PLoS ONE: Naturlig proteasominhibitoren Celastrol Undertrykker androgen-uafhængige prostatakræft Progression ved Modulerende Apoptotiske Proteiner og NF-kappaB

abstrakt

Baggrund

Celastrol er en naturlig proteasominhibitor som udviser lovende antitumorvirkninger i humane maligniteter, især androgen-uafhængig prostatacancer (AIPC) med konstitutiv NF-KB-aktivering . Celastrol inducerer apoptose ved hjælp af proteasomhæmning og undertrykker prostata tumorvækst. Men den detaljerede virkningsmekanisme stadig vanskeligt at definere. I den aktuelle undersøgelse, vi sigter mod at teste hypotesen om, at celastrol undertrykker AIPC progression via hæmme konstitutive NF-KB-aktivitet samt modulere Bcl-2 familie proteiner.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgte effekten af ​​celastrol både

in vitro

in vivo

, og evalueret rolle NF-KB i celastrol-medieret AIPC regression. Vi fandt, at celastrol inhiberede celleproliferation i alle tre AIPC cellelinier (PC-3, DU145 og CL1), med IC

50 i størrelsesordenen 1-2 uM. Celastrol undertrykt også celle migration og invasion. Celastrol signifikant induceret apoptose som påvist ved forøget sub-G1 population, caspaseaktivering og PARP-spaltning. Desuden celastrol fremmet spaltning af anti-apoptotiske protein Mcl-1 og aktiveret den pro-apoptotiske protein Noxa. Desuden celastrol hurtigt blokeret cytosolisk kBa nedbrydning og nuklear translokation af RelA. Ligeledes celastrol inhiberede ekspressionen af ​​multiple NF-KB målgener der er involveret i proliferation, invasion og anti-apoptose. Celastrol undertrykte AIPC tumorprogression ved at inhibere proliferation, øge apoptose og faldende angiogenese, i PC-3 xenograft model i nøgne mus. Desuden øget cellulær kBa og hæmmede ekspression af forskellige NF-KB målgener blev observeret i tumorvæv.

Konklusioner /Betydning

Vores data tyder på, at, via målrettet proteasomet, celastrol undertrykker spredning, invasion og angiogenese ved at inducere apoptotisk maskiner og formildende konstitutive NF-KB-aktivitet i AIPC både

in vitro

in vivo

. Celastrol som en aktiv bestanddel af traditionel urtemedicin kunne således udvikles som en ny terapeutisk middel til hormon-refraktær prostatakræft

Henvisning:. Dai Y, DeSano J, Tang W, Meng X, Meng Y, Burstein E et al. (2010) Natural proteasominhibitoren Celastrol Undertrykker androgen-uafhængige Prostata Cancer Progression ved Modulerende Apoptotiske Proteiner og NF-kappaB. PLoS ONE 5 (12): e14153. doi: 10,1371 /journal.pone.0014153

Redaktør: Gen Sheng Wu, Wayne State University, USA

Modtaget: 10. juli 2010; Accepteret: November 10, 2010; Udgivet: December 10, 2010

Copyright: © 2010 Dai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Department of Defense Prostata Cancer Research Program [W81XWH-06-1-0010] og National Institutes of Health (NIH) National Cancer Institute [R01 CA121830 (S1), R21 CA128220 og R01 CA134655] til LX, og ved NIH gennem en University of Michigan Cancer center Support Grant [5 P30 CA46592]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

proteasomet er et multicatalytic protease kompleks er ansvarligt for nedbrydningen af ​​multiple intracellulære proteiner, der er involveret i forskellige cellulære begivenheder, herunder DNA-reparation, cellecyklus, overlevelse og apoptose. Fx p27, en central regulator for G1 til S overgang i cellecyklussen, er hurtigt ubiquitineret og nedbrudt af proteasomer fører til p27 korte halveringstid [1]. Desuden er de fleste Bcl-2-familien proteiner nedbrydes af ubiquitin-proteasom systemet (UPS) [2], [3], [4]. Nuklear faktor kappaB (NF-KB) er en vigtig pro-overlevelsesfaktor der er drejeligt reguleret af proteasomet, da det er velkendt, at i den klassiske NF-KB-vejen, kBa, den sekvestrerer af NF-KB, nedbrydes af den proteasomet, derfor befriende NF-KB til aktivering [5].

Montering beviser viser, at vedvarende eller konstitutiv aktivering af NF-KB bidrager til malign progression og terapeutisk modstand i de fleste humane cancere [6]. For eksempel i prostatacancer, konstitutivt aktiv NF-KB har vist sig at være omvendt korreleret med androgen receptor status og knyttet til androgen uafhængighed og terapi resistens [7]. Den forhøjede NF-KB overlevende signalvejen i androgen-uafhængige prostatacancer (AIPC) synes at være korreleret med høj proteasomaktivitet, hvilket fremgår af en hurtigere omsætning af kBa [8], [9]. Baseret på denne dokumentation, kan målrette proteasomer falde NF-KB-aktivitet og dermed være en nyttig strategi i AIPC intervention. Faktisk har modulering af proteasomalaktivitet funktion med specifikke inhibitorer allerede blevet påvist som en lovende metode til behandling af human prostatacancer. Bortezomib (Velcade; PS-341), den første til at bruge en proteasominhibitor i en klinisk anvendelse, har vist antitumoraktivitet, når de anvendes som et enkelt middel eller i kombination med konventionelle behandlinger i hormon-refraktær prostatacancer [10]. I prækliniske kræftmodeller, Proteasominhibitorerne fremkalde prostatakræft apoptose både

in vitro

in vivo

[11], [12], der giver betydelige beviser, at Proteasominhibitorerne kan anvendes som et terapeutisk strategi for AIPC.

Celastrol er en naturlig proteasominhibitor der er blevet rapporteret at vise antiproliferative effekter og apoptose i flere prækliniske kræftmodeller [12], [13]. Mekanistisk, har NF-KB vist sig at være et vigtigt mål for celastrol [14]. Nylige undersøgelser har antydet, at celastrol kan forbedre apoptose og blokere enten konstitutiv eller induceret NF-KB-aktivering med andre terapeutiske midler, såsom tumornekrosefaktor [15], temozolomid [16] og gambogic syre [17]. Endvidere celastrol foreslås at undertrykke xenotransplanteret tumorvækst via målretning angiogenese [18], [19]. I indstillingen prostatakræft, celastrol alene udløser apoptose ved hjælp af proteasomhæmning og undertrykker prostata tumorvækst [12]. Men den direkte virkningsmekanisme stadig vanskeligt at definere. I den aktuelle undersøgelse, vi sigter mod at teste hypotesen om, at celastrol undertrykker AIPC progression via hæmme konstitutive NF-KB-aktivitet samt modulere Bcl-2 familie proteiner. Vi bestemt effekten af ​​celastrol både

in vitro

in vivo

, og evalueret rolle NF-KB i celastrol-medieret AIPC regression.

Materialer og metoder

Reagenser og Cell Culture

Celastrol (98% renhed) blev købt fra Gaia Chemical (Gaylordsville, CT). Pulveret blev løst i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret som aliquots (20 mM) ved -70 ° C. MG-132 blev købt fra BIOMOL (Plymouth Meeting, PA). Protease inhibitor cocktail blev leveret af Roche (Indianapolis, IN). Andre kemikalier blev indkøbt fra Sigma, medmindre andet er angivet. Human prostatacancer-cellelinier PC-3 blev DU145 og LNCaP indkøbt fra American Type Culture Collection. Androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinie CL1, afledt af androgen-afhængige LNCaP-cellelinje [20], blev venligst stillet til rådighed af Dr. Arie Belldegrun (University of California, Los Angeles, CA). Celler blev opretholdt i RPMI-1640 (PC-3) eller DMEM (DU145, LNCaP og CL1) suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og inkuberet i en CO 5%

2 befugtet inkubator ved 37 ° C.

celleproliferation og celledød

Celler blev podet i en 96-brønds plade og behandlet med celastrol i tre eksemplarer. Efter 4 dages inkubation blev levedygtige celler identificeres under anvendelse af en celletælling kit med WST-8 (Dojindo, Rockville, MD) og absorbansen blev testet ved 450 nm kolorimetrisk. Cellelevedygtighed (%) var forholdet mellem absorbans af behandlede prøve til ubehandlet kontrol [21], [22]. Alternativt blev celler podet i en 24-brønds plade med en tæthed på 2 x 10

5 celler /brønd og behandlet med celastrol i dobbelte brønde. Vedhæftede celler blev høstet og talt ved anvendelse af en Coulter celletæller (Fullerton, CA) hver 24 timer i 4 dage. Celledød blev testet af trypanblåteksklusion for både flydende og vedhæftede celler [21], [23]. Data blev afbildet og analyseret ved GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA). Halvtreds procent hæmmende koncentrationer (IC

50) blev beregnet ved hjælp af en S-formet dosis-respons-lineær regressionsanalyse (Prism 5,0) [21], [22], [24].

Cell Migration

Cell migration blev bestemt ved en “sårhelende” assay [25], [26]. Celler blev podet i en 6-brønds plade og voksede i 48 timer for at nå konfluens. Huller blev skabt kunstigt ved at skrabe cellemonolaget. Cellemigrering fotograferet 6 timer, 24 timer og 48 timer efter hver bunden. Celler migrerer ind i det blottede område blev scoret fra fire tilfældige felter.

Cell Invasion

Invasion blev testet ved hjælp Transwell (8 um pore) præinstalleret med Matrigel (BD Biosciences, San Diego, Californien ). Celler blev inkuberet med eller uden celastrol (1 uM) i et serum-frit medium og fyldt på den øverste kammer (2 × 10

4 /insert). Det komplette medium (10% FBS) blev tilsat til det nederste kammer for at generere en chemotractant. Fireogtyve timer efter cellepodning, blev inserterne aftørres med en vatpind til at fjerne Matrigel og farvet med krystalviolet (0,1%). Invaderende celler på undersiden af ​​filteret blev scoret fra otte tilfældige felter.

Cell Cycle Analysis

Celler blev fikseret i 70% ethanol ved 4 ° C natten over og derefter behandlet med propidiumiodid ( PI, 50 ug /ml) og RNase A (1 ug /ml) i 30 min. Prøverne blev analyseret ved flowcytometri (FACScalibur, BD Biosciences). Den sub-G1 befolkning blev scoret hypodiploid DNA-indhold [24], [27]. Data blev analyseret ved hjælp WinMDI 2.8 software (Purdue University cytometri Laboratory).

Caspase Aktivering

Cellerne blev homogeniseret i en lysisbuffer (BioVision, Mountain View, CA), og hele cellelysater (40 ug) blev inkuberet med 20 pM af fluorogent substrat LEHD-AFC eller DEVD-AFC i en reaktionsbuffer (BioVision) indeholdende 5 mM DTT ved 37 ° C i 1 time. Proteolytisk frigivelse af AFC blev overvåget ved X ex = 405 nm og Aem = 500 nm under anvendelse af en fluorescensmikropladelæser (BMG LABTECH, Cary, NC). Aktivitet udtrykkes som “fold forøgelse”, og beregnes som forholdet mellem fluorescens-signalet i behandlede prøver med ubehandlede kontrolceller.

Western Blot

Hele cellelysater af celler eller tumorvæv blev foretaget og Western-blot eksperimenter blev udført som vi beskrev tidligere [26]. Antistoffer mod poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) (F-2), Mcl-1 (S-19), Bcl-2 (C-2), ubiquitin (P4D1), caspase-3 (H-277), kBa (C-15), RelA (F-6), tubulin (4G1) og GAPDH (L-20) blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Noxa antistof blev indkøbt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ). Anti-β-actin (AC-74) antistof blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). Band densitet blev kvantificeret ved TotalLab software (Durham, NC).

Subcellulær Fraktionering

Cytosolisk og nukleare fraktioner blev fremstillet som tidligere beskrevet [24], [25]. Kort fortalt blev cytosolisk ekstrakt opnået ved homogenisering celler i en hypotonisk puffer [10 mM HEPES, 5 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2 og 1 mM dithiothreitol (DTT) med proteasehæmmer cocktail], efterfulgt af tilsætning af Igepal CA- 630 (0,5%). Pelleterne blev opløst i en hypertonisk puffer (20 mM HEPES, 50 mM KCI, 300 mM NaCI, 1 mM PMSF, 1 mM DTT og proteaseinhibitorer) til opnåelse kerneekstrakter. Subcellulære proteiner blev kvantificeret ved Bradford-assay før Western blot.

kvantitativ real-time PCR (qPCR)

qPCR blev udført for at bestemme NF-KB målgenekspression [28]. Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. cDNA blev opnået ved revers transkription med 1 ug totalt RNA ved anvendelse af en TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). SYBR Green blev anvendt til kvantitativ PCR. Sekvenser af gen-primere er anført i tabel S1. Reaktioner med TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems) blev udført på Mastercycler

realplex

2 S-system (Eppendorf, Westbury, NY). mRNA-niveauer af målgener blev normaliseret til GAPDH ved hjælp af formlen: [2∧- (C

T target-C

T Actin)] x 100%, hvor C

T er tærsklen cyklus [27] . mRNA-ekspression udtrykkes som “fold forøgelse” og blev beregnet ved at dividere den normaliserede målgenekspression af den behandlede prøve med ubehandlede kontrolceller.

Animal Study

Athymiske nu /nu mus (5 uger) blev inokuleret subkutant (sc) med PC-3-celler (3 x 10

6) på begge sider af den nedre ryg. Når tumorerne voksede til 100 mm

3, blev musene randomiseret og behandlet dagligt via oral sonde (p.o.) med vehikelkontrol [12] eller celastrol i en dosis på 1 mg /kg med 5 dage om ugen i 3 uger. Tumorstørrelse blev målt på den sidste dosering af celastrol (dag 18). Tumor volumen blev beregnet som (længde × bredde

2) /2. Tumorprøver blev fikseret i 4% paraformaldehyd og indlejret i paraffin. Immunhistokemisk analyse blev udført ved Ki67, terminal deoxynucleotidyltransferase biotin-dUTP nick endemærkning (TUNEL), og CD31-farvning til påvisning af proliferation, apoptose og angiogenese, henholdsvis som vi tidligere beskrevet [22], [23], [26] . Alle eksperimenter dyr blev udført i henhold til protokoller, der er godkendt af University of Michigan Retningslinjer for brug og pasning af dyr.

Statistisk analyse

To-tailed Students

t

-test WAS ansat til at analysere både

in vitro

og

in vivo

data. Alle analyser blev udført ved GraphPad Prism 5.0. En tærskelværdi på

P

. 0,05 blev defineret som statistisk signifikant

Resultater

Celastrol Forhindrer prostatakræft Cell Proliferation

Celastrol er blevet rapporteret at vise anti-tumor-aktivitet i humane prostatacancerceller [12]. I vores undersøgelse, bekræftede vi, at celastrol reduceret cellelevedygtighed i både androgen-afhængige (LNCaP) og androgen-uafhængige (PC-3, DU145, CL1) prostatacancerceller, med en IC

50 af cytotoksicitet mindre end 2 pM ( fig. 1A). For PC-3-celler, celastrol inhiberede proliferation dosisafhængigt (fig. 1B), med 65% vækstinhibering på IC

50 dosis (~ 1 uM) på dag 3. På 2 uM, celastrol fuldstændigt inhiberede cellevækst i cellelinierne testet. Disse data viser, at celastrol aftager konsistent AIPC celleproliferation og levedygtighed ved koncentrationerne 2 uM

(A): celler blev behandlet med forskellige doser af celastrol og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet.. IC

50 blev vist som beregnet af Prism 5.0. Data er gennemsnit ± SD (n = 3). (B): PC-3-celler blev behandlet med forskellige doser af celastrol (Cel). Vedhæftede celler blev høstet og talt hver dag i 4 dage. De viste data er gennemsnit ± SD (n = 6).

Celastrol blænder Migration og Invasion

Som en højere koncentration af celastrol var cytotoksisk (fig. 1), vi evalueret effekten af celastrol på celle migration og invasion ved hjælp af ikke-toksiske doser ( 1 uM). Celastrol inhiberede PC-3 cell migration i både en dosis- og tidsafhængig måde (fig. 2A). Med koncentrationer (0,5 uM), der minimalt påvirket proliferation, celastrol forhindrede celle motilitet 24 timer efter behandlingen (

P

0,001, figur 2B.). Desuden blev DU145 celleinvasion hæmmet til 70% i en uM celastrol (

P

. 0,001, figur 2C og D). Disse data antyder, at celastrol undertrykker AIPC cellemigration og invasion ved subcytotoxic koncentrationer

(A):. PC-3 monolag celler blev ridset og behandlet med celastrol 0.5 og 1 uM. “Sårheling” blev testet ved 6 timer, 24 timer og 48 timer efter bunden. Original forstørrelse, × 100. (B): kvantificering af cellemigrering i A fra 4 tilfældige felter i dobbelte prøver.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD (n = 8). ***,

P

0,001. (C): DU145 celler behandlet med eller uden 1 pM af celastrol blev podet i Matrigelcoatede transwell inserts (2 × 10

4 /insert) i 24 timer. Celler på undersiden af ​​filteret blev farvet. Original forstørrelse, × 200. (D): invaderende celler i (C) blev bedømt fra 8 tilfældige felter.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD (n = 8). ***,

P

. 0,001

Celastrol fremkalder apoptose og modulerer Mcl-1

Vi næste undersøgt, om apoptose er involveret i celastrol cytotoksicitet . Celastrol faktisk induceret kromatin kondensering og DNA-fragmentering i AIPC celler. PC-3 behandlet med 2 uM celastrol i 24 timer frembragte en 8 gange stigning i sub-G

1 population (fig. 3A). Desuden celastrol induceret G

2 /M anholdelse (fig. 3A), der var i overensstemmelse med en tidligere rapport [29], hvilket yderligere demonstrerer celastrol effekt på cellecyklus arrest. Celastrol også dramatisk forøget enzymatisk aktivitet af både caspase-9 og caspase-3 i DU145, med den stærkeste aktivering (2,9 ± 0,4 gange for caspase-9 og 22,3 ± 3,5 gange for caspase-3, henholdsvis

P

. 0,001) ved 8 timer efter behandling (fig 3B), hvilket indikerer amplifikationen af ​​caspasekaskaden i den indre apoptotiske vej. Celastrol induceret PARP spaltning, der kunne vendes ved den pan-caspaseinhibitoren zVAD, hvilket viser apoptose er caspase-afhængig (fig. 3C). Interessant celastrol blev vist til samtidig akkumulere og spalte anti-apoptotiske protein Mcl-1 på et tidligt (4 timer) i stedet for et sent tidspunkt (24 timer) i PC-3 (fig. 3C). Denne observation var i overensstemmelse med ekspression af intracellulære ubiquitin (fig. 3C), hvilket tyder på en hurtig og kompleks regulering af Mcl-1 af proteasomet-inhibitor. I DU145, blev et lignende fænomen observeret. MCL-1 spaltning, der fandt sted i den tidlige fase (4-8 h) (fig. 3D) blev korreleret med caspase aktivering (fig. 3B). Endvidere induktion af spaltet Mcl-1 blev vendt ved zVAD (fig. 3C), hvilket indikerer, at en sådan spaltning medieres af caspaser. I modsætning hertil blev der lille ændring observeret for Bcl-2 (fig. 3C), Bcl-XL eller XIAP (data ikke vist), hvilket antyder, at blandt de anti-apoptotiske Bcl-2-familieproteiner, Mcl-1 synes at være et vigtigt mål af celastrol i de testede cellelinier

(A):. PC-3-celler blev behandlet med celastrol i 24 timer og cellecyklus blev testet. Cellepopulation i hver celle cyklus fase blev numerisk afbildet. Data repræsenterer en af ​​tre uafhængige forsøg. (B): DU145-celler blev behandlet med celastrol (2 uM) for ønskede tidspunkter. Enzymatiske aktivitet af caspase-9 og caspase-3 blev bestemt fluorometrisk.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD (n = 3). (C): PC-3-celler blev behandlet med celastrol med eller uden 1 time forbehandling af pan-capsase zVAD (2 uM) til Western blot analyse. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Celledød blev påvist ved trypanblåteksklusion. (D): DU145-celler blev behandlet med celastrol (2 uM) til Western blot. Actin er en belastning kontrol.

Celastrol fremkalder apoptose ved Aktivering Noxa

Det er påvist, at Noxa, et BH3 kun pro-apoptotisk protein, kan betydeligt fremkaldt af bortezomib [ ,,,0],30]. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi, om Noxa også kan aktiveres af celastrol. Faktisk celastrol induceret Noxa udtryk, der var i overensstemmelse med caspase-3-aktivering, PARP-spaltning og ubiquitin akkumulering dosisafhængigt i CL1 celler (Fig. 4A) og PC-3-celler (fig. 4B). Endvidere Noxa induktion forekom så tidligt som 2 timer efter behandling, langt hurtigere end caspase-3-aktivering og PARP-spaltning i CL1 (fig. 4C). Tilsammen antyder disse data at Noxa kraftigt og hurtigt aktiveres ved celastrol, som kan være ansvarlig for den pro-apoptotiske virkning i AIPC celler

(A):. CL1 celler blev behandlet med celastrol i 16 timer. (B): PC-3-celler blev behandlet med celastrol (2 uM) for angivne tidspunkter. (C): CL1-celler blev behandlet med celastrol (2 uM) i 16 timer. Hele cellelysater blev analyseret ved Western blot med Actin som en loading kontrol.

Celastrol Undertrykker Konstitutiv NF-KB Aktivitet

Det er velkendt, at proteasominhibitorer, herunder celastrol, kan blokere NF-KB-aktivitet i forskellige humane cancere [15]. I vores undersøgelse testede vi, om et tilsvarende resultat kunne opnås i AIPC celler. I PC-3 celler, celastrol blokeret cytosolisk kBa nedbrydning, samt nukleare translokation af NF-KB protein RelA /p65, viser virkninger, der oversteg MG132, en udbredt proteasominhibitor, der er vist sig at blokere NF-KB signalering [31] ( fig. 5A). Tilsvarende celastrol dosisafhængigt forårsaget subcellulær omfordeling af NF-KB i DU145-celler (fig. 5B). Desuden, ligesom MG132, celastrol inhiberede ekspression af forskellige NF-KB målgener der er involveret i flere trin på tumorudvikling, herunder proliferation (CXCL1, c-myc og cyclin-D1), adhæsion (ICAM-1), migration ( CXCL1), invasion (MMP-9), og anti-apoptose (BIRC2 /4/5, Bcl-2 og Bcl-xL) (tabel. 1). Den inhiberende virkning af NF-KB ved celastrol blev yderligere bekræftet af luciferase reporter assay (data ikke vist). Disse data viser, at celastrol kan undertrykke AIPC progression ved at hindre konstitutiv NF-KB-aktivitet

(A):. PC-3-celler blev behandlet med celastrol (2 uM) eller MG132 (10 uM) i 30 min. (B): DU145-celler blev behandlet med celastrol (1 og 2 uM) i 30 min. For både (A) og (B), blev celler behandlet til subcellulær fraktionering. Cytosolisk ekstrakt (CE) blev undersøgt for kBa og nuklear ekstrakt (NE) blev undersøgt for RelA. Tubulin og PARP anvendes som markør og lastning kontrol for CE og NE henholdsvis.

Anti-tumor Effekt af Celastrol Involverer NF-KB Dæmpning i PC-3 Xenografter

for at bestemme om NF-KB-undertrykkelse vil bidrage til tumorregression

in vivo

, vi evaluerede celastrol effektivitet i den etablerede PC-3 xenotransplanteret model som beskrevet tidligere [26]. Behandling af celastrol (1 mg /kg) i 3 uger inhiberede PC-3 tumorvækst (

P

0,05) (. Figur 6A), med en minimal systemisk toksicitet [26]. Histologisk analyse viste, at celastrol reduceret Ki67-positive celler og CD31-positive mikrokar og forøget TUNEL-positive celler (fig. 6B), hvilket antyder, at celastrol nedsætter proliferation og angiogenese, og inducerer apoptose i tumorvæv. Endvidere blev samlet kBa vist at have akkumuleret efter behandling (fig. 6C). Også ekspressionen af ​​NF-KB target gener, der er involveret i proliferation (CXCL1), angiogenese (IL-8) og anti-apoptose (BIRC2 og BIRC3) blev hæmmet af celastrol i tumorer (

P

0,01 for CXCL1 og BIRC2;

P

. 0,001 for andre gener) (fig 6D). Disse data indikerer, at dæmpning af NF-KB korrelerer med PC-3 tumorregression ved celastrol

in vivo

(A):. Tumorvolumen blev målt efter celastrol behandling. Antallet af mus i hver gruppe blev vist. *,

P

0,05. (B): tumor snit blev behandlet af anti-Ki67, TUNEL og anti-muse CD31-farvning. Original forstørrelse, × 400. (C): helcellelysater (50 ug) af tumorvæv blev undersøgt med anti-kBa antistof. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Expression fold var forholdet mellem kBa udtryk i celastrol gruppe kontrol køretøj. (D): qPCR analyse af NF-KB målgen-ekspression i tumorer. Total RNA fra tumorvæv blev ekstraheret til revers transkription. Gene primere blev blandet med cDNA og SyberGreen for qPCR.

Kolonner

, middelværdi;

barer

, SD (n = 3). **,

P

0,01; ***,

P

. 0,001

Diskussion

I denne undersøgelse har vi fundet, at celastrol, en naturlig proteasominhibitor, undertrykker AIPC progression af modulerende to veje. Først celastrol inducerer caspase-afhængig apoptose ved at regulere anti-apoptotisk protein Mcl-1 og aktivering pro-apoptotisk protein Noxa. For det andet, ved at forhindre kBa nedbrydning, celastrol svækker konstitutiv NF-KB-aktivitet og ophæver således den inhiberende virkning af NF-KB på apoptose samt fremme af proliferation, angiogenese, migration og invasion (fig. 7). Samlet set har disse data belyse den potentielle behandlingseffekt og mekanisme af celastrol i behandling AIPC via målrette proteasom.

Celastrol blokke proteasomfunktionen, hvilket resulterer i Mcl-1 omsætning og noxa induktion, der udløser apoptose. Samtidig celastrol forhindrer kBa nedbrydning, hvilket fører til NF-KB-undertrykkelse. Samlet set celastrol forstyrrer AIPC celleproliferation, migration, invasion og angiogenese, og inducerer apoptose ved hæmmet betydeligt konstitutive NF-KB-aktivitet.

Det er påvist, at dysreguleret proteasomfunktionen er korreleret med tumor progression og terapi resistens i humane cancere [32]. Hyperaktivering af NF-KB korrelerer med fænotypen af ​​androgen uafhængighed og terapi resistens i AIPC [7], [33]. I PC-3-celler, høj konstitutiv NF-KB-aktivitet er, i det mindste delvis, resultatet af et højt proteasomaktivitet [34]. I den aktuelle undersøgelse rapporterer vi at celastrol ikke kun inhiberer kraftigt PC-3 vækst, migration, invasion, og angiogenese, men også inducerer apoptose, der er forbundet med NF-KB dæmpning både

in vitro

in vivo

. Dette fund tyder på, at i AIPC, undertrykke NF-KB ved at målrette proteasomet gælder i forstyrre tumor progression, herunder primære vækst og metastase. Selvom der er behov for flere beviser for at afgrænse rolle NF-KB i celastrol-medieret tumorregression, vores aktuelle undersøgelse viser, at celastrol hæmmer flere NF-KB-drevet genekspression, der er involveret i AIPC vækst og metastase. Vores resultater, i overensstemmelse med andre [35], [36], viser, at NF-KB er en central formidler af AIPC progression, og celastrol, der fungerer som en aktiv naturlig proteasominhibitor, kan væsentligt forringe AIPC progression.

MCL-1 er et anti-apoptotisk protein i Bcl-2-familien, der hurtigt nedbrydes af proteasomet, og derfor har en kort halveringstid ( 3 h) [37]. Et stigende antal undersøgelser foreslår, at proteasominhibitorer er i stand til at vende Mcl-1 funktion via spaltning sin oprindelige molekyle ved caspaser at generere en kort formular (26~28 kDa), som er pro-apoptotiske uanset den direkte stabilisering af den fulde længde af MCL-1 [38], [39]. En sådan hurtig omsætning af Mcl-1 fremhæver den hurtige reaktion fra kræftceller, når de støder på proteasom stress, skifte fænotype fra celle overlevelse til programmeret celledød. I overensstemmelse med bortezomib [38], [40], finder vi, at i AIPC, celastrol også signifikant regulerer Mcl-1 på et tidligt stadium ved paradoksalt akkumulere det anti-apoptotiske oprindelige form, samtidig med generering af pro-apoptotiske spaltet formular. Som celler undergår apoptose i sidste ende, er det rimeligt at postulere, at spaltede Mcl-1 kan være vigtigere at kontrollere cellulære adfærd end tidligere rapporteret [41]. Dette skyldes, Mcl-1 spaltningen finder sted sammen med caspaseaktivering og før PARP-spaltning, mens forøget intakt Mcl-1 er kun en forbigående hændelse som reaktion på proteasomhæmning. Induktion af spaltet Mcl-1 kan delvis svækket ved caspaseinhibitoren, hvilket antyder, at en sådan induktion er caspase-afhængig. Interessant, fald spaltede Mcl-1-niveauer på et senere tidspunkt, hvilket er i overensstemmelse med intakt Mcl-1. Dette antyder, at selv efter spaltning med caspaser, er MCL-1 fragment stadig reguleres af proteasomer. Tilsammen disse observationer tyder på, at i AIPC celler, Mcl-1 er et centralt mål for celastrol der udviser en kompleks reaktion fra proteasomhæmning.

Meget gerne Mcl-1, Noxa er en anden Bcl-2 familie protein, er stærkt forøget med proteasomhæmning i forskellige kræftformer, herunder melanom [30], [42] og myelomatose [39], [43]. Men i modsætning Mcl-1, Noxa er ikke en direkte substrat af proteasom [44]. I stedet er Noxa mRNA transkriptionelt forstærket af en proteasominhibitor [44], [45]. Noxa er en BH3 kun pro-apoptotisk protein fungerer i mitokondrie apoptose [4], [22]. Ved stress, kan Noxa aktiveres i en p53-afhængig måde og interagerer med anti-apoptotiske proteiner, således afskaffe deres negative virkning på apoptose [46]. Vores resultater antyder, at Noxa ekspression forekommer selv før aktivering af initiatoren caspase-9, hvilket indikerer, at det er en tidlig mediator af celastrol-induceret apoptose. Interessant nok ingen af ​​de tre AIPC cellelinier har funktionelt p53 (PC-3 og CL1: p53 null; DU145: p53 mutant). den Noxa induktion ved celastrol er således p53-uafhængig. Hvordan Noxa er positivt reguleres på en p53-deficient scenario er uklar. Ikke desto mindre, da Noxa induktion korrelerer med Mcl-1 akkumulation, og siden MCL-1 /Noxa komplekset rapporteret at være øget med bortezomib [39], aktuelle data tyder på, at den potentielle funktion af den inducerede Noxa kan interagere med akkumuleret Mcl- 1 og neutraliserende sin anti-apoptotisk virkning. Tilsammen udgør disse data viser, at både MCL-1 og Noxa udviser hurtige og mangefacetterede omsætning begivenheder upon proteasomhæmning og celastrol koordinering af disse to Bcl-2 familiemedlemmer vil føre til apoptose gennem indledningen af ​​caspasekaskaden i AIPC.

sammenfattende vores data skitsere potente antitumorvirkninger af den traditionelle naturlige proteasominhibitor celastrol på androgen-uafhængig prostatacancer. Den dobbelte rolle celastrol, modulerende både apoptotiske proteiner og NF-KB, garanterer sine overvejelser som en potentiel terapeutisk kandidat i behandling hormon-refraktær prostatacancer patienter med konstitutivt aktiv NF-KB.

Støtte oplysninger

supplerende tabel S1 ..

Primere for real-time PCR (human)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0014153.s001

(0,01 MB PDF)

Tak

Vi vil gerne takke Susan Harris efter hjælp til manuskriptet; Dr. Arie Belldegrun ved University of California – Los Angeles for venligt at give CL1 cellelinje; University of Michigan Comprehensive Cancer Center (UMCCC) Histologi Core efter hjælp til immunhistologi undersøgelsen; UMCCC Enhed for Laboratory Animal Medicine (Ulam) som hjælp til dyreforsøg, og UMCCC flowcytometri Core for flowcytometri analyse.