PLoS ONE: Dual Farmakologisk målretning af MAP kinase og PI3K /mTOR Pathway i prækliniske modeller af kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Aktiveringen af ​​MAPK og PI3K /AKT /mTOR veje er impliceret i de fleste kræftformer. Aktiverende mutationer i begge disse veje er blevet beskrevet i kolorektal cancer (CRC), hvilket således indikerer deres potentiale som terapeutiske mål. Denne undersøgelse evaluerede kombinationen af ​​en PI3K /mTOR inhibitor (PF-04.691.502 /PF-502) i kombination med en MEK-inhibitor (PD-0.325.901 /PD-901) i CRC cellelinjer og patient-afledte CRC tumor xenograftmodeller (PDTX) .

Materialer og metoder

antiproliferative virkninger af PF-502 og PD-901 blev vurderet som enkelte midler og i kombination mod et panel af CRC cellelinier med forskellige molekylære baggrunde. Synergi blev evalueret ved brug af Bliss Additivitet metoden. I udvalgte cellelinjer, undersøgte vi kombinationen virkninger på nedstrømseffektorer ved immunblotting. Kombinationen blev derefter evalueret i flere fuldt genetisk kommenterede CRC PDTX modeller.

Resultater

in vitro

eksperimenter påvist en bred vifte af IC

50 værdier for både midler mod en cellelinie panel. Kombinationen af ​​PF-502 og PD-901 demonstrerede synergistisk antiproliferativ aktivitet med Bliss værdier i tilsætningsstoffet området. Som forventet blev p-AKT og p-ERK nedreguleres af PF-502 og PD-901, hhv. I PDTX modeller, efter en 30-dages eksponering for PF-502, PD-901 eller en kombination, kombinationen vist bedre reduktion i tumorvækst i forhold til enten enkelt middel uanset KRAS eller PI3K mutationsstatus.

konklusioner

kombinationen af ​​en PI3K /mTOR og en MEK-inhibitor demonstreret forbedrede anti-proliferative virkninger mod CRC cellelinjer og PDTX modeller

Citation:. Pitts TM, Newton TP, Bradshaw-Pierce EL , Addison R, Arcaroli JJ, Klauck PJ, et al. (2014) Dual Farmakologisk Målretning af MAP kinase og PI3K /mTOR Pathway i prækliniske modeller af kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (11): e113037. doi: 10,1371 /journal.pone.0113037

Redaktør: Marie-Josée Boucher, Université de Sherbrooke, Canada

Modtaget: 19. juni 2014, Accepteret: 17 oktober 2014; Udgivet: November 17, 2014

Copyright: © 2014 Pitts et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Pfizer Inc. og University of Colorado Cancer Center Grant P30 CA046934. De finansieringskilder havde en mindre rolle i studie design og beslutning om at offentliggøre. De finansieringskilder havde ingen rolle i indsamling og analyse af data, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne af dette manuskript har læst tidsskriftets politik og have følgende konkurrerende interesser: Pfizer yder finansiel støtte til SGE for onkologiske stipendier. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

To af de mest implicerede cellulære veje i kræftformer er phosphotidylinositol-3 kinaser (PI3K) og mitogenet aktiveret proteinkinase (MAPK) veje. Klasse I (PI3K) er heterodimere lipid kinaser, der omfatter et regulatorisk p85 subunit og en katalytisk p110-underenhed [1]. PI3K phosphorylerer 3-hydroxylgruppen af ​​phosphatidylinositol, der deltager i en række forskellige signalveje vigtige for cancer såsom proliferation, differentiering, kemotaxi, overlevelse, handel, og glucosehomeostase [2], [3]. På grund af dens forskelligartede cellefunktion, er de PI3K aksen stærkt impliceret i humane kræftformer; op til 30% af alle humane cancere har en mutation i et PI3K pathway komponenten [4]. I kolorektal cancer (CRC)

PIK3CA

gen, der koder for p110α katalytiske subunit af klasse I PI3K’er er fundet, at blive muteret i 10-20% af CRC tumor prøver [5].

En downstream komponent i PI3K-signalvejen er mammalian target of rapamycin (mTOR). Cellevækst er en af ​​de primære funktioner er omfattet af mTOR; aktivering af mTOR via PI3K /AKT pathway er kritisk for cellen i balance optagelse og vækst af næringsstoffer, og afvigende hyperaktivering af denne vej bidrager til tumorigenese [6], [7]. Rolle mTOR i disse cellulære funktioner gør det til et attraktivt mål for hæmning; da udviklingen af ​​rapamycin fyrre år siden, har mange første og anden generation mTOR-hæmmere blevet syntetiseret og er i forskellige stadier af klinisk og præklinisk udvikling [8], [9].

MAPK /ERK (MEK) komplekser er bestanddele af Ras /Raf signalering akse. Signalering gennem denne vej resulterer i øget proliferation og modstandsdygtighed over for apoptose, hvorimod konstitutiv aktivering bidrager til kemoresistens i flere kræftformer [10], [11]. Mutationer i KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, eller BRAF (alle opstrøms for MEK komplekser) er meget almindelige i CRC, og er blevet fundet i 50-60% af tumorprøver [12], [13]. En række midler er blevet udviklet, der målrettet EGFR, er RAS, RAF, eller MEK, hvoraf mange er i kliniske forsøg og hvoraf nogle allerede er godkendt [14].

Krydstale mellem PI3K /AKT /mTOR pathway eksisterer: for eksempel kan PI3K aktiveres af RAS, og tumor suppressor tuberin (en negativ regulator af mTOR) er en direkte substrat af ERK [15] – [17]. Det har vist sig også at samtidig forekomst af ændringer i PI3K-AKT-mTOR og RAS-RAF-MEK pathways forekommer i en tredjedel af CRC prøver, hvilket tyder på, at samtidig inhibering af begge pathways kan være nødvendigt for terapeutisk fordel [12]. Derudover menes det, at RAS-RAF-MEK signalering akse kan virke som en kompenserende mekanisme med hæmning af PI3K-AKT-mTOR pathway, og omvendt [18], [19]. Beviserne for omfattende krydstale mellem disse veje har skabt stor interesse i simultane hæmning, med flere forskellige strategier nu i udvikling [20].

For at udforske effekten af ​​samtidige hæmning af både PI3K-AKT-mTOR og RAS-RAF-MEK veje, vi undersøgte kombinationen af ​​PF-04691502 (PF-502) med PD-0.325.901 (PD-901). PF-502 er en oralt biotilgængelig, potent ATP-konkurrence kinase hæmmer af både klasse I PI3K’er og mTOR [21], [22]. I en nylig afsluttet et klinisk fase I studie blev PF-502 fundet at være veltolereret med træthed, fald appetit, kvalme hyperglykæmi, udslæt, opkastning, diarré og slimhindeinflammation er de mest almindeligt ses bivirkninger. Men størstedelen af ​​disse var grad 1 eller 2. [23] PD-901 er en højpotent, oral, små-molekyle inhibitor af MEK1 og MEK2 der viste en vis aktivitet i tidlige kliniske forsøg og var forbundet med toksiciteter karakteristiske for denne klasse af midler : udslæt

, diarré, træthed, kvalme og synsforstyrrelser, [24]. PD-901 er i øjeblikket i fase I kliniske forsøg til behandling af CRC i kombination med PKI-587 (PF-0.521.384), en dobbelt PI3K /mTOR-hæmmer med samme styrke til PF-502 [24] – [26]. En fordel ved denne kombination er, at gennem hæmning af opstrøms PI3K, er tilbagekobling opregulering af AKT upon mTOR inhibering undgås [27].

I den aktuelle undersøgelse beskriver vi forøget anti-tumor aktiviteten af ​​den dobbelte PI3K /mTOR-hæmmer PF-502 og MEK-inhibitor PD-901 i

in vitro

og

in vivo

modeller af kolorektal cancer.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

PF-04691502 (PF-502) og PD-0.325.901 (PD-901) blev leveret af Pfizer Inc. (San Diego, CA). For

in vitro

arbejde, begge midler blev opløst i 100% DMSO ved en koncentration på 10 mM. For

in vivo

undersøgelser blev PF-502 suspenderet i 0,5% methylcellulose i vand, og PD-901 blev suspenderet i 0,5% hydroxypropylmethylcellulose, 0,2% Tween-80 i vand.

Cell linjer og Kultur

Humane kolorektale cancer cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection, DSMZ, eller den koreanske cellelinje Bank. Geo celler, der er beskrevet tidligere [28], blev venligst stillet til rådighed af Dr. Fortunato Ciardiello (Cattedra di Oncologia Medica, Dipartimento Medico-Chirurgico di Internistica Clinica e Sperimentale “F Magrassi e A Lanzara,” Seconda Università ‘degli Studi di Napoli, Napoli, Italien). KM12L4, KM12C, og KM20, tidligere beskrevet [29], blev alle venligst stillet til rådighed af Scott Kopetz (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). Alle celler blev rutinemæssigt dyrket i RPMI 1640. Alle medium blev suppleret med 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin og 1% MEM ikke-essentielle aminosyrer. Alle celler blev holdt ved 37 ° C under en atmosfære indeholdende 5% CO

2. Celler blev rutinemæssigt testet for tilstedeværelsen af ​​mycoplasma (MycoAlert; Cambrex BioScience). Alle CRC cellelinjer anvendt i denne undersøgelse er blevet fuldt karakteriseret, og godkendt i University of Colorado Cancer Center DNA-sekventering og analyse Core.

sulforhodamin B (SRB) og CyQuant celleproliferationsanalyser

Celler blev podet i 96-brønds klare plader ved 2000-8000 celler pr brønd, afhængigt cellelinje egenskaber. På CyQuant assay blev celler udpladet i sort-walled plader. Efter 24 timer blev cellerne inkuberet i 72 timer med medier kun eller varierende koncentrationer af PD-901 (0,015 pmol /L-1 pmol /L) eller PF-502 (0,08 pmol /L-5 pmol /L), som enkelte midler eller i kombination. For CyQuant assayet blev pladerne fremstillet og læses i overensstemmelse med producentens protokol (Life Technologies, Carlsbad, CA). Sulforhodamin B-assay (SRB) blev udført som tidligere beskrevet [30]. Kort fortalt blev cellerne fikseret med 10% tricholoracetic acidat 4 ° C i 30 minutter, vasket 3 gange med vand og tørres ved stuetemperatur. De blev derefter farvet med en sulforhodamin B (SRB) opløsning (0,4% w /v SRB i 1% eddikesyre) i 20 minutter ved stuetemperatur vasket 3 x med 1% eddikesyre, og resterende SRB blev solubiliseret med 10 mM upufret Tris . Absorbansen blev læst ved 492 nm, ved hjælp af Synergy 2 pladelæser (Biotek, Winooski, VT). Data blev normaliseret til absorbansen af ​​intet lægemiddel (ND). En kombination virkning blev analyseret under anvendelse af Bliss Additivitet modellen som tidligere beskrevet [31].

Caspase 3/7 Aktivitet

Caspase-Glo 3/7 Luminescent assay (Promega, Milwaukee, WI) blev anvendt som en indikator for apoptotisk aktivitet gennem caspase 3 og 7 aktivitet. Celler blev podet i hvide vægge plader ved 2000-8000 celler pr brønd, afhængigt cellelinje egenskaber. Efter 24 timer blev cellerne inkuberet i den angivne tid punkt med kun eller varierende koncentrationer af PD-901 eller PF-502 medier, som enkelte midler eller i kombination. Dataene er angivet som fold-change, normaliseret til kontrol.

klonogene assays Salg

Celler blev podet ved 2000 celler per brønd af en 6-brønds plade og får lov at binde natten over. PD-901 eller PF-502 blev tilsat som enkelte midler eller i kombination og inkuberet i 72 timer. Efter 72 timer blev cellerne vasket i komplette medier og medier uden lægemiddel blev tilsat tilbage i yderligere 72 timer. Celler blev fikseret med 100% methanol i 30 minutter og farvet med 2% krystalviolet. Den krystalviolet blev derefter solubiliseret i 1% eddikesyre, og supernatanten blev overført til en 96-brønds plade. Absorbansen blev aflæst ved 565 nm, ved hjælp af Synergy 2 pladelæser (Biotek, Winooski, VT). Dataene blev normaliseret til kontrol.

immunblotting og antistof Array

Celler blev podet i plader med 6 brønde og fik lov til at binde i 24 timer. Celler blev derefter inkuberet i 24 timer med enten PD-901 eller PF-502, eller kombinationen. Celler blev derefter vasket med PBS og lyseret med RIPA-buffer (Cell Signaling, Danvers, MA). Efter sonikering og centrifugering blev i alt 30 ug protein lysat påsat en NuPage gel (Life Technologies, Carlsbad, CA), elektroforese og overført til en nitrocellulosemembran under anvendelse af iBlot (Invitrogen, Carlsbad, CA). Membranen blev blokeret og probet natten over med primære antistoffer, vasket i 10 minutter 3 x med og probet med DyLight sekundære antistoffer (cellesignalering, Danvers, MA), og afbildes ved hjælp af Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Alle primære antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og fortyndet som pr fremstiller instruktioner. For antistoffet array, blev udskåret tumorer lyseret i RIPA-buffer under anvendelse af en FastPrep24 vævshomogenisator (MP Biologicals, Santa Ana, CA). Proteinkoncentrationen blev normaliseret og sættes til PathScan Stress og Apoptose Signaling Antibody Array som pr fremstiller instruktioner. Array blev udviklet ved hjælp af Licor Odyssey (Licor, Lincoln, NE). Intensitet af hver plet blev analyseret ved hjælp af billede Studio software (Licor, Lincoln, NE) og tætheden af ​​hver plet blev afbildet.

Patient-afledte xenografundersøgelser

Fem til seks uger gamle kvindelige atymiske nøgne mus (Harlan Labs, Indianapolis, IN) blev anvendt til alle dyreforsøg, bur i grupper på fem, holdt på en 12 timers lys /mørke cyklus, og givet sterilt mad og vand

ad libitum

. De patient-afledte xenotransplantater blev dannet som beskrevet tidligere [28]. Kort fortalt blev en tumor prøve opsamlet på tidspunktet for kirurgi fra en samtykkende patient på University of Colorado Hospital. Tumor tilbageværende materiale efter histopatologisk analyse blev skåret i 2 til 3 mm

3 stykker, nedsænket i Matrigel, og implanteret subkutant i flanken af ​​fem nøgne mus. Efter tumorer blev ekspanderet gennem mindst F3 generation, blev de udskåret, opskåret, og injiceret i venstre og højre flanker af ca. 25 mus for hver xenograft undersøgelse (50 total tumorer fordelt mellem fire grupper: vehikelkontrol, PF-502 enkeltstof , PD-901 enkeltstof, og PF-502 /PD-901 kombination). Når den gennemsnitlige tumorstørrelse nåede et volumen på ca. 200 mm

3, mus blev randomiseret i fire forskellige grupper. Mus blev overvåget dagligt for tegn på toksicitet og vejet to gange ugentligt. Behandlingen blev indgivet en gang dagligt (10 mg /kg PF-502 og /eller 1,0 mg /kg PD-901) ved oral sondeernæring. Tumor volumen (ligning for volumen = (længde × bredde

2) × 0,52) blev evalueret to gange om ugen med digitale skydelærer, ved hjælp af Study Director softwarepakke (Studylog Systems, South San Francisco, CA). Tumor vækstrater blev bestemt for hver enkelt tumor ved at montere tumorvolumen data i løbet af behandlingsperioden til en eksponentiel væksthastighed ligning med SAAM II v. 2.3. (The Epsilon Group, Charlottesville, VA). Ved afslutningen af ​​behandlingen blev musene aflivet af CO

2 overdosis efterfulgt af cervikal dislokation før fjernelse af tumorer til yderligere analyse.

Dataanalyse

En-vejs ANOVA analyser med en Tukey post-test blev anvendt til bestemmelse statistisk signifikans mellem flere grupper. Analyser blev udført med Prism-version 5.0,

p-

værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Etik Statement

Alt dyr arbejde og pleje blev udført i henhold til retningslinjerne for Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC). Specifik godkendelse musen forsøgene blev opnået med protokollen 51410 (08) 1E titlen “Udvikling og vedligeholdelse af Primary GI Tumor Bank for Designing Rational behandling ved hjælp af musen tumoreksplantater”. Alt blev gjort en rimelig indsats for at forbedre lidelse, herunder anæstesi for smertefulde procedurer. De humane tumorer blev opnået ved hjælp af Colorado Multiple Institutional Review Board (COMIRB) godkendt protokol nummer 08-0439. Samtykke til tumor hentning blev skrevet.

Resultater

Virkningerne af PF-502 og PD-901 som enkelte agenter på spredning af kolorektal cancer cellelinjer

CRC cellelinjer var udsat for stigende koncentrationer af PF-502 og PD-901 i 72 timer blev proliferation vurderes og IC

50 værdier blev beregnet ud fra gennemsnittet proliferation af tredobbelte eksperimenter. Som afbildet i figur 1 og 2 var der en større end 10-fold forskel i IC

50s mellem følsomme og resistente CRC cellelinier, som ikke korrelerer med mutationsstatus KRAS, BRAF eller PIK3CA. Fire CRC cellelinier med varierende genotyper blev valgt til yderligere analyse. Salg

Celler blev udpladet i plader med 96 brønde og fik lov til at klæbe i 24 timer. Celler blev udsat for stigende koncentrationer af forbindelse i 72 timer og proliferation blev vurderet ved anvendelse CyQuant assay. Proliferaion assays blev udført i tre eksemplarer og IC

50 værdier blev beregnet ud fra gennemsnittet proliferation. Mutationsstatus KRAS, BRAF, og PIK3CA er i farvede felter.

Celler blev udpladet i plader med 96 brønde og fik lov til at klæbe i 24 timer. Celler blev udsat for stigende koncentrationer af forbindelse i 72 timer og proliferation blev vurderet ved anvendelse SRB-assay. Proliferationsassays blev udført i tre eksemplarer og IC

50 værdier blev beregnet ud fra gennemsnittet proliferation. Mutationsstatus af KRAS, BRAF, og PIK3CA er i farvede felter.

kombinatoriske effekter af PI3K /mTORi PF-502 og Meki, PD-901 i kolorektale cancer cellelinjer

LOVO (KRAS

G13D /PIK3CA

WT), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WiDr (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), og Geo (KRAS

G13D /PIK3CA

WT) blev udvalgt til yderligere kombination analyse.

Hver af de 4 CRC cellelinier blev udsat for varierende koncentrationer af PI3K /mTORi, PF-502 og Meki PD- 901 som enkelte midler eller i kombination i 72 timer. Proliferation blev vurderet ved hjælp af CyQuant assay og inhiberingsværdier er vist i figur 3A. Kombinationen udviste større virkning på inhibering af proliferation i alle fire CRC celle testet ved forskellige koncentrationer linjer. Disse data blev bekræftet i CRC cellelinjer under anvendelse af Bliss Additivitet model. Bliss værdier blev beregnet som beskrevet i Materialer og metoder og scoren for hver kombination er præsenteret i figur 3B. HCT116, WiDr og GEO begge viser gennemsnitlige Bliss score lidt over 1 demonstrerer en større end additiv effekt (1,08 ± 0,09, 1,11 ± 0,08, 1,08 ± 0,08, henholdsvis), mens LOVO demonstrerede omtrent en additiv effekt (1,019 ± 0,08,). For at bestemme om kombinationen effekt observeret var forbundet med irreversibel inhibering af proliferation blev en klongenicitetsassayet udføres. De fire CRC cellelinier blev eksponeret for 0,6 pmol /L PF-502 og 0,3 pmol /l PD-901 som enkelte midler og i kombination. Alle fire cellelinjer udviste en reduktion i clonogenicity af kombinationen versus enten enkeltstof mens HCT116, GEO, og WiDr viste statistisk signifikante forskelle. (Figur 4).

LOVO (KRAS

G13D), HCT116 (KRAS

G13D /PIK3CA

H1047R), WiDr (BRAF

V600E /PIK3CA

P449T), GEO (KRAS

G13D). Celler blev udsat for forskellige kombinationer af PF-502 og PD-901 i 72 timer. (A) Fraktion hæmmede blev afbildet efter udsættelse for enkeltstof og kombination. (B) Bliss additivitet blev beregnet og vurdere kombinatoriske virkninger. Gennemsnitlige bliss scoringer blev afbildet.

(A) LOVO, (B) HCT116 blev (C) WiDr, og (D) GEO forgyldt i 6 brønde og udsat for enkeltstof PI3K /mTORi , PF-04691502, den Meki, PD-0325901 eller kombinationen i 72 timer. Lægemiddel blev fjernet og erstattet med medier for at give mulighed for genvækst af kloner. Celler blev derefter farvet med krystalviolet og fotograferet. (E) Det krystalviolet blev solubiliseret i 1% eddikesyre, og absorbansen blev vurderet på en pladelæser. Dataene blev normaliseret til at styre og tegnes. Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD, ANOVA Tukeys justerede p-værdier: *

s

, 0,05, **

s

0,01, ***

s

0,001 vs køretøj, #

s

, 0,05, ##

s

0,01, ###

s

0,001 vs PF-502,

s

, 0,05,

s

0,01,

s

0,001 vs PD-901. Alle data repræsenterer tre uafhængige forsøg.

Vi karakteriseret også virkningerne af PI3K /mTORi, PF-502 og Meki, PD-901 på etablerede nedstrømseffektorer af relevante veje. PF-502 har vist sig at nedsætte AKT, 4EBP1 og S6RP phosphorylering [22], hvorimod PD-901 inhiberer phosphorylering af ERK [32], [33]. For at validere effekten af ​​disse 2 midler og se efter tegn på en kooperativ effekt blev modulering af downstream mål i MAPK og PI3K veje analyseret. Som afbildet i figur 5, behandling med PF-502 eller PD-901 inducerede fald i Pakt, pS6RP, P4EBP1, og pERK hhv. Interessant, når den udsættes for den Meki, PD-901 observerede vi en mere udtalt fald i pS6RP end hvad der blev observeret i de PF-502 behandlede celler i tre ud af de fire CRC cellelinier. Disse fald blev stort set fastholdt i kombination.

Apoptose er forbedret efter eksponering for kombinationen af ​​PF-502 og PD-901 i kolorektal cancer cellelinjer

De klonogene data viste, at kombinationen resulterede i langvarig antiproliferative virkninger, således målte vi apoptose som en anden fænotypisk endepunkt. For at gøre dette, vi udsatte de fire CRC cellelinjer til 0,6 mmol /l af PF-502 og 0,3 mmol /l af PD-901 som enkelte midler og i kombination i 24 timer. Apoptose blev målt ved Caspase Glo 3/7 assay. Som vist i figur 6, selv om der var en tendens til øget apoptose med kombinationen i alle cellelinjer, i WiDr celler disse virkninger var statistisk signifikant sammenlignet med både enkelt agenter.

Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD, ANOVA Tukeys justerede p-værdier: *

s

, 0,05, **

s

0,01, ***

s

0,001 vs køretøj, #

p

, 0,05, ##

s

0,01, ###

s

0,001 vs PF-502,

s

, 0,05,

s

0,01,

s

0,001 vs PD-901. Alle data repræsenterer tre uafhængige forsøg.

antitumorvirkninger af PF-502 og PD-901 i patient afledt tumorxenoplantater

Næste for at bekræfte anti-tumor effekt observeret i vores

in vitro

model, vi udsættes fire patient afledt tumorxenoplantater (PDTX) modeller med varierende mutationsstatus til PI3K /mTORi, PF-502, den Meki, PD901, eller kombinationen. De antitumorvirkninger af hver forbindelse blev vurderet ved at bestemme væksthastigheden af ​​hver individuel tumor i hver behandlingsgruppe. Som vist i figur 7A, kun CUCRC040 model (

KRAS

G12V /PIK3CA

E542G) viste en signifikant fordel ved kombinationsbehandlingen løbet behandlinger enkelt agent (p 0,05). Kombinationen behandling var også statistisk signifikant i CUCRC108 (KRAS

G12C) og CUCRC125 (KRAS

WT) PDTX modeller sammenlignet med kontrolgruppen, men ikke i forhold til en enkelt agent behandlingsgrupper (Figur 7B-C). Og, det CUCRC042 (KRAS

G13D) model var relativt ikke reagerer på alle behandlinger (figur 7D). Tumorvækstkurver er vist i figur S1.

Hvert punkt repræsenterer en enkelt tumor. Mean tumor vækst ± standardafvigelse er repræsenteret ved bar og håndtag. Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD, ANOVA Tukeys justerede p-værdier: * P 0,05 vs. kontrol;

† P 0,05 vs. 901;

‡ P 0,05 vs. 502.

Kombinationen af ​​PF-502 og PD-901 hæmmer pro-overlevelse veje og virkninger apoptotiske markører i PDTX modeller

For at vurdere virkningerne på signalveje i PI3K /mTORi, PF-502 og Meki, PD-901 i PDTX modeller, et antistof matrix blev anvendt med lysaterne tumorer indsamlet fra gruppe for hver model ved afslutningen af ​​studiet. Tumorer blev lyseret i RIPA-buffer og påført på PathScan Stress og Apoptose Signaling Antibody Array med lige store koncentrationer. Opstillingerne blev visualiseret på en Licor Odyssey og densitet /intensitet af dobbelte spots fra tre forskellige tumorer blev normaliseret til vehikelkontrollen og plottes. Niveauer af pERK og Pakt blev nedsat i PD-901 og PF-502 behandlingsgrupper, sammenlignet med kontrol, i CUCRC040, CUCRC108 og CUCRC125 PDTX modeller, hvilket er i overensstemmelse med de tumor vækst profiler og respons observeret i disse behandlingsgrupper ( Figur 8A-B og figur S2). Desuden blev nedregulering af pERK og Pakt opretholdt i kombinationsgrupperne i disse modeller. Men kun i CUCRC040 model var niveauet af pERK i kombinationen gruppen faktisk er lavere end begge arme enkelt middel. Den CUCRC042 resistent model viste ikke nogen nedgang i pERK eller Pakt (figur 8A-B og figur S2). Interessant nok i CUCRC042 behandling med PD-901 resulterede i en stigning i Pakt og en stigning i pBAD (figur 8B-C og fig S2).

Samlet protein blev oprenset fra PDTX ved afslutningen af ​​behandlingen og vurderes en stress og apoptose antistof array. Densitet af pletterne blev opnået, og plottes. Alle data præsenteres som gennemsnit ± SD, ANOVA Tukeys justerede p-værdier: *

s

, 0,05, **

s

0,01, ***

s

0,001 vs køretøj, #

s

, 0,05, ##

s

0,01, ###

s

0,001 vs PF-502,

s

, 0,05,

s

0,01,

s

0,001 vs PD-901. Alle data er en repræsentant for tre separate tumorer fra hver gruppe.

Diskussion

Ca. 40% af tarmkræft indeholder en mutation i KRAS-genet forårsager denne vej at være konstitutivt aktiv. Andre mutationer i denne vej, herunder RAS (nationale tilsynsmyndigheder og HRAS) og BRAF omfatte et andet 1-3% og 5-15%, henholdsvis [34], [35]. PIK3CA mutationer forekommer i omkring 15% af tarmkræft, og af disse 8-9% har mutationer i både PIK3CA og KRAS [34], [36]. Med begge disse store pro-overlevelse /proliferative veje aktive i kolorektale cancere, foruden den krydstale /feedback, der opstår mellem disse veje, er der belæg for at målrette begge veje med småmolekylære inhibitorer.

hæmmere af RAS /RAF /MEK pathway har eksisteret i over et årti og en enkelt agent kliniske undersøgelser har været stort set skuffende. For eksempel vidste en fase II undersøgelse med CI-1040, en første generation MEK-inhibitor, i fremskreden kolorektal cancer ikke demonstrere signifikant antitumoraktivitet. Men en nyere fase II forsøg med anden generation MEK inhibitor selumetinib viste lignende aktivitet til det kemoterapeutiske middel capecitabin i CRC patienter [37], [38]. Med beskedne resultater til enkeltstof MEK hæmning i tarmkræft, synes det indlysende, at kombinationsbehandling bør undersøges.

Talrige prækliniske studier har vist, at målrette både RAS /RAF /MEK og PI3K /AKT /mTOR pathway er mere fordelagtig i mange tumortyper [39] – [42]. I ovariecancer co-targeting af PI3K /mTOR og RAS /MEK pathway demonstrerede en synergistisk inhibering af proliferation og induktion af celledød [42]. Tilsvarende i basale-lignende brystkræft modeller, blev en forbedret inhibering af proliferation og en stigning i apoptose observeret

in vitro

og en stigning i tumorvækst inhibering blev observeret

in vivo

[39] . De fleste af de data i kolorektal cancer har været i KRAS muterede modeller, da denne population er behov for nye nye behandlingsformer. Roper

et. al

. vist, at kombinationen PI3K og MEK hæmning fremmer apoptose og tumorregression i musemodeller for tarmkræft [41]. En anden undersøgelse i humane kolorektale PDTX modeller, viste mere af en tumor stasis effekt, med og lidt regression tyder denne kombinationsbehandling kan ikke oversætte til varige terapeutiske virkninger [40].

I den aktuelle undersøgelse vi udnyttet både kolorektal cancer cellelinjer og PDTX modeller til at demonstrere, at PI3K /MEK kombinationsterapi er mere aktiv end enkeltstofbehandling behandling i modeller for CRC med distinkte molekylære baggrunde. Både PF-502 og PD901 udstillet enkelt agent aktivitet mod i et stort panel af kolorektale cancer cellelinjer uanset RAS eller PIK3CA mutationsstatus. Når kombinationen blev testet i KRAS mutant, BRAF mutant eller KRAS /PIK3CA dobbelte mutanter var der en forbedret kombination virkning ved forskellige koncentrationer med HCT116, WiDr og GEO udviser en lidt mere robust kombinationsvirkning sammenlignet med LOVO. Evnen til at danne kolonier efter eksponering for kombinationen blev også svækket indikerer, at inhibering af disse veje fører til et cytotoksisk frem for cytostatisk fænotype. Dette blev yderligere understøttet af en stigning i apoptose i kombination. Det er interessant at bemærke, at ved behandling med Meki, PD901, et markant fald blev observeret i pS6RP i tre af de fire CRC-cellelinje-modeller. Dette kan skyldes det faktum, at TORC1 aktivitet, som bevirker S6 phosphorylering er en konvergens punkt, som inkorporerer multiple opstrøms signalveje i nogle tumortyper. For eksempel i MAPKi følsomme melanom, behandling med en Rafi eller en Meki, resulterer i nedsat PS6, mens der i de ufølsomme modeller observeres noget fald i phosphorylering [43]. Det samme kan være tilfældet i de tre PD-901 følsomme CRC cellelinier (HCT116, LoVo og WiDr) i modsætning til den mere resistent CRC cellelinje, GEO, hvilket kan indikere, at faldet pS6RP kan tjene som en markør for modtagelighed.

Næste vi skiftet vores

in vitro

data

in vivo

bruge vores CRC PDTX modeller. Disse modeller er dog at give betydelige forbedringer i forhold typiske cellelinje xenotransplantater, selvom klinisk validering er i gang [40], [44]. Svarende til

in vitro

data der var heterogene reaktioner på kombinationsbehandling med en model, CUCRC040, viser en statistisk signifikant kombination effekt. Dette var i modsætning til de CUCRC108 og CUCRC125 modeller, hvor kombinationen kun var statistisk forskellig fra køretøjet og til CUCRC042 som udviste ingen behandlingsrelaterede effekter. Interessant nok resistente PDTX model, udviste en stigning i Pakt ved behandling med den Meki, PD-901, som var forbundet med en stigning i pBAD, et protein, der kan have anti-apoptotiske virkninger og føre til øget celleoverlevelse [45]. Dette kan være værd at forfølge som en formodet modstand mekanisme.

På trods af stærke prækliniske beviser til støtte co-targeting af PI3K /mTOR og MAPK veje i flere tumortyper, har tidlige resultater af kliniske forsøg viste blandet succes [46 ] – [48]. Kombinationerne var generelt veltolereret og terapeutiske doser blev opnået med tidlig tegn på anti-tumor aktivitet hos patienter med fremskreden modermærkekræft og lav kvalitet serøs ovariecancer, mens patienter med kolorektal cancer tumor krympning blev sjældent dokumenteret.

i et fase i studie, kolorektal cancer patienter gennemgik prospektivt molekylær profilering for mutationer i KRAS, BRAF, PIK3CA og ekspressionsniveauer af PTEN og pMET. Disse patienter blev derefter tilbydes først-i-menneskelige fase I studier baseret på resultaterne af disse ændrede genetiske /protein udtryk profiler. De valg omfattede anden generation anti-EGFR mAbs (hvis KRAS wild-type), PI3K pathway hæmmere (hvis PIK3CA mutation eller lav PTEN udtryk), mTORC1 hæmmer plus anti-IGF1R mAb (hvis lav PTEN udtryk), PI3K pathway hæmmere plus MEK inhibitorer (hvis KRAS eller BRAF mutation), BRAF inhibitor (hvis BRAF mutation) og anti-HGF mAb (hvis høj pMET ekspression) [49].