PLoS ONE: Identifikation af replikationskompetent murine Gammaretroviruses i Almindeligt anvendte prostatakræft Cell Lines

Abstrakt

En nyopdaget gammaretrovirus, betegnes XMRV, blev for nylig rapporteret at være til stede i prostata cancer cellelinje CWR22Rv1. Ved hjælp af en kombination af begge immunhistokemi med bredt reaktive murin leukæmivirus (MLV) anti-sera og PCR, bestemmes vi hvis yderligere prostatacancer eller andre cellelinjer indeholder XMRV eller MLV-relaterede virus. Vores undersøgelse omfattede i alt 72 cellelinjer, som omfattede 58 af de 60 humane cancer cellelinjer, der anvendes i anticancer narkotika skærme og vedligeholdes på NCI-Frederick (NCI-60). Vi har identificeret gammaretroviruses i yderligere to prostatakræft-cellelinier: LAPC4 og VCAP, og viser, at disse vira er replikationskompetente. Virale genom sekventering identificerede virus i LAPC4 og VCAP så næsten identisk med en anden kendt xenotropisk MLV,

BXV

-1. Vi identificerede også et gammaretrovirus i ikke-småcellet lungekræft cellelinien EKVX. Prostatakræft cellelinjer synes at have en tilbøjelighed til infektion med murine gammaretroviruses, og vi foreslår, at dette kan være delvis skyldes cellelinje driftssted xenograft passage i immunsvækkede mus. Det er uklart, om infektion med disse vira er nødvendig for cellelinje etablering, eller hvad confounding rolle, de kan spille i forsøg udført med disse almindeligt anvendte linjer. Vigtigere er det, vores resultater tyder et behov for regelmæssig screening for kræft cellelinier for retroviral “forurening”, meget gerne rutinemæssige mycoplasma test

Henvisning:. Sfanos KS, Aloia AL, Hicks JL, Esopi DM, Steranka JP, Shao W, et al. (2011) Identifikation af replikationskompetent murine Gammaretroviruses i ofte anvendte Prostata Cancer cellelinier. PLoS ONE 6 (6): e20874. doi: 10,1371 /journal.pone.0020874

Redaktør: Jean-Pierre Vartanian, Institut Pasteur, Frankrig

Modtaget: 24. februar, 2011; Accepteret: 11 maj 2011; Udgivet: Juni 17, 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. K.S.S. blev understøttet af en postdoc stipendium pris fra Prevent Cancer Foundation. Denne forskning blev delvist understøttet af den Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research. IHC undersøgelser blev støttet af NCI-SPORE i prostatakræft P50CA58236. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

xenotropisk murine leukæmi virus-relaterede virus (XMRV) blev først rapporteret i 2006 som en ny gammaretrovirus findes i prostata væv fra prostata cancer patienter [1]. Efterfølgende undersøgelser har undladt at nå til enighed om forekomsten af ​​virus i prostatakræft, med rapporterede tal fra 0% til ca. 27% (revideret i [2], [3]). I 2009 blev det rapporteret, at den almindeligt anvendte prostatakræft cellelinje CWR22Rv1 indeholder replikationskompetent XMRV, og producerer virus på højt niveau i kultur [4].

Det er ikke på nuværende tidspunkt kendes præcist, hvordan den CWR22Rv1 cellelinje blev smittet med XMRV. En forklaring er, at virus var i prostata tumor, hvorfra cellelinjen blev etableret. Hvis bevist, vil denne opdagelse støtter det argument, at XMRV er til stede i mennesker, og kan etablere en infektion i den menneskelige prostata. En anden forklaring kunne være, at cellelinien var inficeret efter at cellerne blev fjernet fra patienten, for eksempel under xenotransplantation i immunsvækkede mus (et almindeligt anvendt og ofte nødvendigt praksis for oprettelsen af ​​prostatacancer-cellelinier). Nyere data præsenteret af Pathak

et. al. dele på den 17

th Konference om Retrovira og opportunistiske infektioner (CROI-konferencen) give en overbevisende argument, at XMRV sandsynligvis stammede fra rekombination mellem to separate og defekte endogene MLV’er der smittede de CWR22 humane cancerceller på et tidspunkt i løbet af proces med seriel passage af cellerne ved xenograft (se [5] for anmeldelse). Denne xenograft blev senere brugt til at producere en cellelinje, CWR22Rv1, som dyrkes i mange laboratorier i hele verden, der studerer prostatakræft. Rapporter om infektion af humane cellelinjer med dyr retrovirus er ret almindelige i litteraturen [6], [7], [8], (revideret i [9]), og det er veldokumenteret at forekomme efter xenotransplantation af celler og væv i immunsvækkede mus (revideret i [10]). Der er også rapporter om retroviral infektion af cellelinier, som klart sket under passage i kultur, som linjerne aldrig blev passeret i mus [9], [11]. Yderligere potentielle kilder til cellelinie infektion med retrovirus indbefatte laboratorieundersøgelser kontaminering og anvendelsen af ​​retrovirale vektorer i forskning [9]. Vigtigere er det, er der kun få eksempler, hvor retroviral tilstedeværelse i dyrkede humane celler kan spores tilbage til en sand infektion af patienten. Et veletableret eksempel på dette er opdagelsen af ​​den humane T-lymfotropisk virus type 1 (HTLV-1) i dyrkede celler fra patienter med T-celle lymfomer [12].

Opdagelsen af ​​XMRV i CWR22Rv1 cellelinje fik os til at afhøre yderligere prostatakræft-cellelinier for tilstedeværelsen af ​​XMRV eller andre murine gammaretroviruses. Hvis kilden til retrovirusinfektion ikke er fra prostatacancer patient, men indført ved passage gennem dyr eller laboratoriekontaminering derefter tilstedeværelsen af ​​replikationskompetente retrovira i almindeligt anvendte prostatakræft-cellelinier til forskning kunne potentielt have forstyrrende virkninger på eksperimentelle resultater.

Materialer og metoder

cellelinier

Kilde til cellelinjer og beskrivelse af cellelinje væv microarray (TMA) konstruktion er tilvejebragt i Tekst S1. Alle de anvendte cellelinier blev bekræftet via kort tandem repeat (STR) profilering af 9 genomisk loci med Powerplex 1.2-systemet (Promega) før optagelse i TMA.

XMRV /MLV Immunhistokemi (IHC)

Slides indeholdende sektioner af formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) kontrolceller eller TMAs blev afparaffiniseret og dampet i 25 min. i citrat-baserede demaskerende løsning for antigen-genvinding (Vector Laboratories). IHC (herunder positive og negative kontroller) med enten anti-p30 (MLV30) eller anti-gp70 (MLV70) antisera blev udført som tidligere beskrevet [3].

XMRV og MLV PCR

Genomisk DNA (gDNA) blev ekstraheret fra dyrkede cellepellets fra hver af de anvendte cellelinier i TMA hjælp af DNeasy blod og væv Kit (Qiagen). Alle DNA blev først amplificeret med genomiske GAPDH PCR-primere (GAPgen-F 5′-GGGCTCTCCAGAACATCATCC-3 ‘og GAPgen-R 5′-GTCCACCACTGACACGTTGG-3′) at kontrollere kvaliteten af ​​DNA-templaten. MLV-specifik primer (In-For) samt XMRV-specifikke reverse primer (Deletion-Rev) var som tidligere beskrevet [13] med en forventet produktstørrelse på 104 bp. Det degenererede Pan-MLV primersekvenser var som følger: Pan-MLV-F 5’-GCARCCCWGGGAGACGTC-3 ‘og Pan-MLV-R 5′-AGACRCGCRGCGCGGYT-3’ med et forventet produkt størrelse på ca. 206 bp (181 bp for XMRV ). PCR blev udført i et samlet volumen på 25 pi (indeholdende 1X PCR buffer, 1,5 mM MgCl

2, 200 uM dNTP’er, 400 nM F- og R primer, 1U AmpliTaq Gold, Applied Biosystems) under anvendelse af ca. 100 ng gDNA for skabelon og følgende cyklusparametre: 95 ° C i 2 min .; 40 cykler ved 95 ° C i 30 sek., 54 ° C i 1 min. (Pan-MLV primere) eller 64 ° C i 30 sek. (XMRV-specifikke primere), 72 ° C i 30 sek .; endelig ekstension ved 72 ° C i 7 min. Seriefortynding test af CWR22Rv1 gDNA indikerede, at den degenererede Pan-MLV PCR analyse havde en følsomhed til at detektere virus i ned til 0,1 ng CWR22Rv1 gDNA (svarende til ~100-200 virale genomer eller ~10-20 inficerede celler [3], [ ,,,0],4]) og XMRV-specifikke PCR-assay var i stand til at detektere ned til 1-2 virale genomer (Figur S1). Forskellen i følsomhed kan sandsynligvis forklares delvist af brugen af ​​degenererede primere for Pan-MLV PCR.

Langtrækkende PCR og sekventering af virusgenomer

fuld længde eller i nærheden fuldtids- længde virale genomer blev amplificeret fra genomiske DNA præparater af LAPC4, VCAP og EKVX cellelinjer og sekventeret som beskrevet i tekst S1 og tabel S2.

fylogenetisk analyse

Fuld længde genomer fra kendte endogene MLV-sekvenser [14] og virus genomer isoleret fra LAPC4, VCAP og EKVX blev justeret ved hjælp ClustalW. Baseret på tilpasning, blev en nabo-sammenføjning træ genereret ved hjælp af indstillingerne for MEGA udgave 5 standardindstillinger (MEGA 5) [15].

Smitteevne Assay

cellelinie supernatanter blev opsamlet efter 24 timer . kultur og filtreres gennem et 0,45 um filter. Den infektivitet assay bruger iGLuc-DERSE celler, et 293 mCAT baseret cellelinie, der producerer den

Gaussia

Luciferase (gluc) enzym kun efter infektion med en replikationskompetent MLV. iGLuc-DERSE celler blev podet ved 3,5 x 10∧4 celler /brønd i en 12-brønds plade. Celler blev behandlet med 20 ug /ml DEAE-dextran i 30 min. DEAE-dextran blev derefter fjernet, og cellerne blev skyllet med mediet. Dernæst blev 500 pi af hver supernatant tilsat til iGLuc-DERSE celler i tre eksemplarer. Celler blev inkuberet i 3 timer. og 400 pi yderligere medium blev tilsat. To og tre dage efter infektion, blev 10 pi af mediet fra hver brønd undersøgt for luciferaseaktivitet. Ved 3 dage efter infektion blev cellerne passeret. To dage efter celle passage, blev luciferaseaktivitet målt igen. Celler blev passeret i i alt 13 dage. Yderligere oplysninger af cellen linje vil blive givet i en fremtidig publikation.

Vectorette PCR

Vectorette PCR blev udført som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt 2 ug genomisk DNA blev fordøjet natten over ved passende temperatur med følgende restriktionsenzymer:

Ase

jeg,

BspHI

jeg,

BstY

jeg,

Hind

III,

Nco

jeg, og

Pst

I. Vectorette oligoer blev derefter annealet natten over ved 4 ° C ved en koncentration på 1 uM anvendelse af T4 DNA ligase (New England Biolabs). Vectorette PCR blev udført under anvendelse af en virus-specifik fremadrettet primer (enten Virus-vec-F1 5′-GACTGAGTCGCCCGGGTACC-3 ‘, eller virus-vec-F2 5′-CGCTTCTCGCTTCTGTAACCGCG-3′, både i 3′-LTR i nukleotidposition 8525 og 8437 af Xmv43 henholdsvis) og en vectorette-specifik revers primer (5’-CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA-3 ‘). PCR-produkter blev geloprenset og klonet ind i pCR®2.1-TOPO-vektoren (Invitrogen). Transformerede bakteriekolonier blev udvalgt tilfældigt til sekventering.

Resultater

LAPC4 er VCAP og EKVX kræft cellelinjer inficeret med en museleukæmivirus som ikke XMRV

Som en indledende screening for murine gammaretroviruses i humane cellelinier, vi udnyttet et væv microarray (TMA) indeholdende i alt 72 cellelinier, som omfattede 58 af de 60 humane cancercellelinier anvendt i anticancerlægemiddel skærme og holdt ved NCI-Frederick (NCI -60) (tabel S1). Som vist i figur 1A, IHC med bredt reaktivt antisera for Moloney leukæmivirus (Mo-MLV) p30

CA (MLV30) eller gp70

SU (MLV70) [3] identificerede tre prostatacancercellelinjer (CWR22Rv1, LAPC4 [17], VCAP [18]) som positiv for virus. Mens CWR22Rv1 tidligere blev rapporteret at være inficeret med replikationskompetente XMRV [4], er LAPC4 og VCAP ikke kendt for at indeholde retrovirus. Interessant nok i en tidligere undersøgelse, cellekultur medier fra VCAP blev anekdotisk rapporteret at vise viral aktivitet [4]. Vi identificerede også en ikke-småcellet lungekræft cellelinien, EKVX, som værende positiv for virus.

(A) Eksempler på MLV-negative (DU145) og positive (CWR22Rv1, LAPC4, VCap og EKVX) cancer cellelinjer farvet med MLV30 og MLV70 antisera. (B) Positiv farvning i LAPC4, VCAP og EKVX repræsenterer ikke XMRV. Lanes 1-7, PCR med MLV-specifikke primere (1 = CWR22Rv1, 2 = LAPC4, 3 = VCAP, 4 = DU 145, 5 = LNCaP, 6 = PC3, 7 = EKVX), banerne 8-11, PCR med XMRV- specifikke primere (8 = CWR22Rv1, 9 = LAPC4, 10 = VCAP, 11 = EKVX). Forskel i produktet størrelse mellem CWR22Rv1 (bane 1) og LAPC4, VCap eller EKVX (bane 2,3,7) skyldes XMRV-specifikke 24-nt deletion [13]. L = molekylvægt stigen.

Vi næste brugt en PCR-baseret assay for at bestemme, om LAPC4, VCAP og EKVX er inficeret med XMRV. Som vist i figur 1B, PCR med degenererede pan-MLV-primere (designet til bredt at amplificere MLV art) identificeret en positiv produkt som forventet for CWR22Rv1, LAPC4, VCap og EKVX. Også som forventet baseret på IHC resultater, PCR med degenererede MLV primere var negativ for prostatakræft-cellelinier DU145, LNCaP og PC3. PCR med primere, der spænder en 24 nukleotid deletion indeholdt i genomet af XMRV, men ikke i andre kendte MLV’er [13] var kun positiv for CWR22Rv1 (figur 1B), hvilket indikerer, at virus (r) til stede i de resterende cellelinier, var positive ved IHC ikke XMRV. Samtlige resultater af IHC og PCR på de 72 cellelinier er vist i tabel S1. For at kontrollere for muligheden, at positive PCR-resultater kan have været på grund af muse DNA-kontaminering, testede vi alle positive cellelinier med et PCR-assay for muse intracisternal En partikel (IAP) som tidligere beskrevet [19]. Som vist i figur S2, blev ingen af ​​de cellelinjer sig at være positive for kontaminerende muse-DNA. IAP assay er tidligere vist sig at være meget følsomme for muse-DNA og til ud-udføre PCR-baserede assays for mus mitokondrie-DNA (mtDNA) [19].

virale genom sekventering fylogenetisk analyse og integrationsposition kortlægning

for at bestemme identiteten af ​​de vira, der er til stede i LAPC4, VCAP og EKVX, vi udførte langtrækkende PCR og sekventering som beskrevet i tekst S1. En 8.046 nukleotidsekvens (GenBank Accession # JF908817) opnået fra EKVX grupperet med en xenotropisk MLV gruppe i fylogenetisk analyse, men var ikke identisk med nogen MLV’er, for hvilke fuldlængde genomiske sekvens er kendt (figur 2, Støtte Figur S3). Denne sekvens blev også bestemt i NCBI BLAST databasesøgninger til at være 98% svarende til en retrovirus tidligere isoleret fra DG-75 B-lymfoblastoidcellelinje [20], og er identisk med delvis

pol

og

env

sekvenser isoleret fra EKVX i en anden nylig undersøgelse [8].

fylogenetisk træ repræsenterer kendt xenotrope MLV-sekvenser. Dette træ repræsenterer kun xenotrope MLV’er for hvilke den fulde provirale sekvens er kendt, hvilket sandsynligvis kun en lille del af alle endogene xenotrope MLV’er stede i mus.

For LAPC4 og VCAP, vectorette PCR blev udført for at bestemme virusintegration sites og 5′- og 3′-enderne af de virale genomer. Næsten identiske (99% lighed) virusgenomer 8.657 nukleotider lange (GenBank Accession # JF908815, JF908816) blev sekventeret fra LAPC4 og VCap cellelinier. NCBI BLAST og Ensembl databasesøgninger afslørede en næsten perfekt match (99%) til en sekvens indeholdt på kromosom 1 i C57BL /6J mus genomsekvens (nukleotidposition 172.871.652-172.880.308). Denne placering kort til en kendt murine xenotropisk gammaretroviral provirus betegnes

BXV

-1 (eller XMV43) [21]. Fylogenetisk analyse viste også, at de LAPC4 og VCap vira er phylogenetisk identiske med

BXV

-1 (Figur 2, Støtte Figur S3).

BXV

-1 er et intakt og infektiøs provirus og selvom almindeligt anvendte prostatacancercellelinjer ikke er kendt for at være kontamineret med denne virus,

BXV

-1 vides at være stand til at inficere tumorceller passeret gennem immunsvækkede mus [22]. Vi testede VCap cellelinien direkte fra ATCC og bekræftede, at det distribuerede VCap er positiv for virus. For at bekræfte, at infektionen af ​​LAPC4 celler repræsenterer en infektion, der var til stede i begyndelsen passage LAPC4 (i modsætning til forurening fra vores laboratorium), vi opnåede LAPC4 celler frosset ned i 1998, samt celler øjeblikket dyrket i laboratoriet (dvs. fra 2010 ) fra CL Sawyers laboratorium på Memorial Sloan Kettering Cancer center [17]. Som vist i figur S4, alle testede fra Sawyers lab LAPC4 celler var positive for virus.

For yderligere at kontrollere, at LAPC4 og VCAP cellelinjer er smittet med integreret

BXV

-1 provirus, vi kortlagt flere viral integration steder i hver af disse to linjer ved hjælp vectorette PCR [16]. Interessant nok blev virale integrationssteder identificeret i intron regioner af multiple gener i både LAPC4 og VCap (tabel 1). Ingen fælles integration sites blev identificeret mellem de to cellelinjer; dog forventer vi, at listen over integration lokaliteter angivet i tabel 1 er ikke udtømmende. Vælg integration sites blev yderligere bekræftet fra LAPC4 og VCAP hjælp langtrækkende PCR og primere der spændte over integration sites (tabel 1).

Inficerede cancer cellelinjer producerer replikationskompetent virus

for at verificere, at de almindeligt anvendte prostatakræft-cellelinier LAPC4 og VCAP indeholder integreret og replikationskompetent virus, vi udførte en viral infektivitet assay. Indikatoren cellelinie, iGLuc-DERSE celler, vil kun udskille

Gaussia

luciferaseenzym efter infektion med et replikationskompetent MLV.

Gaussia

luciferaseaktivitet blev påvist 48 timer efter infektion af iGLuc-DERSE celler med supernatanten fra CWR22Rv1, LAPC4 og VCap cellelinjer (figur 3). Interessant, har en tredobbelt infektion af iGLuc-DERSE celler med supernatant fra EKVX cellelinje viser ikke

Gaussia

luciferaseaktivitet indtil 13 dage (og 3 passager) efter infektion (figur 3). Endvidere kun 2 af de 3 infektioner viste luciferaseaktivitet over baggrund. Således virus fra EKVX celler har tilsyneladende meget lav infektivitet, i det mindste for iGLuc-DERSE cellelinie. Nej

Gaussia

luciferaseaktivitet blev detekteret fra celler (passeredes i i alt 13 dage) påvirkes supernatant fra DU145, MycCaP (en mus prostatacancer-cellelinie opnået fra CL Sawyers lab) eller PC3 cellelinier ( figur 3). CWR22Rv1 er tidligere rapporteret at producere replikationskompetent XMRV [4], men det er ikke blevet rapporteret, at LAPC4, VCap og EKVX producere replikationskompetent virus.

10 pi medium blev analyseret 2 dage efter udsættelse for 24 timer. cellekultursupernatant fra CWR22Rv1, LAPC4 og VCap, og 13 dage (og 3 passager) efter udsættelse for supernatant fra EKVX, DU145, MycCaP (murin prostatacancer-cellelinie) og PC3. Rød linje angiver baggrund luciferaseekspression som bestemt ved en mock-inficeret kontrol. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien for 3 eksperimenter.

Ud af bekymring for, at prostatakræft-cellelinier, der producerer replikationskompetente vira kunne krydse-forurene andre cellelinjer i vores laboratorium, som er negative for MLV’er, vi testet nuværende kulturer i vores laboratorium for tilstedeværelse af MLV’er. Vi blev overraskede over at finde to tilfælde, hvor MLV-negative cellelinjer opretholdt i laboratoriet (DU145, LNCaP) er blevet kontamineret med MLV’er (figur S5). For eksempel, når disse cellelinjer blev opnået direkte fra ATCC (LNCaP) eller NCI (DU145) de var negative for virus, hvilket indikerer, at linjerne var forurenet på et tidspunkt under dyrkning i laboratoriet. PCR-analyse med XMRV-specifikke primere indikerede, at kontaminerende virus sandsynligvis XMRV, potentielt fra kultur sammen CWR22Rv1 (data ikke vist). Disse resultater antyder, at hvis CWR22Rv1 celler rutinemæssigt dyrkes i en typisk biomedicinsk forskning laboratoriemiljø (f.eks ved anvendelse af standard klasse II biosikkerhed kabinetter og procedurer for cellekultur, hvor to forskellige cellelinier er aldrig til stede under hætten samtidig), at XMRV kan inficere og forurene andre cellelinjer.

diskussion

Vores undersøgelse viser, at prostatakræft-cellelinier synes at have en tilbøjelighed til infektion med murine gammaretroviruses. Vi foreslår, at denne tendens kan skyldes det faktum, at de fleste af de etablerede prostatacancer-cellelinier blev skabt ved passage gennem immunkompromitterede mus. Faktisk

BXV

-1 er til stede i SCID og

nøgne

mus og tumorceller passeret gennem disse dyr kan blive smittet med xenotrope MLV’er [22]. Skønt infektion af humane cellelinier med murine gammaretroviruses er tidligere blevet beskrevet i litteraturen, hvad der gør vores aktuelle undersøgelse særlig vigtigt, er, at forud for denne undersøgelse var det ikke kendt, at flere almindeligt anvendte prostatacancercellelinjer er forurenet med MLV’er. Faktisk opdagede vi i løbet af vores undersøgelse, at andre cellelinjer holdes i laboratoriet (DU145, LNCaP) har tilsyneladende blevet smittet med XMRV i laboratoriet.

I konkordans med oplysningerne i den aktuelle undersøgelse i en nylig undersøgelse fra Hue

et. al.

, som screenet 411 humane tumorcellelinier fra kataloget af somatiske mutationer i Cancer (COSMIC) indsamling, EKVX fandtes at være positive for en xenotropisk MLV-relaterede virus ved direkte sekventering af viral

gag

,

pol

og

env

gener [8]. Desuden Hue

et. al.

undersøgelse testet alle, men 14 af de undersøgte i den aktuelle undersøgelse cellelinier (med undtagelse af LAPC4, LNCaP, Prec, VCAP, CWR22Rv1, RWPE, abl, PRSC, C4-2B, 957 E /h, PacMet UT1, MDA-PAC2b, DLD-1 og Hep3B) og ligeledes fundet dem til at være negativ for MLV. Selvom forfatterne af undersøgelsen ikke forsøge på at skaffe en fuld-længde sekvens af virus forurener EKVX eller at vise, at virussen er replikationskompetent, delvis

pol

env

sekvenser fra Hue

et. al.

undersøgelse (GenBank Accession # FR670589 og FR670597, henholdsvis) match ved 100% lighed med den nærmeste fuldlængde virale sekvens opnået i den foreliggende undersøgelse (GenBank Accession # JF908817). Vi har nu vist, at virusset indeholdt i EKVX cellelinien er replikationskompetent (figur 3), klynger i fylogenetisk analyse med kendte xenotrope MLV’er (Figur 2, Støtte Figur S3) og er 99% identisk med et retrovirus tidligere var isoleret fra GD -75 B-lymfoblastoide cellelinie. Ligesom alle de prostatakræft-cellelinier sig at indeholde MLV’er i nærværende undersøgelse blev EKVX cellelinje oprettet ved xenograft passage i

nøgen

mus [23].

Der er flere rapporterede eksempler af retroviral infektion modificere de biologiske egenskaber af humane cellelinier. For eksempel

in vivo

immunogeniciteten af ​​cellelinier har vist sig at være stærkt ændret efter retroviral infektion efter en enkelt passage i

nøgne Salg mus [24]. Ligeledes xenotrope MLV’er erhvervet i cellelinjer, der anvendes i HIV-forskning efter

in vivo

passage i immunkompromitterede mus viste sig at ændre de biologiske egenskaber af HIV-1 [25]. Undersøgelser har også vist, at MLV tendens til at integrere nær transskription start-sites (inden for 5 kb opstrøms eller nedstrøms) af aktivt transskriberede gener [26]. Interessant, to af de syv virale integrationssteder identificeret for VCap er inden for 5 kb af en transkriptionsstartstedet (tabel 1). En integration sted lokaliseret på kromosom 1 er placeret ca. 2 kb nedstrøms for transkriptionsstartstedet af EFCAB2 (EF-hand calcium-bindende domæne 2) gen. Ligeledes er en integration sted identificeret på kromosom 7 ligger cirka 1,4 kb opstrøms for LFNG (O-fucosylpeptide 3-beta-N-acetylglucosaminyltransferase), et gen involveret i Notch signalering. Det vides ikke, hvad confounding effekter infektion af almindeligt anvendte prostata cancer cellelinjer med replikationskompetente murine gammaretroviruses kan have på eksperimentelle resultater. Interessant nok er det blevet rapporteret, at XMRV proteiner er mere rigelige i celledyrkningsmedier af CWR22Rv1 celler end noget humant protein [4]. Af grunde som denne, foreslår vi, at kræft cellelinjer bør gennemgå rutinemæssig screening for forurenende MLV’er, ligesom den nuværende praksis med rutinemæssig afprøvning af dyrkede celler til mycoplasma.

Støtte Information

Tekst S1.

Støtte metoder

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s001

(DOC)

figur S1.

Bestemmelse af følsomhed Pan-MLV og XMRV-specifikke PCR-analyser. Seriefortyndinger af CWR22Rv1 genomisk DNA blev tilsat til 100 ng af LNCaP (MLV-negativ) genomisk DNA og anvendt som template til PCR. (A) Pan-MLV-primere (B) XMRV-specifikke primere. Prøver blev testet in duplo: 1 ng CWR22Rv1 (bane 1-2), 0,1 ng CWR22Rv1 (bane 3-4), 0,01 ng CWR22Rv1 (bane 5-6), 0,001 ng CWR22Rv1 (bane 7-8), negativ kontrol (bane 9-10). . L = molekylvægt stigen

doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s002

(TIF)

Figur S2.

Test MLV-positive cellelinier for tilstedeværelsen af ​​kontaminerende muse DNA ved PCR assay for IAP. Bane 1 = C57BL /6J mus genomisk DNA (positiv kontrol), bane 2 = CWR22Rv1, bane 3 = LAPC4, bane 4 = VCap, bane 5 = EKVX, bane 6 = negativ kontrol. Alle testede cellelinier var negative for kontaminerende muse-DNA. . L = molekylvægt stigen

doi: 10,1371 /journal.pone.0020874.s003

(TIF)

Figur S3.

fylogenetisk analyse af virus genomer fra LAPC4, VCAP og EKVX cellelinjer. Det fylogenetiske træ repræsenterer kendte endogene MLV-sekvenser, herunder polytrope (PMV), modificeret polytrope (Mpmv) og xenotrope (Xm), vira. Dette træ repræsenterer kun endogene MLV’er, for hvilke den fulde provirale sekvens er kendt, hvilket sandsynligvis kun en lille del af alle endogene MLV’er stede i mus. Eksogene MLV’er (CAS-BR-E, AKV, MLMCG og Friend) er også inkluderet til sammenligning

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s004

(TIF)

Figur S4.

Test tidlig passage LAPC4 for tilstedeværelse af virus. Den pan-MLV primere, der er beskrevet i figur 1, blev brugt til at teste LAPC4 celler fra vores laboratorium (bane 1), tidlig passage LAPC4 frosset ned i 1998 fra C. Sawyers lab (bane 2), LAPC4 celler frosset ned i 2010 fra C . Sawyers lab (bane 3), og en mock DNA-ekstraktion negativ kontrol (bane 4). Alle LAPC4 analyserede celler var positive for virus

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s005

(TIF)

Figur S5. Salg Eksempler på MLV-negative prostatacancercellelinjer der er blevet kontamineret med MLV under seriel passage af cellekulturer i laboratoriet. Prostatakræft cellelinjer skabt direkte fra NCI (DU145) eller ATCC (LNCaP) er negativ, når farves med MLV30 og MLV70 antisera. Disse linjer blev uventet vist sig at være positiv for virus efter seriel passage i laboratoriet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s006

(TIF)

tabel S1.

Komplette resultater af IHC og PCR på 72 humane cellelinjer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s007

(DOC)

tabel S2.

Primere anvendt til at sekventere virale genomer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020874.s008

(DOC)

Tak

Vi takker Dr. John Isaacs ( Johns Hopkins) til at tilvejebringe flere cellelinier for cellelinien microarray. Vi vil også gerne anerkende og takke Dr. Charles Sawyers (MSKCC) for at give tidlig passage LAPC4 prøver og Dr. John M. Coffin (Tufts University) for at yde ekspertise og bistand med fylogenetiske analyser.