PLoS ONE: Sphere Culture af murint Lung Cancer cellelinier Beriget med kræft Start Cells

Abstrakt

Cancer initierende celler (CICS) repræsenterer en unik cellepopulation afgørende for vedligeholdelse og vækst af tumorer. De fleste

in vivo

studier af CIC udnytte menneskelige tumorxenoplantater i immunsvækkede mus. Disse modeller giver begrænsede oplysninger om samspillet mellem CIC med værtens immunsystem og er af begrænset værdi for vurderingen behandlingsformer rettet mod CIC, især immun-baserede terapier. For at vurdere dette, er der behov for en syngen kræft model. Vi undersøgte kugle-dannende evne tretten murine lungekræft cellelinier og identificeret TC-1 og en metastatisk subklon af Lewis lungecarcinom (HM-LLC) som cellelinier, som let dannes og vedligeholdes sfærer over flere passager. TC-1 tumorspheres blev ikke beriget for ekspression af CD133 eller CD44, formodede CIC markører, heller ikke de viser Hoechst 33342 side befolkning farvning eller Aldefluor aktivitet sammenlignet med vedhængende TC-1 celler. Men i tumorsphere kultur, disse celler udviste selvfornyelse og langsigtet symmetrisk division kapacitet og udtrykkes mere Oct-4 sammenlignet med adhærente celler. HM-LLC sfære-afledte celler udviste forøget Oct-4, CD133, og CD44-ekspression, demonstreret en Hoechst 33342 side befolkning og Aldefluor aktivitet sammenlignet med adhærente celler eller en lav metastatisk subklon af LLC (LM-LLC). I syngene mus, HM-LLC sfære-afledte celler kræves færre celler at initiere tumorigenese sammenlignet med adhærente eller LM-LLC-celler. Tilsvarende TC-1 sfære-afledte celler var mere tumorigene end adhærente celler i syngene mus. I modsætning hertil immunsvækkede mus, mindre end 500 sfære eller vedhængende TC-1 celler og mindre end 1000 kugle eller omliggende LLC celler blev forpligtet til at indlede en tumor. Vi foreslår, at ingen enkelt fænotypisk markør kan identificere CIC i murine lunge cancer cellelinjer. Tumorsphere kultur kan give en alternativ metode til at identificere og berige for murine lunge CIC. Desuden foreslår vi, at vurderingen tumorgenicitet af murine lunge CIC i syngene mus bedre modeller for interaktion af CIC med værtens immunsystem

Henvisning:. Morrison BJ, Stål JC, Morris JC (2012) Sphere kultur af murint Lung Kræft cellelinjer er Beriget med kræft Start celler. PLoS ONE 7 (11): e49752. doi: 10,1371 /journal.pone.0049752

Redaktør: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italien

Modtaget: Juli 12, 2012; Accepteret: Oktober 15, 2012; Udgivet: November 13, 2012 |

Copyright: © 2012 Morrison et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Division of Hematology-onkologi, University of Cincinnati. BJM blev understøttet af en University of Cincinnati, University Research Council, postdoc Research Program tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er årsag til næsten 20% af alle kræftdødsfald i USA [1] Stater. Den tegner sig for flere dødsfald end de næste fire mest almindelige kræftformer tilsammen. Trods forbedringer i diagnose og behandling, den samlede 5-års overlevelse for alle patienter med lungekræft er en trist 15%, og dette falder til under 2% hos patienter med metastatisk sygdom [2]. Derfor lungekræft er et stort problem for folkesundheden, og en bedre forståelse af sygdommen biologi og forbedringer i behandlingen er stærkt brug for.

Stigende beviser støtter ideen om en specialiseret population af celler i tumorer betegnes kræft initierende celler (CIC), alternativt “cancer stamceller” eller tumor-initierende celler. Disse celler menes at være ansvarlig for tumorens oprindelse, vedligeholdelse, progression, og resistens over for behandling. CIC vise funktionelle egenskaber stamceller, såsom evnen til selv-fornyelse og evnen til at give anledning til differentieret afkom. Formodede CIC’er er blevet identificeret i myeloid leukæmi [3], og tumorer i hjernen [5], [6] og bryst [7]. For nylig er lunge CIC blevet isoleret fra humane cellelinjer og patientprøver [8] – [15]. Undersøgelse lunge CIC kan øge forståelsen af ​​oprindelsen af ​​lungekræft og kan føre til nye terapeutiske metoder rettet mod disse celler.

CIC har vist sig at danne flercellede tredimensionelle kugler

in vitro

når de dyrkes i ikke-adhærente serumfrie betingelser [6], [16]. Under disse betingelser, de fleste tumorceller undergår anoikis, en form for programmeret celledød, mens de sjældne CIC opdele at generere tumor sfæroider. Kuglen assay og en nylig foreslået matematisk fortolkning giver mulighed for at vurdere den symmetriske division ekspansion på maligne stamceller celle-lignende celler, og vurderingen af ​​virkningerne af behandling på selv-fornyelse og proliferative aktivitet af disse celler [17]. Denne analyse er et kraftfuldt værktøj til at vurdere de funktionelle og fænotypiske egenskaber forbundet med CIC. I et studie med patient lungekræft prøver blev sfære dannelse findes i syv af 19 tumorer undersøgte [10]. Disse celler viste sig at have

in vitro

in vivo

egenskaber CIC herunder selvfornyelse, proliferative og differentiering kapacitet, udtryk for CD133, berigelse for side befolkning (SP) celler, udtryk af de embryonale “stemness” gener okt-4 og NANOG, kemoterapi modstand, og tumorigenisitetsforsøg. Sphere kultur har været brugt til at berige for lungekræft CIC populationer [8], [9], [13], [14].

Mikrofotografier (10X) af passage 2 dage 7 sfære kulturer af (A) TC -1 kugler, (B) HM-LLC kugler og (C) LM-LLC sfære mediekultur. Bar = 100 um. (D) Samlet fold ekspansion og (E) symmetrisk division frekvens over otte passager for TC-1 kugler (rød) og HM-LLC kugler (sort), og to passager for LM-LLC sfære mediekultur (grå) viser væsentlige forskelle; * P 0,001. (F-G) Fold ekspansion over syv passager for TC-1 kugler (rød) og HM-LLC kugler (sort). (H) Passage 2 kugler blev dyrket og talt for totale antal celler på de dage, som vist. Eksperiment gentaget to gange, repræsentative resultater vist. På dag 1 det totale antal celler i kultur reduceres. De overlevende mitogen-responsive kræft initierende celler er ansvarlige for celleproliferation og generere nye multi-cellulære kugler, der kan høstes på dag 7. Bars: ± Standard på middelværdien (SEM)

Murin lungekræft er ikke blevet godt karakteriseret for tilstedeværelsen og hyppigheden af ​​CIC. De fleste undersøgelser af lunge CIC har brugt humane cellelinjer eller primær tumor prøver, med tumorgenicitet kun bedømmes i immunsvækkede musemodeller. Vigtigere er interaktioner mellem immunsystemet og tumormikromiljøet blevet påvist at spille en rolle i respons på behandling. Faktisk, lungekræft og mange andre tumorer, der forekommer i immunkompromitterede vært opfører mere aggressivt, reagerer dårligt på behandling, og har dårligere resultater [18], [19]. Derfor, for at mere præcist at modellere immun interaktioner involveret i etableringen af ​​tumorer ved CIC, vi undersøgte murine lunge tumorceller beriget for CIC i et immunkompetente syngene dyr. Den aktuelle undersøgelse rapporterer identifikation og karakterisering af murine lunge CIC hjælp sfære dyrkningsmetoder og den sammenlignende vurdering af disse celler i syngene og immunsvækkede musemodeller.

Materialer og metoder

Celler

Murine TC-1 og parentale Lewis lungecarcinom (LLC) -celler blev indkøbt fra ATCC (Manassas, VA). Den høje metastatisk (HM-LLC) og lav metastatisk (LM-LLC) subkloner af LLC [20], [21] var gaver af Dr. Zhongyun Dong (University of Cincinnati, Cincinnati, OH), og blev dyrket som klæbende celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (Mediatech, Inc., Manassas, VA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1% penicillin G-streptomycin (Invitrogen). Cellelinjer 18948, 18.955-klæbende, 18.955-Floating (en ikke-klæbende klon af 18955 celler) og 18959 celler er

de novo

murine småcellet lungecancer (SCLC) cellelinjer og var en gave fra Dr. . Kathryn Wikenheiser-Brokamp (Cincinnati Children ‘s Medical center, Cincinnati, OH). Disse cellelinjer blev undersøgt under The University of Cincinnati Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendelse (protokol nr 11-03-21-01). Murine lung tumorcellelinier MLE12 og MLE15 [22], der er afledt fra transgene mus, der huser abevirus 40 (SV40) stort tumorantigen under transkriptionel kontrol af den humane overfladeaktivt protein C (SP-C) promotor, var gaver af Dr. Jeffrey Whitsett (Cincinnati Children ‘s Medical center). SCLC-cellelinier og MLE12 og MLE15 celler blev dyrket i HITES medier [23]. Murin adenocarcinom lungekræft cellelinier 393P, 344P, og 344SQ [24] stammer fra Kras

LA1 /+ p53

R172HΔG mus en gave af Jonathan M. Kurie (The University of Texas, MD Anderson Cancer Center, Houston , TX) og blev dyrket i DMEM med 10% FCS.

Dyr og etiske retningslinjer

C57BL /6-mus blev opnået fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) og NOD-SCIDγ (NSG , NOD.Cg-

Prkdc

SCID Il2rg

tm1Wjl

/SzJ) mus fra en etableret ynglende koloni ved Cincinnati Children ‘s Medical center. The University of Cincinnati Institutional Animal Care og brug Udvalg meddelt godkendelse for dette arbejde (protokol nr 11-03-21-01). Alle procedurer var i overensstemmelse med retningslinjerne institutionelle dyrevelfærd, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Real time PCR kvantificering blev gjort for Oct-4, et gen associeret med stamcelle selvfornyelse, mRNA-ekspression. TC-1 kugler (A) og HM-LLC kugler (B) viser øget Oct-4 udtryk i forhold til matchede klæbende celler; * P≤0.001. HM-LLC-celler udtrykte væsentligt mere Oct-4 end LM-LLC adhærerende celler; ** P = 0,005. Plots repræsenterer kombineret data fra 2-4 biologiske replikater, hver med tre tekniske gentagelser. TC-1-celler (rød); LM-LLC vedhængende (grå); HM-LLC-celler (sort). Barer:. ± SEM

(A-B) Repræsentative plots viser Aldefluor farvning (blå) og DEAB kontrol farvning (rød) til HM-LLC, LM-LLC og TC-1 klæbende celler i forhold til passage 2, dag 1 og dag 7 sfære-afledte celler. Aldefluor højt udtrykkende celler (rektangulær boks) er signifikant større i (C) frekvens og (D) gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) på Aldefluor inden HM-LLC sfærer sammenlignet med LM-LLC eller HM-LLC adhærerende celler, og HM-LLC adhærent celler udtrykker mere Aldefluor end LM-LLC adhærerende celler; frekvens (C) * P≤0.001; MFI (D) * P≤0.002. Sammenlignet med DEAB farvning blev Aldefluor positivitet (ikke-rektangulær kasse) fundet at være signifikant højere i TC-1 klæbende celler i forhold til kugler (E); * P≤0.004. MFI af Aldefluor inden for TC-1 grupper (F) blev ikke fundet at være signifikant forskellig. Ingen Aldefluor stor befolkning var kendt for TC-1 sfærer eller omliggende celler. Plots repræsenterer kombineret data fra to biologiske gentagelser med tre tekniske gentagelser hver. Barer:. ± SEM

Repræsentative SP grunde til (A) LLC celler og (B) TC-1-celler, der sammenligner matchede vedhængende celler til passage 2, dag 1 og dag 7 kugle-afledte celler. Hoechst 33342-farvning blev bekræftet med verapamil blokade. (C) SP frekvens blev øget betydeligt i HM-LLC sfærer sammenlignet med klæbende celler; * P 0,001; ** P≤0.012. HM-LLC og LM-LLC klæbende celler var ikke signifikant forskellig for SP frekvens. (D) SP blev ikke fundet at være opreguleret i kugle-afledte TC-1-celler i forhold til matchede klæbende celler. Dag 1 sfære-afledte celler havde en signifikant lavere frekvens af SP-celler sammenlignet med adhærente celler og dag 7 sfære-afledte celler; * P = 0,03. Plots repræsenterer kombineret data fra tre biologiske gentagelser med tre tekniske gentagelser hver. Barer:. ± SEM

(A) Repræsentant flowcytometri grunde til CD133 (Y-aksen) og CD44 (X-aksen) co-farvning. (B og D) Middelværdien fluorescensintensitet (MFI) på CD44 er vist korrigeret for intensiteten af ​​isotype farvning for LLC og TC-1-celler. (B) HM-LLC sfærer og adhærente celler samt LLC (ATCC) celler udtrykker højere mængder af CD44 sammenlignet med LM-LLC-celler. Sphere-afledte celler viste sig at have en lavere MFI for CD44 sammenlignet med HM-LLC adhærerende celler. D7 sfære-afledte celler havde en lavere MFI for CD44 sammenlignet med D1-celler; * P 0,001. (D) Dag 1 TC-1 sfære-afledte celler udtrykker mindre CD44 end dag 7 eller adhærente celler; * P≤0.002. (C) CD133 hyppighed af positive celler er højere i HM-LLC sfærer sammenlignet med LM-LLC adhærerende celler; * P≤0.043. CD133 ekspressionen var ikke signifikant forskellig mellem HM-LLC adhærerende celler og kugler eller blandt de tre forskellige LLC adhærente celler. (E) Ingen væsentlig forskel i CD133 ekspressionen blandt TC-1 dyrkningsbetingelser. Eksperiment udført i tre eksemplarer vist repræsentative resultater. Barer:. ± SEM

Konfidensinterval plot af begrænsende fortynding analyse er vist med y-aksen viser den estimerede hyppighed af kræft initierende celler (CIC). (A) En begrænsende fortynding af TC-1-celler (120.000, 80.000, 40.000, 10.000, 5.000, og 1.000) blev injiceret subkutant i syngene C57BL /6-mus (n = 4 til 8). Sphere afledte celler viste sig at være mere tumorigen end adhærerende celler; * P≤0.001; ** P 0,02. Dag 1 sfære-afledte celler var mere tumorgene end dag 7; *** P = 0,04. En begrænsende fortynding (10.000, 1.000, og 500 celler) (n = 6 til 8) af de samme tre grupper blev injiceret i NSG mus og CIC frekvens viste sig at være under 1/500 for alle grupper. (B) Analyse af LLC begrænsende fortynding tumor eksperiment for syngene (80.000, 40.000, 20.000, og 10.000 celler) og immunkompromitterede (NSG) mus (80.000, 40.000, 10.000, og 1000 celler) (n = 4 til 9). Ingen signifikante forskelle noteret; dog sfære-afledte celler trended mod at blive mere tumorgene end HM eller LM adhærente celler i C57BL /6-mus. Lavere antal implanterede celler var nødvendige for at indlede tumorer i immunsvækkede dyr end i syngene dyr med den estimerede CIC frekvens under 1/1000 for alle LLC grupper.

Tumorsphere assays

Celler var dyrkes som tumorspheres i DMEM /F12 (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT) indeholdende 20 ng /mL rhEGF (R StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC). Kort fortalt blev cellerne inkuberet i 60 minutter ved 37 ° C i nærvær af Aldefluor reagens, alene eller med tilsætning af en diethylaminobenzaldehyde (DEAB) -holdige opløsning, som blokerer ALDH1 aktivitet. Der blev indsamlet under anvendelse af et Epics XL-MCL flowcytometer (Beckman Coulter, Brea, CA). Ikke-levedygtige celler blev udelukket fra analyse under anvendelse af propidiumiodid (Sigma) farvning. Aktivitet blev vurderet ved hjælp matchende DEAB kontrolprøver. Dataene blev analyseret ved hjælp FlowJo software (Tree Star, Inc., Ashland, OR).

Hoechst 33342 side Befolkning (SP)

Hoechst 33342 farvestof farvning SP analyse blev udført ved hjælp af metoder, tilpasset fra Goodell et al. [26]. Kort fortalt blev en million celler inkuberet med 10 pg /ml Hoechst 33342 (Sigma) i 90 minutter ved 37 ° C. Bekræftelse af SP-celler blev udført ved anvendelse af 50 uM verapamil (Sigma) for at blokere udstrømningen af ​​farvestoffet. Der blev indsamlet under anvendelse af en LSRII flowcytometer (BD Biosciences). Ikke-levedygtige celler blev udelukket fra analysen.

Real-time Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse PureLink ™ RNA mini-kit (Invitrogen). RNA blev revers transkriberet i 20 pi ved anvendelse af Verso cDNA kit (Thermo Fisher Scientific, Surrey, UK) og GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, Foster City, CA). Analyse af Oct-4-ekspression blev udført under anvendelse Plexor® qPCR System (Promega, Madison, WI) reagenser og StemElite ™ Mus-Pou5f1 /ACTB primerpar (Promega) indeholdende primere til både Oct-4 og β-actin-gen. Dataene blev indsamlet ved brug af Bio-Rad CFX96 ™ RT-System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) og analyseret under anvendelse Plexor® analysesoftware. Alle realtid RT-PCR resultater blev kompileret med tre til seks tekniske gentagelser for hver biologiske replikere og to til fire biologiske gentagelser blev udført for hver prøve – matchede vedhængende celler og passage 2 (P2) dag 1 (D1) og dag 7 ( D7) sfære-afledte celler. Dataene blev normaliseret til endogen β-actin for hver prøve. Prøverne blev standardiseret til enten TC-1 eller HM-LLC klæbende celler til at sammenligne ekspressionsniveauerne blandt prøver.

In vivo Tumor Indledning

En begrænsende fortynding af TC-1 (120.000, 80.000, 40.000 , 10.000, 5.000, eller 1.000) celler fra matchede vedhængende og P2 kugle-afledt D1 eller D7 kulturer blev subkutant injiceret i flankerne af C57BI /6-mus (n = 4 til 8). En anden begrænsende fortynding af celler (10.000, 1.000 og 500 celler) for de samme tre betingelser blev også injiceret i NSG mus (n = 6 til 8). Tilsvarende for LLC-celler blev gennemført en begrænsende fortynding eksperiment på 80.000, 40.000, 20.000, eller 10.000 celler til C57BI /6 og 80.000, 40.000, 10.000 eller 1.000 celler for NSG mus (n = 4 til 9). Mus blev overvåget to gange ugentligt for time-to-tumordannelse. Tumor overlevelse op til dag 65 blev vurderet.

Statistisk analyse

SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til statistisk analyse. Studerendes

t

-test blev anvendt til at sammenligne grupper. For

in vivo

tumordannelse begrænsende fortynding analyse estimering forskelle i stamcelle /kræft initierende celle frekvens blandt prøver blev udført under anvendelse Extreme begrænsende fortynding Analysis (ELDA) software som tidligere beskrevet [27]. Niveauet af statistisk signifikans blev sat til 0,05.

Resultater

Sphere Danner Kapacitet

SFC blev undersøgt i 13 murine lungekræft cellelinjer eller subkloner af cellelinjer afledt fra forskellige murine genetiske baggrunde (tabel 1). SFC blev bemærket for ni af disse cellelinier. Men SFC ikke altid hænger sammen med evnen til kultur som sfærer end serielle passager. Af de ni cellelinjer, som dannede kugler og blev testet for langsigtet kapacitet kultur, kun to, TC-1 og HM-LLC demonstrerede vedvarende vækst i serielle passager. TC-1 og HM-LLC-celler var i stand til at danne tredimensionale sfæroider i kultur (figur 1A og 1B). LM-LLC celler (Figur 1C) og forældrenes LLC celler ikke danne kugler og var ude af stand til langvarig passage i sfære kultur. TC-1 og HM-LLC kugler udviste en FE potentiel 1 over flere passager (Figur 1D). Sphere kulturer af TC-1 og HM-LLC udstillet en positiv cancer stamcelle /CIC symmetrisk division frekvens, mens LM-LLC cellerne ikke gjorde (figur 1E). Dette indikerer, at kugle media dyrkningsbetingelser kan identificere formodede CIC’er for disse to cellelinjer. FE var forholdsvis stabil over passage nummer for TC-1 (figur 1F) og HM-LLC (figur 1G) kugler. Inden for 24 timer efter passage ca. 30% (HM-LLC) eller 54% (TC-1) celler undergår anoikis /celledød (figur 1H). De resterende mitogen-responsive celler ved D1 gik på at danne sfærer af D7. Vi antager, at D1 celler blev beriget for CIC sammenlignet med D7-celler, som D7-celler var mere tilbøjelige til at blive sammensat af nogle CIC og større antal af differentierede tumorceller.

Oct-4 mRNA-ekspression forøges i Sphere -afledte celler

Ekspression af Oct-4, et gen involveret i stamcelle selv-fornyelse og en central regulator af pluripotens der alene kan omprogrammere celler til pluripotens [28], blev vurderet i matchede vedhængende og passage 2, D1 og D7 sfære celler til TC-1 og HM-LLC, og adhærente LM-LLC-celler. Data blev normaliseret til ekspression af β-actin og standardiseret til ekspressionsniveauer af enten TC-1 (figur 2A) eller HM-LLC adhærente celler (figur 2B). Sphere-afledte celler udtrykte signifikant større Oct-4 mRNA end matchede adhærente celler; P≤0.001. TC-1 sfære dyrkede celler fra enten D1 eller D7 udtrykte ca. 6 gange mere Oct-4 i forhold til klæbende celler. HM-LLC kugler fra enten D1 eller D7 udtrykt over 1,7 gange mere Oct-4 end klæbende celler. LM-LLC adhærente celler udtrykte Oct-4 ved ca. 60% af niveauerne af adhærente HM-LLC-celler. Angivelse af SOX2 og NANOG, der er forbundet med selv-fornyelse og stemness, viste sig ikke at være væsentligt anderledes udtrykt mellem kugler og adhærente celler (data ikke vist).

Aldefluor Aktiviteten Forbedret i HM-LLC, men ikke i TC-1 Spheres

ALDH1 udtryk og aktivitet er blevet korreleret med CIC aktivitet og øget aggressivitet lungetumorer [12]. Vi undersøgte ALDH1 aktivitet i matchede adhærente og sfære kulturer. Repræsentative kurver er vist for vedhængende HM-LLC og LM-LLC sammenlignet med P2, D1 og D7 sfære dyrkede celler (figur 3A) og for adhærente TC-1-celler sammenlignet med P2, D1 og D7 sfære dyrkede celler (figur 3B). For HM-LLC sfærer, blev fundet en delmængde af høj Aldefluor udtrykkende celler øges betydeligt i sfære dyrkede celler sammenlignet med HM-LLC eller LM-LLC klæbende celler (figur 3A); P≤0.001 til frekvens, og P≤0.002 for gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) (figur 3C og 3D). TC-1 adhærente og sfære-afledte celler udtrykte lave niveauer af Aldefluor aktivitet (figur 3B). Adhærerende TC-1-celler demonstrerede flere Aldefluor-positive celler i sammenligning med kugle-afledte celler (figur 3E); P≤0.004. Disse niveauer var ikke signifikant forskellige, når analyseret for MFI (figur 3F).

SP Forbedret i HM-LLC, men ikke i TC-1 Spheres

Vi undersøgte matchet adhærente celler, og P2, D1 og D7 sfære kulturer med Hoechst 33342 for SP. Som en kontrol blev verapamil anvendes til at forstyrre aktiviteten af ​​Hoechst 33342 transporteren. SP blev defineret som den formindskede population af celler i nærvær af verapamil. Eksempler på profiler for LLC-celler (figur 4A) og TC-1-celler (figur 4B) er vist. SP frekvens viste sig at forøges inden kugler af HM-LLC sammenlignet med adhærente celler af enten HM-LLC eller LM-LLC; P≤0.012 for D1 sfærer og P 0,001 for D7 kugler (figur 4C). Den gennemsnitlige brøkdel af SP celler til tre biologiske gentagelser for HM-LLC P2, var D1 kugler 1 ± 0,5%, for P2, D7 kugler 2 ± 0,7%, for HM-LLC vedhæftende celler 0,4 ± 0,4% og for LM-LLC tilhænger celler 0,4 ± 0,3%. TC-1 klæbende og kugle-kulturer udtrykte lave frekvenser af SP celler. SP frekvens blev ikke fundet at være forbedret til kugle dyrkede sammenlignet med vedhængende TC-1 (figur 4D). Dag 1 sfære-afledte celler viste sig at have en formindskelse i frekvensen af ​​SP-celler sammenlignet med adhærente celler eller D7 sfære-afledte celler; P = 0,03.

CD133 Expression øges i HM-LLC Spheres og CD44 Expression forstærkes i HM-LLC Celler Sammenlignet med LM-LLC Celler

Ud over at vurdere funktionelle egenskaber CIC sådan som ALDH1 aktivitet og Hoechst 33342 farvestof efflux, vi søgte også at karakterisere TC-1 og LLC-celler til ekspression af CD44 og CD133, formodede CIC celleoverflademarkører. Repræsentative grunde til CD44 og CD133 er vist (figur 5A). Blandt TC-1 og LLC-celler, alle cellerne udtrykte CD44. CD44-ekspression for HM-LLC sfærer sammenlignet med HM-LLC adhærerende celler demonstrerede et fald for kugler i den samlede ekspression (figur 5A og 5B). CD44-ekspression var variabel blandt LLC cellelinjer og dyrkningsbetingelser (figur 5A og 5B). Adhærente cellelinjer viste en mere homogen udtryk for CD44, mens kugle-dyrkede celler udviste en mere heterogen udtryk med nogle celler, der udtrykker faldt mængder af CD44 mens de fleste forblev CD44 lyse. CD44 MFI-ekspression viste sig at falde mellem D1 og D7-celler; P 0,001 (figur 5B). LM-LLC-celler udviste den mindste intens farvning for CD44 sammenlignet med alle andre LLC celletyper og dyrkningsbetingelser; P 0,001 (figur 5A). Ingen forskel blev påvist for ekspression af CD133 blandt HM-LLC adhærerende celler og P2, D1 og D7 sfære kultur celler; der var imidlertid en betydelig stigning i hyppigheden af ​​CD133 positivitet blandt HM-LLC kugler, både D1 og D7 dyrkede celler sammenlignet med LM-LLC-celler (figur 5C).

CD44-ekspression blev reduceret i P2, D1 sfære-afledte celler til TC-1-celler sammenlignet med adhærente celler og P2, D7-celler (figur 5D). Ingen forskel i CD44 ekspression blev bemærket for P2, D7 TC-1-celler sammenlignet med adhærente TC-1-celler. Ingen signifikante forskelle blev noteret i ekspressionen af ​​CD133 blandt TC-1 celle dyrkningsbetingelser (figur 5E).

Sphere-afledte celler udvise større tumorgenicitet for Syngene mus sammenlignet med klæbende celler

Vi vurderede tumorigeniciteten af ​​D1 og D7 sfærer sammenlignet med adhærente celler. Vi undersøgte også tumorigeniciteten af ​​disse celler hos immunkompetente syngene mus sammenlignet med immunkompromitterede NSG mus for bedre at behandle CIC modellen i disse to forskellige mus miljøer [29]. Ved hjælp af en begrænsende fortynding analyse blev TC-1 sfærer sig at være signifikant mere tumorigene i syngene mus sammenlignet med TC-1 adhærerende celler; P≤0.001 for P2, D1-celler og P = 0,0158 for P2, D7-celler (figur 6A). D1 TC-1 kugler var mere tumorgene end D7 sfærer; P = 0,04. TC-1 P2, blev D1 sfærer skønnes at have et CIC frekvens på 1 celle pr 9,533 celler. P2, D7 sfærer var det næstmest tumorigene med en anslået CIC frekvens på 1 celle pr 21,918 celler, og adhærente celler viste sig at være den mindst tumorigene med en estimeret frekvens på 1 celle pr 62,129 celler. For LLC-celler implanteret i syngene mus, var der en tendens til lavere CIC frekvens blandt kugler (D1-celler, 1 per 29.694 celler og D7 celle 1 per 35.949 celler) sammenlignet med adhærente celler (HM-LLC 1 per 46.989 celler og LM-LLC 1 per 49.686 celler), men denne tendens nåede ikke signifikans (figur 6B). I NSG mus alle fortyndinger af hver cellelinje og dyrkningsbetingelser testet var stand til at danne tumorer i 100% af musene. Ved afprøvning, mindre end 500 celler til TC-1 og mindre end 1000 celler for LLC celler var tilstrækkelige til at fastslå tumor i NSG-mus (figur 6A og 6B).

Diskussion

De fleste af studier af CIC har brugt patient-afledt materiale eller etablerede humane tumorcellelinier inokuleret i immunkompromitterede mus. Mens disse xenografundersøgelser muligt at identificere en sub-population af celler i stand til at rekapitulere en tumor i en immunkompromitteret mus, kan de ikke give et præcist billede af de karakteristika sande CIC. For at danne en tumor hos et menneske, skal potentielle CIC’er interagere med immunsystemet at forhindre tumor genkendelse og eliminering. Som bevis for dette, viste vi, at syngene immunkompetente mus kræver betydeligt flere celler til at indlede en tumor end immunkompromitterede mus. Ud fra dette kan det postuleret, at der er en større population af celler i stand til at vokse tumorer i immunsvækkede mus, der ikke kan initiere tumorer i deres syngene modstykker, og at de sande CIC’er kan repræsentere en langt sjældnere befolkning end bestemt i xenograf modeller.

anvendelsen af ​​kuglen kultur til detektering putative CICS, har været anvendt til forskellige tumorer [10], [16], [17], [30]. Så vidt vi ved, er dette den første gang, at et panel af murine lungekræft cellelinier er blevet systematisk undersøgt for kugle dannelse kapacitet og berigelse af CIC (tabel 1). Især TC-1 og HM-LLC kugler var i stand til vedvarende vækst i kultur. Ved passage, et betydeligt antal celler dør inden for de første 24 timer. Dette indikerer, at inden kugle kulturer der findes en sub-population af celler i stand til selv-fornyelse og spredning, formodede CIC. Men ikke alle cellelinjer var i stand til vedvarende vækst som kugler. Syv ud af de ni cellelinier, som dannede sfærer og blev testet for langsigtet kapacitet kultur havde en FE under eller inden for en standardafvigelse på 1 (tabel 1). En FE under 1 indikerer, at andre celler med et begrænset spredning kapacitet udover sande CIC kunne danne kugler, eller at sande CIC kunne asymmetrisk opdele over tid i differentierede celler ikke er i stand til kultur i sfære betingelser. Derfor sfære dannelse over en eller to passager er ikke så nyttige til identifikation af CIC som er forlænget sfære kultur over flere passager og anvendelse af en matematisk model til vurdering CIC symmetrisk division frekvens [17].

I modsætning til parentale LLC og LM-LLC-celler, HM-LLC-celler er i stand til at danne kugler, der kunne passeres større end otte gange, og udviste en robust fold ekspansion og symmetrisk division frekvens. Desuden blev sfære formation kendt for de metastatiske murine lungeadenokarcinom linjer 344P og 344SQ, men ikke for de ikke-metastatisk cellelinie 393P. Disse tre cellelinjer er tidligere blevet rapporteret at danne tredimensionale sfærer i matrigel kultur og metastase-tilbøjelige linjer er blevet karakteriseret som værende i stand til at undergå en epitelial-til-mesenchymal overgang (EMT) [24]. Det er blevet foreslået, at der kan være en direkte sammenhæng mellem EMT af celler og erhvervelse af en stamcelle-lignende /CIC fænotype [31]. Vores resultater antyder, at metastatiske celler har en beriget evne til kultur som ikke-adhærente sfæroider, og at metastatiske celler er beriget for CIC. Der er behov for fremtidige studier for at løse dette.

Vi viste, at frekvensen af ​​CIC skifter i løbet af en passage for murine lungekræft tumorspheres.