PLoS ONE: et nyt peptid Forbedrer terapeutiske effekt af Liposomale kræftlægemidler i musemodeller af menneskelig lungekræft

Abstrakte

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Manglen på tumor specificitet er fortsat en stor ulempe for effektive kemoterapier og resultater i dosisbegrænsende toksiciteter. Imidlertid bør en ligand-medieret lægemiddeladministrationssystem kunne gøre kemoterapi mere specifik for tumorceller og mindre toksiske for normale væv. I denne undersøgelse isolerede vi et nyt peptid-ligand fra en fag-display-peptid bibliotek, der er bundet til ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinier. Den målsøgende fag bundet til flere NSCLC cellelinier, men ikke for normale celler. Både målrettet fag og syntetisk peptid erkendte de kirurgiske eksemplarer af NSCLC med en positiv sats på 75% (27 af 36 prøver). I alvorlig kombineret immundefekt (SCID) mus med NSCLC xenografter, den målsøgende fag specifikt bundet til tumormasser. Tumor homing evne til målretning fag blev inhiberet af det beslægtede syntetiske peptid, men ikke af en kontrolgruppe eller en WTY-muteret peptid. Når det målrettende peptid blev koblet til liposomer der bærer doxorubicin eller vinorelbin, det terapeutiske indeks af de kemoterapeutiske midler og overlevelsesprocenten af ​​mus med human lungekræft xenotransplantater markant forøget. Endvidere målretning af liposomer øget akkumulering i tumorvæv med 5,7 gange sammenlignet med frie lægemidler og øget cancercelle apoptose som følge af en højere koncentration af biotilgængeligt doxorubicin. Den nuværende undersøgelse antyder, at dette tumorspecifik peptid kan anvendes til at skabe kemoterapier specifikt er rettet mod tumorceller til behandling af NSCLC og udforme målrettede genoverførselsvektorer eller den kan anvendes en i diagnosen af ​​denne malignitet.

Henvisning: Chang DK, Lin CT, Wu CH, Wu HC (2009) et nyt peptid Forbedrer terapeutiske effekt af Liposomale kræftlægemidler i mus modeller af menneskelig lungekræft. PLoS ONE 4 (1): E4171. doi: 10,1371 /journal.pone.0004171

Redaktør: Nils Cordes, Dresden Teknologiske Universitet, Tyskland

Modtaget: Juli 9, 2008; Accepteret: December 2, 2008; Udgivet: 12 januar 2009

Copyright: © 2009 Chang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Research Grants fra Academia Sinica (# 5202402020-0 til HCW) og National Science Council (NSC-96-2323-B-002-015 og NSC96-3114-P-001-006-Y02 til HCW).

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret maligniteter i de udviklede lande og er et voksende problem i at udvikle lande [1]. Der er to hovedtyper af lungekræft: ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) og småcellet lungecancer (SCLC). NSCLC udgør ca. 80% af alle tilfælde lungekræft [2], og har en begrænset svarprocent på nuværende kemoterapeutiske stoffer, med tumor krympning i kun 20% af patienterne og en to-års overlevelse mellem 10% og 16% [3] . En væsentlig grund til dette utilfredsstillende resultat af kemoterapi er kompromitteret lægemiddeltilførsel til lungekræft væv på grund af høje interstitielle væsketryk (IFP) inden for tumoren [4]. Systemisk administreret kemoterapi kan ikke i tilstrækkelig grad leveres i solide tumorer på grund af den umodne kar med unormal arkitektur [5] og utætte, heterogene karvæggene [6] samt den høje IFP inden tumorvæv [7], [8]. Desuden manglende tumor specificitet giver anti-cancer medicin til at distribuere i flæng til normale organer og væv. Således er cancerceller udsat for en lavere koncentration af lægemidlet end normale celler [9], hvilket resulterer i ikke kun faldet effektivitet, men også øget toksicitet. Derfor er det vigtigt at udvikle en strategi for at øge mængden af ​​narkotika leveret til tumorvæv på en målrettet måde, mens besparende normale væv.

Der arbejdes på at forbedre det terapeutiske indeks af anticancermidler, enten ved at øge lægemiddelkoncentration inde i tumoren eller ved at reducere det i normale værtsvæv [10]. Sammenlignet med konventionelt administrerede kemoterapeutiske midler, lipid- eller polymer-baserede nanomedicin lægemiddelafgivelsessystemer har den fordel at forbedre de farmakologiske og terapeutiske egenskaber af cytotoksiske lægemidler [11]. De fleste små molekyler kemoterapeutiske midler har et stort fordelingsvolumen på intravenøs administration [12] og et smalt terapeutisk vindue på grund af alvorlig toksicitet til normale væv. Ved indkapsling lægemidler i nanopartikler såsom liposomer, kan forskerne markant reducere fordelingsvolumen og forøge koncentrationen af ​​aktivt lægemiddel i tumoren [13]. Pegyleret liposomal doxorubicin (med mærkenavne af Doxil i USA og Caelyx i Europa) [14] er blevet vist signifikant at forbedre det terapeutiske indeks af doxorubicin både i prækliniske [15] – [17] og kliniske undersøgelser [18] – [21 ]. Adskillige drug delivery systemer af denne type er blevet godkendt til markedsføring [22], [23].

Andre end pegylerede liposomer, højere og mere selektiv anti-cancer aktivitet kan opnås gennem ligand-medieret målretning liposomer. I denne hidtil ukendte lægemiddelafgivelsessystem, der målretningsgrupper koblet til overfladen af ​​liposomer til at fremme selektiv binding til tumorspecifikke antigener og lette leveringen af ​​lægemiddelholdige liposomer til de tilsigtede cellulære steder. Dette system har fordelene ved en højere lægemiddel-til-bærer-forhold end immunkonjugater og den multivalente præsentation af ligander fører til forøget binding aviditet [24]. Forskere har allerede produceret liposomer konjugeret med forskellige peptid ligander, der specifikt retter sig mod bestemte tumorceller eller tumorvaskulatur [25] – [29].

På grund af den gunstige selektivitet og specificitet, ligand-konjugeret liposomal anticancer narkotika er en lovende tilgang til ny kemoterapi forskning. Anvendelsen af ​​peptider som ligander til direkte liposomer til tumorer repræsenterer en potentielt gennemførlig fremgangsmåde til forøgelse af specificitet og effektivitet liposomholdige lægemidler [26], [30]. Fag-display er en teknik til udvælgelse målretning peptider, hvori en peptid udtrykkes på overfladen af ​​en bakteriofag som en fusion-protein med en af ​​virionet egne kappeproteiner [31]. Fagpræsenterede peptidbiblioteker giver forskerne til kort protein-protein kontakter såsom B-celleepitoper [32] – [35] og receptor-ligand-interaktioner [36]. Sådanne peptidbiblioteker kan også anvendes til at identificere organisationer og celle-typespecifikke peptider [26], [27], [37] – [39].

I denne undersøgelse anvendte vi et fagpræsenterede peptidbibliotek at identificere et hidtil ukendt peptid, der bindes specifikt til NSCLC cellelinjer og kirurgiske prøver fra lungecancerpatienter. Liposomal doxorubicin og vinorelbin konjugeret med denne målretning peptid vist bedre ophobning af lægemidler i tumorvæv og forbedret terapeutisk indeks for humane lungecancer implanteret i SCID-mus.

Resultater

Isolering af fager binding til NSCLC celler

Vi anvendte en fagpræsenterede tilfældige peptidbibliotek at isolere fager, der var i stand til at binde til NSCLC CL1-5 celler. Efter fem runder af affinitetsselektion (biopanning) med CL1-5, celler steg titeren af ​​fagen med 40-fold (Fig. 1A). Berigede fager fra tredje til femte biopanning runder blev udvalgt tilfældigt. Vi derefter sekventeret de fagkloner med højere CL1-5-bindende aktiviteter. Brug af Genetics Computer Group (GCG) software analyse, fandt vi, at disse udvalgte fager (PC3-1, PC4-1, PC4-5, PC5-2 og PC5-4) vises konsensus motiv, tryptophan (W) -threonin ( T) /tyrosin (Y) -tyrosin (Y) (tabel 1). Interessant fag PC5-2 dukkede op i den tredje (PC3-1), fjerde (PC4-1) og femte (PC5-2) biopanning runder. I løbet af biopanning runder, hyppigheden af ​​PC5-2 steg fra 20% (1/5) i den tredje cyklus til 90% (27/30) i den femte cyklus (tabel 1). Vi valgte at fokusere på nyt peptid vises af PC5-2, TDSILRSYDWTY, til yderligere undersøgelse.

(

A

) En fag-viste tilfældige peptid biblioteket blev brugt til at vælge fager, der binder til den NSCLC cellelinien CL1-5. (

B

) Visualisering af PC5-2 binding til CL1-5 og PC13 lungekræft celler (pilespidser) med immunhistokemisk farvning. Styringen fag ikke binder til CL1-5 celler. Målestokken: 10 um. (

C

) FITC-mærket peptid SP5-2 bundet til fem NSCLC cellelinier, men ikke til NPC-TW01 celler som påvist ved immunfluorescensfarvning. Målestokken: 10 um. (

D

) blev påvist Repræsentative mikrofotografier af tumor sektioner fra kirurgiske prøver af human lungecancer ved hjælp af både PC5-2 (a, pilespids) og biotinyleret SP5-2 (c, pilespids), hhv. Til sammenligning kunne styringen fag eller biotinyleret kontrol peptid ikke binder til disse kirurgiske prøver (B og D). PC5-2 blev kompetitivt inhiberet af det syntetiske peptid SP5-2 (e). Muteret peptid, MP5-2, mistede denne konkurrence evne (f). Målestok:. 25 um

Identifikation af fag-kloner, der specifikt binder til NSCLC celler

For at undersøge om PC5-2 ville binde til NSCLC celler, vi brugte immunhistokemi at lokalisere fagpartiklerne i forskellige celletyper. Vores resultater viste, at PC5-2 bundet specifikt til NSCLC cellelinjer, herunder CL1-5 og PC13 (fig. 1B, pilespidser). Styringen hjælperfag bandt ikke til CL1-5 celler. PC5-2 bundet hverken til andre cancercellelinjer, herunder oral cancer (SAS) og nasopharyngeale carcinomaceller (NPC-TW01), eller den normale epitelceller (NNM) fra næseslimhinden (fig. 1B).

den CL1-5-bindende evne PC5-2 blev yderligere bekræftet ved et peptid kompetitiv inhibering forsøg under anvendelse immunfluorescensfarvning. Resultaterne viste, at bindingsaktiviteten af ​​PC5-2 fagen til CL1-5 celler blev inhiberet af det syntetiske peptid SP5-2 på en dosis-afhængig måde. Ved en koncentration på 27 ug /ml, SP5-2 inhiberede fuldstændigt bindingsaktiviteten af ​​PC5-2 (fig. S1). Styringen fag ikke binder til CL1-5 celler, og PC5-2 ikke binder til NPC-TW01 i denne analyse (fig. S1 og tekst S2).

For yderligere at kontrollere, at PC5-2 fag ville binde til et målmolekyle udtrykt på overfladen af ​​CL1-5 celler, målte vi PC5-2-bundne celler ved anvendelse af flowcytometri (fig. S2 og Tekst S1, S2). En kontrol fag blev anvendt til at estimere uspecifik baggrund binding (fig. S2b). Resultaterne viste, at 42,6% af CL1-5 celler blev bundet af PC5-2 (fig. S2C), og denne binding blev fuldstændigt inhiberet af 27 ug /ml SP5-2 peptid (fig. S2d). PC5-2 ikke binde sig til SAS eller NNM (fig. S2 e og f).

Binding af syntetisk peptid SP5-2 med lungekræft celler og menneskelig lungekræft kirurgiske prøver

For at bestemme hvorvidt peptidsekvenserne vises på PC5-2 ville faktisk interagerer med NSCLC-celler anvendte vi fluoresceinisothiocyanat (FITC) -mærket SP5-2 peptid (FITC-SP5-2) i stedet for PC5-2 fag for et peptid-bindingsassay gennem immunfluorescensfarvning. FITC-SP5-2 specifikt bundet til alle de NSCLC cellelinjer vi testede, herunder CL1-5, H460, A549, PC13 og H23, men ikke binder til NNM. Den samme koncentration af FITC-mærket kontrol-peptid (FITC-Con-P) viste ingen sådan binding aktivitet (fig. 1C). Vi evaluerede også størrelsesorden og specificitet af SP5-2 binding ved hjælp flowcytometri. Andelene af CL1-5, H460, A549, PC13 og H23 celler bundet af SP5-2 var 43,0%, 45,8%, 44,3%, 20,1% og 44,0%, henholdsvis (fig. S3 og tekst S2).

for at afgøre, om dette målrettet ligand havde en affinitet for humane lungecancer kirurgiske prøver, vi testede reaktivitet PC5-2 og SP5-2 med pulmonale adenocarcinom celler ved hjælp immunhistokemi. Både PC5-2 og biotinmærket SP5-2 (B-SP5-2) erkendte tumorcellerne af NSCLC kirurgiske prøver (fig. 1D a og c, pilespidser), og kontrol-fag og biotin-mærket kontrol-peptid (B- con-P) ikke gjorde (fig. 1D b og d). SP5-2 (TDSILRSYDWTY) konkurrerede med PC5-2 for binding til kirurgiske eksemplarer af pulmonal adenocarcinom (fig. 1DO), men den samme koncentration af et muteret peptid, MP5-2 (TDSILRSYDGGG) ikke (fig. 1DF). Halvfjerds-fem procent (27/36) af de pulmonale adenocarcinom prøver fra 36 patienter udtrykte et mål molekyle, der blev anerkendt af dette peptid (tabel S1). Disse data viste, at SP5-2 kunne genkende uidentificerede molekyler udtrykt på NSCLC-cellelinjer og faktiske kræftceller fra de kirurgiske eksemplarer af lungekræft.

Mus modeller til undersøgelse af PC5-2-targeting evne

for at undersøge den målsøgende evne PC5-2 fag

in vivo

injicerede vi fager i halevenen af ​​mus der bar CL1-5-afledte tumorer og udvindes derefter dem efter perfusion. Vi bestemmes titre af fag i tumor masser og normale kontrol organer (hjerne, hjerte og lunger) [26], [30]. PC5-2 viste specifik homing til tumormasser med koncentrationer 15 gange højere end dets koncentration i kontrolgrupperne organer (Fig. 2A). Kontrol hjælpefagerne viste ikke nogen specifik målretning til tumorvæv (Fig. 2A).

(

A

) SCID mus, der bærer humane lungecancer xenografter modtaget intravenøst injektioner af PC5-2, og fag blev udvundet efter perfusion. Genvinding af PC5-2 fra tumoren var markant højere end fra hjerne, hjerte eller lunger. (

B

) Målretning aktivitet PC5-2 til tumorvæv var konkurrencedygtige hæmmet af SP5-2 men ikke af kontrol peptid eller mutant peptid. (

C

) immunhistokemisk lokalisering af PC5-2 efter intravenøs injektion i mus med CL1-5-afledte xenotransplantater. Fagen blev lokaliseret på tumorvæv (D og E) og ingen lokalisering blev observeret i normale organer såsom hjernen (a), hjerte (b), og lungerne (c), eller i vævssnittene behandlet med kontrol-fag ( f-i). Interaktionen af ​​PC5-2 med sektionens tumor blev inhiberet af syntetisk peptid SP5-2 (j). Scale bar: 25 pm

tumor-homing evne PC5-2 blev yderligere bekræftet af et peptid kompetitiv inhibering eksperiment, hvor syntetisk peptid SP5-2, injiceres sammen med PC5-2, markant. hæmmede genopretning af fag fra tumormasserne (fig. 2B). Et hundrede mikrogram SP5-2 inhiberede 92% af PC5-2 binding til tumormasser, men den samme koncentration af et kontrol-peptid havde ingen sådan inhibitorisk virkning (fig. 2B).

Fra

in vitro

fag display screening identificerede vi to kloner (PC5-2 og PC5-4) med en konsensus motiv af WT /YY (tabel 1). Ligesom PC5-2 blev det tumor-homing evne PC5-4 også kompetitivt inhiberet af SP5-2 (fig. S4 og tekst S2), antyder, at disse to fager kan binde gennem denne motivet til samme målmolekyle på plasmamembranen af lungekræft celler. Vi foreslog, at disse tre aminosyrerester kan spille en afgørende rolle i homing til tumorvæv. For at teste denne hypotese, vi ændret disse tre aminosyrerester i SP5-2 (TDSILRSYDWTY) til GGG i en mutant peptid, MP5-2 (TDSILRSYDGGG). Selvom det tumor-homing evne PC5-2 var blevet mærkbart inhiberet af peptidet SP5-2, var dette kompetitiv inhibering tabt i MP5-2, som indeholder GGG rest i stedet for WTY rester i SP5-2 (fig. 2B) . Disse data viser, at WTY rester var vigtige for bindingen evne SP5-2 til NSCLC-celler.

vævsfordelingen af ​​PC5-2 blev også undersøgt under anvendelse af immunfarvning. Vi injicerede SCID mus, der bærer NSCLC xenotransplantater med PC5-2 og derefter fjernet og fikseret tumor og kontrolorganer til lokalisering af fagpartiklerne. PC5-2 fandtes at lokaliseres i tumorvæv (fig. 2cd). Ved en højere forstørrelse, blev påvist immunoreaktiviteten af ​​fagen på plasmamembranen en vis diffusion i det omgivende cytoplasma af tumorceller (fig. 2Ce). Der var ingen reaktion produkt fundet på normale organer såsom hjernen, hjertet og lungevæv (Fig. 2C a-c), og heller ikke på tumorvæv behandlet med kontrol fag (fig. 2CI). Den specifikke målretning af PC5-2 til NSCLC xenograft blev hæmmet af syntetisk peptid SP5-2 i

in vivo

homing eksperiment (fig. 2Cj).

Terapeutisk virkning af SP5-2 -medieret målretning af liposomer

for at bestemme, om lungecancer-targeting peptid SP5-2 kunne anvendes til at forbedre det kemoterapeutiske effekt af kræftbehandling, vi koblet peptidet til liposomer indeholdende anti-cancer-lægemidler. SCID mus, der bærer størrelse matchede, CL1-5-afledte xenotransplantater blev behandlet med (1) SP5-2-konjugeret liposomal doxorubicin (SP5-2-LD), (2) mutant peptid-konjugeret liposomal doxorubicin (MP5-2-LD) , (3) ikke-målrettet liposomal doxorubicin (LD), (4) frit doxorubicin (FD), eller (5) tilsvarende volumener af phosphatpufret saltvand (PBS). Alle formuleringerne blev injiceret intravenøst ​​(iv) ved en total doxorubicin dosis på 8 mg /kg (1 mg /kg to gange om ugen i i alt otte injektioner).

tumorer i mus, som fik SP5-2 (. figur 3A gruppe a) -LD var betydeligt mindre end i MP5-2-LD, LD, FD, og ​​PBS grupper (

P

0,01) (. figur 3A gruppe b-e) . De tumor størrelser i LD og MP5-2-LD grupper var 2,1 og 2,6 gange større end i SP5-2-LD gruppe, hhv. Tumorstørrelserne i FD og kontrol PBS grupper var 7,0 og 8,3 gange større end i SP5-2-LD gruppe, (fig. 3A). Interessant nok blev den større terapeutisk effektivitet af SP5-2-LD tabt, når WTY motiv i peptidet var blevet ændret til GGG i MP5-2-LD. Frit doxorubicin udviste lidt terapeutisk virkning ved denne koncentration, som tumorstørrelsen i denne gruppe var kun 16% mindre end i PBS-gruppen (fig. 3A).

(

A

) Median tumorvolumen over tid i mus behandlet med PBS, FD, LD, MP5-2-LD, eller SP5-2-LD. Tumorvækst blev markant undertrykt i SP5-2-LD behandlede gruppe. SP5-2-LD har højere terapeutisk effekt end LD og MP5-2-LD (

n

= 6 i hver gruppe; **

P

0,01). (

B

) Mus bærer størrelse matchede CL1-5-afledte lungekræft med tumorstørrelse på ca. 500 mm

3 blev behandlet med SP5-2-LD, LD, eller PBS (

n

= 6 i hver gruppe, **

P

0,01). (

C

) Mus bærer H460-afledte lungekræft blev behandlet med SP5-2-LD, LD, FD, eller PBS (

n

= 6 i hver gruppe, *

P

0,05). (

D

) Virkningerne af forskellige behandlinger på ændring i kropsvægt i løbet af behandlingsperioden (

n

= 6 i hver gruppe). (

E

) Mus bærer CL1-5-afledte lungekræft blev behandlet med SP5-2-LV, LV, eller PBS (

n

= 6 i hver gruppe; **

P

0,01). (

F

) En Kaplan-Meier overlevelse kurve viste længere levetid af mus behandlet med SP5-2-LV end dem behandlet med LV og PBS (n = 5 i hver gruppe).

for at kontrollere, om store xenografter ville reagere på SP5-2-LD behandling, mus med store lungekræft xenografter (500 mm

3) blev tildelt til tre behandlingsgrupper. Efter et forløb med doxorubicin behandling med en total dosis på 16 mg /kg (2 mg /kg to gange om ugen i otte injektioner), tumorstørrelserne i kontrollen PBS og LD grupper gradvist øget til 3,3 og 2,1 gange tumorstørrelsen i SP5-2-LD-gruppe (

P

0,01) (fig 3B.). Disse resultater viste, at SP5-2-LD også øget den terapeutiske effekt af doxorubicin i SCID mus, der bærer store lungekræft implanteret.

For yderligere at teste, om SP5-2 ville optimere det terapeutiske indeks i lungekræft behandling, SP5- 2-LD blev anvendt til at behandle en anden type lungekræft xenograft (H460-afledt tumor). SCID mus, der bærer størrelse matchede, H460-afledte xenotransplantater blev behandlet med SP5-2-LD, LD, FD, eller tilsvarende volumener PBS, gennem i.v. injektion med en totalt doxorubicin dosis på 8 mg /kg (1 mg /kg to gange om ugen i otte injektioner). Den endelige tumorstørrelse i SP5-2-LD-gruppen var signifikant mindre end i LD, FD og PBS grupper (

P

0,05). Mus i LD, FD og PBS-grupper havde tumorer med størrelser 2,0-, 8.6- og 10,0 gange større end i SP5-52-LD gruppe (fig. 3C). Frit doxorubicin ved denne koncentration reducerede tumorstørrelsen med kun 14% i forhold til PBS-grupper. Ikke kun var tumorvækst markant undertrykt i SP5-2-LD gruppe (fig. 3C), legemsvægten af ​​mus i denne gruppe er steget med 10,3% (2,38 g) i slutningen af ​​behandlingsperioden. I modsætning til LD-behandlede mus havde en mindre stigning i kropsvægt på 2,4% (0,59 g) (fig. 3D).

For yderligere at bekræfte SP5-2 kunne øge det terapeutiske indeks for lungekræft, vi er knyttet den SP5-2 peptid til en anden anti-cancer medicin, liposomal vinorelbin (SP5-2-LV) og testet dens effektivitet mod lungekræft implanteret. SCID mus, der bærer størrelse-matchet CL1-5-afledte xenotransplantater blev givet i.v. injektioner af SP5-2-LV, liposomale vinorelbin (LV), eller tilsvarende volumener PBS til en samlet vinorelbin dosis på 24 mg /kg (2 mg /kg to gange om ugen i tolv injektioner). De tumor-bærende mus behandlet med SP5-2-LV (. Figur 3E, gruppe a) havde signifikant mindre tumorer end LV og PBS grupper (

P

0,01). (Fig 3E, gruppe B og c). Tumoren størrelse i LV-gruppen var 6,75 gange større end SP5-2-LV-gruppe. Den gennemsnitlige tumorstørrelse i kontrolgruppen PBS-gruppen var 25 gange større end SP5-2-LV-gruppen (fig. 3E). For at vurdere bivirkninger af behandlingerne blev musene vejet to gange om ugen. Det kropsvægt mus steg med 5,7% (1,37 g) i SP5-2-LV-gruppe og med 2,4% (0,58 g) i LV-gruppen i slutningen af ​​behandlingsperioden (data ikke vist).

Endelig har vi sammenlignede overlevelsesrater for tumor-bærende mus efter behandling med SP5-2-LV, LV, eller PBS løbet 102 dage. Alle fem dyr i PBS-behandlede gruppe døde (overlevelsesrate 0%). Tre mus døde på LV-behandlede gruppe (overlevelsesprocent 40%). I SP5-2-LV-behandlede gruppe, men overlevelsesraten var 80%, hvilket er betydeligt højere end de to andre grupper (fig. 3F). Disse eksperimenter viser, at SP5-2 øget den terapeutiske effektivitet liposomindkapslet doxorubicin og vinorelbin med mindre toksicitet.

Tumor lokalisering og biodistribution af SP5-2-konjugeret målretning liposomer

biodistribution og tumor lokalisering af SP5-2-LD, MP5-2-LD, LD, og ​​FD blev estimeret ved at måle den iboende auto-fluorescens-signalet af doxorubicin i mus med NSCLC xenografter. Doxorubicin (

M

r 543,54), et lille molekyle kemoterapeutisk middel som sin

M

r er 1000, har en dårlig farmakokinetisk profil, og dets koncentration blod falder til baggrundsniveau inden for én time efter indgivelse (fig. S5A og tekst S2). Den farmakokinetiske profil af forskellige liposomale doxorubicin-formuleringer, herunder SP5-2-LD, MP5-2-LD, og ​​LD, var markant større end FD (fig. S5A). Arealet under koncentrations-tidskurven (AUC

0-48 timer) af doxorubicin i tumorvæv var 10,4 ug · h /g, 31,5 ug · t /g, 29,0 ug · hr /g, og 59,9 ug · t /g i FD, LD, MP5-2-LD, og ​​SP5-2-LD grupper, henholdsvis (tabel S2). middelkoncentration Den intra-tumor doxorubicin i SP5-2-LD-behandlede gruppe var 5.7-, 1.9- og 2.1 gange højere end koncentrationen intra-tumor doxorubicin i FD, LD, og ​​MP5-2-LD grupper (Fig . 4A og tabel S2).

på udvalgte tidspunkter (1, 4, 24 og 48 timer) efter injektion, koncentration doxorubicin i tumorvæv (

A

) og kerner af kræftceller (

B

) blev målt. Doxorubicin koncentration inde tumorvæv og kerner i SP5-2-LD-gruppen var højere end i FD, LD, og ​​MP5-2-LD grupper (n = 3 ved hvert tidspunkt, *

P

0,05, **

P

0,01)

for at vurdere biotilgængeligheden af ​​de liposomale narkotika, brugte vi ophobning nukleare doxorubicin som en indikator for narkotika cytotoksicitet [40].. AUC

0-48 timers biotilgængeligt doxorubicin (dvs. bundet til kerner) til FD, LD, MP5-2-LD, og ​​SP5-2-LD var 3,7 mg · t /g, 6,7 pg · t /g , 7,5 ug · hr /g, og 17,7 ug · h /g (tabel S2). koncentration nukleare doxorubicin Den intra-tumor i SP5-2-LD gruppe var 4.8-, 2.6- og 2.4 gange højere end koncentrationen af ​​nukleare doxorubicin i FD, LD, og ​​MP5-2-LD grupper (fig. 4B og tabel S2). Doxorubicin koncentration inde tumorvæv og kerne var ikke signifikant forskellig mellem LD og MP5-2-LD grupper (fig. 4 og tabel S2).

Enhanced tumor drug delivery og terapeutiske virkning SP5-2-konjugerede liposomer

at sammenligne lægemiddelleveringsprofil af de fire doxorubicin formuleringer, forsøgte vi at detektere lægemiddel i tumorvæv ved hjælp af fluorescens-mikroskop. Billeder fra alle tumorer viste, at doxorubicin blev visualiseret i tumoren kerner en time efter SP5-2-LD blev administreret, men ikke efter andre formuleringer blev injiceret (fig. 5A). Over tid, områder af tumorsnit med påviselig doxorubicin forøget. Områderne med påviselig doxorubicin var signifikant større i SP5-2-LD-behandlede tumorer end i FD, LD, og ​​MP5-2-LD-behandlede tumorer ved hvert tidspunkt (fig. 5A). Den MP5-2-LD formulering havde samme fordeling mønster som LD, men regionerne FD-behandlede tumorer viste ingen påviselig doxorubicin (fig. 5A).

(

A

) Repræsentant to color billeder, der viser fordelingen af ​​doxorubicin (rød) i forbindelse med kerner (blå) i vævssnit. Ophobning af doxorubicin i tumorvæv blev vist ved 1, 4 og 24 timer efter injektion. Bar, 50 um. (

B

) Histopatologi og fluorescerende farvning af tumorvæv i hver behandlingsgruppe undersøgt efter farvning med H . E farvning markant formidlet nekrotiske /apoptotiske områder var til stede i hele sektioner af SP5-2-LD-behandlede xenotransplantater (fig. 5B). Desuden blev terminale deoxynukleotidyltransferase-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) anvendes til at identificere apoptotiske celler og tomat lectin blev påført detektere tumor blodkar. Tumorerne havde større apoptotiske områder og en lavere densitet af tumor blodkarrene i SP5-2-LD-behandlede gruppe end i LD- og PBS-behandlede grupper (fig. 5B og S6).

Jo større akkumulering af anticancerlægemidler i tumorvæv og mere biotilgængelige doxorubicin i cancer cellekerner fra liganden-konjugeret liposomer endvidere vist, at SP5-2-peptidet genkendes målmolekylet på overfladen af ​​lungecancerceller og dermed øget direkte lægemiddeladministration til tumor.

Discussion

den terapeutiske effekt af anticancerlægemidler kan opnås ved at øge lægemiddelformuleringen med molekyler, som binder fortrinsvis til tumorvæv [22], [26], [37], [ ,,,0],41]. Fag-display biopanning på intakt celle muliggør isolering af meget specifikke peptider, der er målrettet tumor-associerede antigener. Anti-cancer regimer bevæbnet med disse peptider kan anvendes som “krydsermissiler”, der er præcist styret til cancercellerne og levere nok høje doser for at dræbe disse celler med minimal skade på normalt væv.

I denne undersøgelse vi identificeret en NSCLC-targeting peptid og demonstreret sin forbedrede terapeutiske effektivitet i dyremodeller. Specifikt fandt vi en fag-klon PC5-2 der består 90% af de udvalgte fager binder til CL1-5 celler efter fem runder af biopanning (tabel 1). Immunhistokemi og flowcytometri assays bekræftede, at PC5-2 bundet til NSCLC celleoverfladen. De samme bindende resultater blev observeret i det beslægtede syntetiske peptid SP5-2, som erstattede PC5-2 (fig. 1 og fig. S1, S2, S3). Disse forsøg understøttes at denne målrettende peptid kan binde specifikt til celleoverfladen af ​​NSCLC-cellelinier.

In vivo

eksperimenter også konsoliderede målsøgende evne af peptidet. Ekspressionen af ​​SP5-2-peptidet (TDSILRSYDWTY) guider fagen at akkumulere i NSCLC xenotransplantater men ikke i normale organer (fig. 2). Bindingsaktiviteten af ​​PC5-2 til tumorvæv blev inhiberet af det syntetiske peptid SP5-2 (fig. 2B), hvilket indikerer, at PC5-2 interageret med NSCLC-celler ved sin viste peptid og ikke af en anden del af fag-partiklen. At den muterede syntetiske peptid, MP5-2, ikke har forhindret PC5-2 binding påvist betydningen af ​​WTY motiv i bindingsaktiviteten (fig. 2B). Desuden blev dette fænomen observeret i immunhistokemisk farvning af kirurgiske prøver fra human lungecancer (fig. 1D e og f), i dyremodeller for ligand-målrettet kemoterapi (fig. 3A) og i tumorlokalisering af doxorubicin leveret af SP5-2- konjugeret målretning af liposomer (fig. 4 og 5A). Salg

Immunhistokemi vurderinger af pulmonal adenocarcinom kirurgiske prøver viste, at SP5-2 har en klinisk potentiale som billeddannende prober til identifikation NSCLC eller drug delivery midler til behandling af NSCLC. Både PC5-2 og biotin-mærket SP5-2 opdaget pulmonal adenocarcinom kirurgiske prøver i vores eksperimenter (fig. 1D). Halvfjerds-fem procent (27/36) af pulmonale adenocarcinom prøver fra 36 patienter udtrykte et mål molekyle, der blev anerkendt af peptid (tabel S1). SP5-2, men ikke MP5-2, konkurrerede med PC5-2 for binding til pulmonal adenocarcinom kirurgiske prøver (fig. 1D), hvilket yderligere bekræftede specificiteten af ​​denne målrettet ligand.

I tidligere undersøgelser, doxorubicin har i vid udstrækning blevet anvendt i kræftbehandling på grund af dets brede spektrum af antitumoraktivitet. Men effekten af ​​doxorubicin til behandling af NSCLC fortsat utilfredsstillende med en responsrate på 15% [42]. Dette er til dels et resultat af suboptimale doser i tumoren som følge af vilkårlige lægemiddelfordeling i hele kroppen og alvorlig toksicitet for normale væv og organer. Liposomal indkapsling med en målligand, kan være en effektiv strategi til at levere lægemidlet direkte til tumorceller. Vores data viste, at dette peptid markant forøgede den terapeutiske virkning af liposomale kemoterapi og resulterede i højere overlevelsesrater i mus med menneskelige lungekræft implanteret, og produceret begrænsede bivirkninger på dyr (fig. 3). Dette peptid forøgede terapeutiske indeks for ikke blot doxorubicin men også af vinorelbin, et vincaalkaloid anvendes til behandling af fremskreden NSCLC [3]. Endvidere har vi observeret nedsat kardensitet og væsentligt øget celle apoptose i tumorvæv efter målretning liposom behandling (fig. 5B og S6). Denne ligand-medieret liposomal formulering er potentielt bedre end konventionelle anti-cancer terapi for NSCLC.

Vores

in vivo

farmakokinetiske studier i mus viste, at liposomal doxorubicin dramatisk ændret transport og distribution af doxorubicin i hjerte, lunger, nyrer og lever i mus (fig. 4 og S5).