PLoS ONE: Myc Er en Metastase Gene for ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Metastase er en proces, hvorved cancerceller lærer at danne satellit tumorer i fjerntliggende organer og repræsenterer princippet dødsårsag for patienter med solide tumorer. NSCLC er den mest dødbringende human cancer på grund af sin høje metastase.

Metodologi /vigtigste resultater Salg

Mangel på en egnet dyremodel har hidtil hæmmet analyse af metastatisk progression. Vi har undersøgt c-myc for dets evne til at inducere metastase i en C-RAF-drevne musemodel for ikke-småcellet lungecancer. c-MYC alene inducerede frank tumorvækst først efter lang ventetid, på hvilket tidspunkt sekundære mutationer i K-Ras eller LKB1 blev påvist minder om humant NSCLC. Kombination med C-RAF førte til øjeblikkelig acceleration af tumorvækst, omdannelse til papillære epitelceller og angiogen switch induktion. Endvidere tilsætning af c-myc var tilstrækkelig til at inducere macrometastasis i lever og lymfeknuder med kort latenstid forbundet med afstamning switch events. Vi har således skabt den første betingede model for metastase af NSCLC og identificeret et gen, c-myc, der er i stand til at orkestrere alle trin i denne proces.

Konklusioner /Betydning

Potentielle markører til påvisning af metastaser blev identificeret og valideret til diagnosticering af humane biopsier. Disse markører kan repræsentere mål for det fremtidige terapeutiske indgreb som de omfatter gener såsom Gata4, der udelukkende udtrykt under lunge udvikling

Henvisning:. Rapp UR, Korn C, Ceteci F, Kärreman C, Luetkenhaus K, Serafin V, et al. (2009) Myc Er en Metastase Gene for ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 4 (6): e6029. doi: 10,1371 /journal.pone.0006029

Redaktør: Syed A. Aziz, Health Canada, Canada

Modtaget: April 29, 2009; Accepteret: 25 maj 2009; Udgivet: 24 juni 2009

Copyright: © 2009 Rapp et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Krebshilfe – Mildred Scheel Foundation (tilskud 106.253) og af DFG (tilskud TR17). Emanuele Zanucco blev støttet af en bevilling på det tyske Excellence Initiative til Graduate School of Life Sciences, University of Würzburg. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase er en kompleks flertrins proces, hvor celler i den primære tumor bliver i stand til at komme ind og ud af karrene, bosætte på fjerne steder og til sidst vokse til makroskopiske sekundære [1] tumorer. Det menes generelt, at metastatisk omdannelse er en mutation drevet proces. En række gener og genprodukter er blevet identificeret, der positivt eller negativt påvirke sandsynligheden af ​​etablerede humane tumorcellelinier til at metastasere [2], [3], [4]. Genprodukter indbefatter vækstfaktorreceptorer og elementer af deres intracellulære signal transduktion kaskader. Regulatorer af cellepolaritet repræsenterer en anden klasse af gener, der kan fremme metastase [5], [6]. Ved anvendelse af en muse lungecancer-cellelinie, har Lewis lungecarcinom (LLC), en tredje kategori af metastase regulatorer for nylig blevet beskrevet, at understregede vigtigheden af ​​inflammation som drivkraft [7]. Desuden kandidat metastase-inducerende eller -suppressing gener indbefatter også gener, der koder mikro RNA’er, der regulerer sæt af gener associeret med proliferation, invasion eller migration [8], [9].

Mens arbejdet med humane tumorcellelinier i mus har været oplysende, manglende viden om deres repertoire af cancer gener samt den manglende evne til at studere kinetikken af ​​spontan tumor progression i disse modeller begrænser deres anvendelighed. Vi har derfor etableret en musemodel for human ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), hvori præmaligne adenom induceres af en

RAF

transgen specifikt udtrykkes i lunge alveolær type II epitelceller [10]. NSCLC er den hyppigste human lungekræft og den største årsag til død af kræft hos mennesker. Frembringelse af sammensatte mus, der bærer foruden

RAF

andre transgener der koder for proteiner modulerende signalveje hyppigt ændringer i humant NSCLC tilladt os at optrævle to faktorer i processen med metastase, induktion af den angiogene kontakt og progression til mikrometastase forbundet med omprogrammering af tarm selector gener [11]. β-catenin blev identificeret som den kritiske switch inducer for begge trin og også fremmet invasiv vækst [11].

Som 50% af humant NSCLC bærer mutationer i gener, der koder aktivatorer af den mitogene kaskade (RAS-RAF- MEK-ERK) [12], og denne kaskade er kendt for at inducere et target-gen af ​​ß-catenin, c-MYC [13], besluttede vi at direkte undersøge evnen hos c-MYC at fremme tumorudvikling i vores RAF-drevne murine lungekræft model. Desuden MYC var kandidat, fordi det blev kendt for at påvirke omprogrammering i tumorer baseret på vores tidligere fund af RAF /MYC samarbejde i murine hæmatopoietiske system [14], [15]. Hos mennesker blev amplifikation og omlejringer af Myc gener fundet i en brøkdel af NSCLC [16]. Adskillige grupper har begyndt at evaluere c-myc i musemodeller for NSCLC. Endogen c-myc er involveret i ikke metastatisk K-Ras-induceret NSCLC som blev vist ved anvendelse af en dominant negativ c-MYC-mutant [17]. Inducerbar ekspression eller funktion af transgene c-myc påvist samarbejde med mutant K-Ras i tumorudvikling i forskellig grad [18], [19], men hverken model gav anledning til metastaser. Her viser vi, at konstitutiv eller inducerbar ekspression af c-myc i tillæg til C-RAF i type II-celler er tilstrækkelig til hurtigt at inducere metastase til lever- og lymfeknuder. Kombination c-myc og C-RAF transgener forårsagede udseende af en fænotypisk skift fra kubisk til alveolær papillære /søjleformede epitelceller (APECS), der de hurtigst voksende tumorceller og også dominerer i levermetastaser. Endvidere c-MYC inducerer produktion af VEGF ved tumorceller fører til tumorvaskularisering med usædvanlige fartøjer, der er mosaikker indeholdende PECAM-1 positive og PGP 9,5-positive endotelceller. PGP 9.5 var tidligere kendt som en markør for umodne neuroendokrine celler [20]. Metastatisk konvertering af c-myc kan rekonstrueres i cellekultur ved anvendelse af ikke-metastatiske A-549 NSCLC celler og infektion med en MYC transducerende retrovirus.

Resultater

c-myc samarbejder med C- RAF i at forårsage kræft dødsfald

for at teste, om C-RAF og c-myc samarbejde om transformation af lunge epitel type II celler in vivo, blev SPC-C-RAF BXB mus krydset med SPC-c-myc transgene mus. Observation i en periode på ≥2 år demonstrerede fremskyndet død i forbindelse (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-MYC) mus (Figur 1A), selv om graden af ​​accelerationen var mindre end tidligere set i det hæmatopoietiske system med MYC /RAF retrovira [21]. Ikke desto mindre, sammensatte mus havde en median ventetid, der væsentligt afveg fra enkelt SPC-c-myc transgene mus ved log-rank analyse. Histologisk undersøgelse på forskellige tidspunkter viste, at enkelt-transgene mus afveg i tumor overlevelse. Henviser spc-C-RAF BXB eller sammensatte mus var ensartet tumor positiv med to uger gamle, SPC-c-myc single transgene mus udviklede tumorer sent og med ufuldstændig penetrans indikerer, at c-MYC ikke er hastighedsbegrænsende for proliferation af type II-celler og /eller at responsive celler elimineres ved apoptose (figur 1B).

(A) Kaplan-Meier plot for SPC-C-RAF BXB (n = 24), SPC-c-MYC (n = 52 ), forbindelse (n = 35) og vildtype (n = 28) kuldbror kontrolmus. Log-rank analyse for procent overlevelse for sammensatte mus vs SPC-C-RAF BXB = p 0,05; SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-myc = p 0,0001; sammensatte mus vs SPC-c-myc = p 0,0001. n: antal dyr. (B) Tumorhyppigheden i SPC-C-RAF BXB (n = 51), SPC-c-MYC (n = 30), forbindelse mus (n = 109) og vildtype-kuld kontrolmus (n = 58). Log-rank analyse for tumor overlevelse for SPC-C-RAF BXB vs SPC-c-myc = p 0,0001; sammensatte mus vs SPC-c-myc = p 0,0001; vildtype vs SPC-c-myc = p 0,0001. n: antal dyr. (C) Kinetik for tumorprogression. Repræsentative lungetumor snit farvet med hæmatoxylin og eosin (H det røde felt og pile indikerer pleomorfe celler (indsat) i SPC-c-myc mus og de hvide kasser viser en søjleformet celle adenom (indsat) i sammensatte mus. Ved evaluering af invasivitet ved tumor-stroma grænseflade er de boxed områder af det tredje panel forstørret i bundpladen. Genotyper og aldre af mus som angivet. Isolerede små tumor celleklynger omkring de vigtigste tumor blev angivet med røde pile. Scale bar: 100 um. (D, E) H .. 70% af trin II og IIIA tumorer [32] i vores NSCLC model, hovedparten af ​​tumorceller er negative for dette afubiquitinerende enzym på alle stadier uafhængige af genotyper (data ikke vist) i stedet farvning synes at markere skibe i de primære tumorer af SPC-c-myc enkelt transgene og sammensatte mus (sammenlign figur S6D). Faktisk co-farvning af tumor sektioner med PGP 9.5 og PECAM-1 viste colocalisation af disse markører i de samme skibe (Figur S6E). For at undersøge, om PGP 9.5 er en markør for patologisk angiogenese, vi også farves vildtype lunge sektioner, hvor farvning blev udelukkende findes i store skibe, men ikke i kapillærer (figur S6E) i overensstemmelse med en nylig publikation viser udtryk for PGP 9.5 i menneskelig halspulsårer [33]. Vores resultater er den første rapport om forekomst af sådanne endotelceller i tumorvaskulaturen.

Den angiogene switch var formentlig ikke ledsaget af typiske epitelial mesenkymale overgang (EMT) ved tumor kanter, som vi ikke opdage celler dobbelt positive for pro SP-C og vimentin eller pro SP-C og N-cadherin (fig S8B). Endvidere E-cadherin forbindelserne af søjleformede celler i tumoren forblev intakt (figur S8A). Konsekvent vi ikke observere invasive fronter i papillære tumorer (Figur 1C). I stedet isolerede grupper af tumorceller blev fundet i nærheden af ​​de primære tumorer minder om kollektiv migration [34] (figur 1C).

Lange latency tumorer i SPC-c-myc-mus er positive for

K -Ras

eller

LKB1

mutationer

da kinetikken af ​​tumor udvikling blev forsinket i SPC-c-myc-mus i forhold til SPC-C-RAF BXB eller sammensatte mus og antallet af sene tumorer pr lunge var lavere (figur 3A) vi søgte efter sekundære mutationer. Mod dette mål, blev et panel af gener (Tekst S1), der ofte ændres i human NSCLC undersøgt i en tilfældig samling af tumorer fra ti mus, der førte til identifikationen af ​​hyppige punktmutationer i

K-Ras

LKB1

gener (figur 3B). De fleste

K-Ras

mutationer var i exon 1 og var heterozygot. Der var et tilfælde af en exon 2 mutation (figur 5B) og i tre tilfælde blev der fundet nogen mutationer i

K-Ras

eller andre gener i panelet undtagen

LKB1

(figur 3B) . I virkeligheden mutationer i exon 6 i denne tumor suppressor der er muteret i 34% af humant NSCLC [35] blev fundet i hver af tre

K-Ras

negative SPC-c-myc lungetumorer (figur 3B). Kun i ét tilfælde var

LKB1

– og

K-Ras

– mutationer fundet at sameksistere. I dette eksempel blev der observeret en anden mutation af

LKB1

som var til stede på begge alleler (Figur 3B). I alle andre tilfælde,

K-Ras

mutationer eller tilstedeværelsen af ​​onkogen C-RAF var gensidigt udelukkende med

LKB1

mutation (figur 3B). Dette fund kan antyde, at K-Ras /C-RAF signalering i type II-celler kan normalt føre til inaktivering af denne tumor suppressor. En lignende sammenhæng blev fundet mellem

K-Ras

mutationer og tilstedeværelsen af ​​onkogen C-RAF, i overensstemmelse med den gensidigt udelukkende mønster af

RAF

og

RAS

mutationer i humane tumorer [36] [37] (figur 3B).

(a) Tumor incidens pr lunge i SPC-c-myc mus som en funktion af alder. Animal numre er 17 i 2 måneder, 10 til 6-10,5 måneder og 15 for 13-17 måneder. Hvert symbol repræsenterer en individuel lunge. Bemærk at ordinaten er foci /cm

2 i modsætning til mm

2 i figur 2. (B) Forekomst af

K-Ras

LKB1

mutationer i primær lunge tumorer. 10 plukket tilfældigt tumor positive mus blev undersøgt for et panel af kandidatgener (

EGFR

,

K-Ras

,

B-RAF

,

C-RAF

,

p53

,

PI3K

,

PTEN

,

Akt

LKB1

). Vist her er data for

K-Ras

LKB1

, de eneste gener af panelet, hvor mutationer blev fundet. Zygositet er som angivet. Individuelle mus opført af ID-numre for at lette sammenligningen mellem tabeller.

Myc er tilstrækkelig til at fremkalde metastaser

Som vi tidligere har set progression til mikrometastase i SPC-C-RAF BXB mus hvor vi fremprovokeret angiogenese ved ablation af E-cadherin, vi undersøgte mus for metastase på forskellige alderstrin. Overraskende multiple makroskopiske lever- (figur 4A og 4B) og lymfeknuder lymfeknude metastaser (figur 4C) blev observeret så tidligt som ti måneder i forbindelse (SPC-C-RAF BXB /SPC-c-myc) og SPC-c- MYC enkelt trasngenic dyr. Sammensatte mus udviklede metastase væsentlig tidligere, ved højere incidens end SPC-c-MYC enkelt transgene mus (figur 5A). Betragtninger i lymfeknuder makro og mikro metastaser blev set, blev der kun makro metastaser i leveren. Lymfeknude og levermetastaser var uafhængige begivenheder, som var makro- og mikro- metastase antyder, at metastase initierende celler (MIC’er) kan variere for hver kategori (figur 5A). Udover spc-c-myc single transgene mus, Dox inducerbar ekspression af c-myc, som hurtigt giver anledning til papillære lungetumorer på C-RAF BXB baggrund (figur S4) blev undersøgt for dannelse af metastase. Disse mus udviklede lunge tumorer (Figur S9A) og levermetastaser (Figur S9C og 9d) består af søjleformede celler. I overensstemmelse med hyppigheden af ​​metastaser i konstitutive mus, i en kohorte af 10 inducerbare sammensatte mus, der blev induceret 11-12 måneder, en mus udviklet makroskopisk lever metastastasis og et andet dyr var positiv for micro metastase i en regional lymfeknude (figur S9B) . En kohorte af alders-matchet kontrol (ikke-induceret) mus, der var 14-17 måneder gamle viste ikke metastase (data ikke vist). Svarende til konstitutive mus, sektioner fra levermetastaser af inducerbare sammensatte mus (SPC-C-RAF BXB /SPC-rtTA /tet-O-c-myc) var positive for pro SP-C og pan-cytokeratin (figur S9e og S9F). I modsætning til konstitutiv mus, levermetastaser i inducerbare sammensatte mus fremkaldte en udtalt stromal reaktion, der adskiller tumorvæv fra normal lever (fig S9D). Især i denne stroma-rige grænseområdet isolerede klynger af tumorceller, der var positive for pan-Cytokeratin eller pro SP-C var til stede (figur S9e og S9F) i overensstemmelse med invasion ved kollektiv migration [34]. Ved undersøgelse af den mutations status K-Ras, blev et exon 1mutation fundet i primære lungetumorer og tilsvarende levermetastaser (data ikke vist).

(A) Inspektion af levermetastaser (venstre) fra en SpC- c-MYC enkelt transgen mus. En normal lever (højre) fra en ikke-metastatisk SPC-C-RAF BXB enkelt transgen mus. (B) H 0,05. n = 17 mus i hver gruppe. (D) Analyse af metastaser. Paraffinindlejrede sektioner af lunge, lymfeknude og levervæv fra transplanterede mus blev screenet for metastase ved hjælp cytokeratin-7 (CK-7) antistof. For at demonstrere specificiteten af ​​CK-7-ekspression i A-549-celler primære tumorer blev farvet i fravær (negativ kontrol) eller i nærvær (positiv kontrol) af CK 7 antistof. For hvert organ mindst 3 sektioner blev farvet og omhyggeligt screenet mindste af to personer. n = 17 mus i hver gruppe. Scale bar: 50 pm. (E) Forekomsten af ​​metastase. LN:. Lymfeknude

Anvendelse af mutationer i primære tumorer af SPC-c-myc enkelt transgene mus til afstamning sporing af metastaser

Opdagelsen af ​​hyppige

K-Ras

LKB1

mutationer i lungetumorer primært af SPC-c-myc enkelt transgene mus foreslog, at vi måske kunne bruge mutation data til afstamning sporing. Vi undersøgte derfor DNA’et af lever- og lymfeknudemetastaser for mutationer i primære tumorer. Overraskende i tilfælde af

K-Ras

mutationer, fire ud af de fem tilfælde af c-myc tumor afledt metastaser, der kunne undersøges på denne måde blev negativt for mutationen som det var et tilfælde af en forbindelse mus, havde en

K-Ras

exon 1 mutation i den primære tumor og metastase til lymfeknuder (figur 5B).

K-Ras

Men en ud af de fem tilfælde af positiv c-myc tumor afledt metastaser var positive for mutant

K-Ras

. Mutationen var identisk med den i lungen tumor. Denne mus havde flere organsystemer metastaser, der omfattede foruden lever, nyre, pancreas og hjerne. Endvidere metastase på forskellige steder delt ekspression af lunge markører. Figur S11 viser, at spredte pro SP-C-positive celler er til stede i fjernmetastaser i lever, pancreas, hjerne og nyre. Derudover i nyrerne blev Claracelle sekretorisk protein (CCSP) positive tumorceller detekteret (figur S11). I det ene tilfælde af en

LKB1

-mutant lunge tumor, der gav anledning til levermetastaser, metastaser scorede negative for mutationen. Det faktum, at mutationer til stede i de primære lungetumorer er for det meste fraværende i deres levermetastaser antyder kraftigt, at metastase er en tidlig begivenhed.

Histopatologi af metastaser fra SPC-c-myc enkelt transgene og sammensatte mus

til histopatologiske undersøgelse metastaser i begge genotyper var skelnes bortset fra deres overflod (figur 4A og 5A). I begge tilfælde finder vi to typer af metastaser i leveren og lymfeknuder, papillær og blandet cystisk-papillær (figur 4B). Almindeligt begge former anvende samme målorgan (figur S12). Hvorvidt disse to former kan interconvert eller om cyster er tidlige precursor former for blandet cystisk-papillær metastaser er i øjeblikket ukendt. Scale bar: 50 pm. Scale bar: 50 pm.