygge en homologi-model. Vi har udført indledende docking undersøgelse af FA og konjugaterne til HIPP der indeholder en FRα domæne blev undersøgt under anvendelse Discovery Studio 3.1 (Accelrys Software Inc., San Diego, CA) som beskrevet af os tidligere [17], [18]. Flere funktionelle moduler i Discovery Studio 2.1 blev anvendt, herunder Diverse kropsbygning Generation, Beregn Molecular Properties, Opret multipel lineær regression Model, og CDOCKER. Programmet blev kørt under anvendelse af en Dell optiplex755 server og Chemoffice2002 (CambridgeSoft, Cambridge, MA) blev anvendt for forbindelse strukturel forfinelse. Krystalstrukturen af ​​HHIP blev valgt fra Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/pdb/) med FBF ID 2WFT [19], som viste sig at indeholde en FRα domæne, når vi søgte pCAM 26.0 database (https://pfam.sanger.ac.uk/). Pfam database er en stor samling af protein-familier, der hver repræsenteres af flere sekvenssammenligninger og skjulte Markov modeller. De molekylære dynamik (MD) simuleret annealing blev udført ved anvendelse af en stiv protein og fleksibel ligand. Ligand-FRα interaktioner blev beregnet fra enten GRID I, GRID II, eller det fulde kraftfelt. En endelig minimering trin blev påført hver af liganden s docking udgør. Under ligand forberedelse, blev to eksemplarer struktur slettet. Mulighederne for ionisering forandring, tautomer eller isomer generation, Lipinski filter og 3D generator blev alle sat rigtigt [20]. Efter forfinet med CHARMM blev forbindelserne dokket i muligt bindingssted af proteinet. Docking blev udført med hensyntagen til elektrostatisk energi og van der Waals (VDW) kraft, der var blevet blødgjort på forskellige niveauer under docking proces, men denne blødgøring fjernes ved den endelige minimering [21] .For hver defineret VDW eller elektrostatisk probe , interaktionerne med alle protein-atomer blev opbevaret ved disse gitterpunkter. For ligand atomer placeret mellem gitterpunkter blev en tri-lineær interpolation bruges til at tilnærme energier. En harmonisk potentiale med den kraft konstant på 300 kcal /mol blev anvendt uden for gitteret grænsen.

Bestemmelse af Cellular Reaktive Oxygen Species (ROS) Niveauer

De intracellulære ROS niveauer i mus H9c2 (2 -1) celler blev kvantificeret ved hjælp af CM-H

2DCFDA som sonden for ROS produktion [22]. CM-H

2DCFDA er en chlormethyl-derivat af H

2DCFDA, nyttig som en indikator for ROS i cellerne. H9c2 (2-1) celler blev podet på et fad med en tæthed på 3 x 10

6 brønd og dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C i 24 timer. Cellerne blev behandlet med Dox, Ada-Dox, FACD-Ada-Dox, eller NFACD-Ada-Dox, og derefter skyllet med PBS. Bagefter blev fluorescensintensiteten målt. Lægemiddelkoncentrationen var 2,0 uM i H9c2 (2-1) celler. Kontrolsekvenserne celler blev behandlet med køretøjet DMSO i en slutkoncentration på 0,05% (v /v).

intracellulære ROS-niveauer i muse-3T3-celler blev kvantificeret under anvendelse af dichlorfluorescein assayet [23]. 3T3-celler blev podet på en plade med 96 brønde med en tæthed på 10

5 celler per brønd og dyrket i 5% CO

2 ved 37 ° C i 24 timer. Cellerne blev behandlet med Dox, Ada-Dox, eller FACD-Ada-Dox ved 5,0 uM, hvorefter cellerne blev derefter skyllet med PBS, efterfølgende 75 pi PBS, og 25 pi opløsning af 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetat (DFCH-DA) ved en slutkoncentration 62,5 uM i PBS-buffer blev tilsat til hver brønd. Fluorescensen fra hver brønd blev målt ved 35 ° C umiddelbart efter inkorporering af reagenset og hver 5 min i 1 time med 1 sek integrationstid, under anvendelse 485 og 535 nm som excitations- og emissionsbølgelængder. Registrering af fluorescensintensiteten med tiden blev anvendt som et indeks for de enkelte intracellulære niveauer af ROS i 3T3-celler. Svaret af metoden blev kontrolleret ved hjælp af en H

2O

2 kurve. blev udført fem uafhængige forsøg per behandling.

Måling af glutathionperoxidase (GPX) Aktivitet og GSH Content

Proteinindholdet blev bestemt ved anvendelse af BCA-metoden efter protein ekstraktion fra cellerne. Aktiviteterne i GPX og indholdet af GSH blev skaleret til proteinindhold for at korrigere for forskelle i biomasse af de forskellige homogenater. Niveauerne af GSH i cellerne blev bestemt i overensstemmelse med den metode Beutler

et al

. [24] baseret på dannelsen af ​​2-nitro-5-tiobenzoic syre fra DTNB i nærvær af GSH. Kort fortalt blev 25 pi trichloreddikesyre (15%) tilsat til 50 pi af homogenatet, efterfulgt af centrifugering ved 13, 000

g

i 5 min ved 4 ° C. En supernatant portion (50 pi) blev blandet med 50 pi af 3,4 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløst i PBS, 1 ml PBS, og 250 pi DTNB i PBS (20 mg /ml). Absorbansen blev målt ved 412 nm efter 15 minutter og sammenlignet med en standardkurve for GSH (0,01-0,5 mM). GPX-aktiviteten blev målt baseret på oxidationen af ​​GSH af GPX koblet til forsvinden af ​​reduceret nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADPH) ved glutathion reduktase.

Statistical Analysis

Data er udtrykt som middelværdien ± standardafvigelse (SD). Sammenligningen af ​​værdier for flere behandlingsgrupper blev udført af en- eller to-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Bonferroni multipel sammenligning test på

P

0,05. Forskelle mellem to grupper blev analyseret ved hjælp af uparrede Students

t

-test. En

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Syntese af FACDs og FACD-Ada-Dox og deres strukturelle Bestemmelse ved Spectral Techniques

.

den syntetiske procedure for FR målrettet β-CD baseret adamantan-Dox supramolecule er afbildet i figur 2. for at konstruere supremolecule blev de rettet mod narkotika luftfartsselskaber forberedt først. Mono-6-amino-6-deoxy-CD (NH

2-CD) blev syntetiseret som udgangsmateriale ifølge fremgangsmåden af ​​Petter

et al

. [25] med visse modifikationer. b.