PLoS ONE: Single-polymorfismer i Wnt og BMP Veje og endetarmskræft Risiko i en spansk Cohort

Abstrakt

Baggrund

Tyktarmskræft (CRC) betragtes som en kompleks sygdom, og dermed hovedparten af ​​den genetiske modtagelighed menes at ligge i form af lav-penetrans varianter efter en polygen model af arv. Kandidat-gen studier har hidtil været en af ​​de grundlæggende metoder er truffet for at identificere disse modtagelighed varianter. Konsekvent at inddrage nogle signalering ruter carcinogenese ydet støtte til pathway-baserede undersøgelser som en naturlig strategi for at vælge gener, der potentielt kan skjule ny modtagelighed loci.

Metode /vigtigste resultater

Vi valgte to vigtigste carcinogenese-relaterede veje: Wnt og BMP, for at screene de implicerede gener for nye risikogrupper varianter. Vi derefter gennemført en case-kontrol forening studie i 933 CRC tilfælde og 969 kontroller baseret på kodning og lovgivningsmæssige SNP’er. Vi inkluderede også rs4444235 og rs9929218, som ikke opfylder vores udvælgelseskriterier, men tilhørte to gener i BMP-vejen og havde konsekvent været forbundet med CRC i tidligere undersøgelser. Hverken allel, viste heller genotypiske eller haplotypiske analyser nogen tegn på sammenhæng mellem de 37 screenede varianter og CRC risiko. Justeringer til køn og alder, og stratificeret analyse mellem sporadiske og kontrolgrupper ikke gav nogen positive resultater enten.

Konklusioner /Betydning

På trods af relevansen af ​​de to veje i patogenesen af ​​sygdommen, og det faktum, at dette faktisk er den første undersøgelse, der anser disse veje som kandidat-gen valg tilgang, er vores undersøgelse ikke nogen beviser for forekomsten af ​​lav-penetrans varianter for de valgte markører i nogen af ​​de betragtes gener i vores kohorte .

Henvisning: Fernández-Rozadilla C, de Castro L, Clofent J, Brea-Fernández A, Bessa X, Abuli A, et al. (2010) Single-polymorfismer i Wnt og BMP Pathways og Kolorektal Cancer Risk i en spansk Kohorte. PLoS ONE 5 (9): e12673. doi: 10,1371 /journal.pone.0012673

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: May 20, 2010; Accepteret: August 6, 2010; Udgivet: 9 September, 2010

Copyright: © 2010 Fernández-Rozadilla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Fondo de Investigacion Sanitaria /EFRU (05/2031, 08/0024, 08/1276, PS09 /02368), Xunta de Galicia (PGIDIT07PXIB9101209PR, Ministerio de Ciencia e Innovacion (SAF 07-64.873), Asociacion Espanola contra el Cancer (Fundacion Cientifica y Junta de Barcelona), og Fundación de Investigacion Medica Mutua Madrilena. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de vigtigste former for kræft, er den næsthyppigste neoplasme i begge køn og en af ​​de vigtigste sygelighed årsager i den vestlige verden [1]. Den genetiske bidrag til CRC er blevet anslået til at være omkring 35% af omfattende twin undersøgelser [2]. Men meget penetrerende varianter, der forårsager mendelske disposition syndromer, kun tegner sig for højst, 5% af tilfældene sygdom [3]. Den resterende genetiske modtagelighed menes at følge en polygen model, med et samspil af flere lav penetrans allelvarianter optræder i høj frekvens i den almindelige befolkning, og hver giver en beskeden effekt på sygdomsrisiko [4], [5].

Candidate-gen undersøgelser har været en af ​​de mest almindeligt anvendte værktøjer i screeningen for nye varianter påvirker CRC risiko. Gene valg i disse studier er primært baseret på de funktionelle konsekvenser af en mulig sammenhæng, og dermed gener valgt er enten blevet valgt på grund af den tidligere tilstedeværelse af andre høje /alleler lav risiko [6], eller deres deltagelse i en sti impliceret i sygdommens patogenese [7]. Kandidat-gen undersøgelser kan udføres ved enten direkte fremgangsmåder, hvor varianterne genotypede formodes at være den underliggende årsag til sygdommen på grund af deres placering (varianter i exoniske eller regulatoriske regioner) eller ved indirekte metoder, hvor tag SNPs udnytter de bindingsuligevægt egenskaber af det menneskelige genom at forsøge at screene mest af variationen i et givent gen.

Denne sidste tilgang har også tilladt, sammen med udviklingen af ​​avanceret teknologi, implementering af ny hypotese -fri tilgange (i opposition med hypotese-baserede kandidat-gen tilgange), som dækker størstedelen af ​​genomet (genom-dækkende forening undersøgelser eller GWAS). Denne implementering har med succes ført til identifikation af nogle nye modtagelighed loci [8] – [14], herunder rs4444235 og rs9929218, der falder inden for rækkevidde af to gener, der tilhører BMP-vejen. Ikke desto mindre disse er blevet fundet, at forudsige kun en lille del af sygdommen modtagelighed, med endnu de resterende at blive opdaget [15].

Vi dermed til formål at finde sådanne modtagelighed varianter gennem en kandidat-gen tilgang screening en valgte antal varianter inden for to cellulære veje, der har konsekvent været knyttet til CRC tumorogenesis: den Wnt og BMP signalveje [16], [17]

Wnt vej indeholder gener, der har længe været kendt for at. være ansvarlig for nogle arvelige CRC syndromer, såsom

APC

og familiær adenomatøs polypose [18]. Desuden er somatiske ændringer i

APC

der findes i næsten 80% af de sporadiske colorektale cancere og Wnt signalering aktivering er involveret i den bedste del af sporadiske colorektale carcinomer [19]. På den anden side, BMP-vejen virker som positiv regulator af nogle af de Wnt proteiner [17], og tumor undertrykkende rolle denne signalvej i patogenesen af ​​CRC og andre kræftformer er veletableret [20], [21]. Desuden mutationer i to af sine gener,

Smad4

BMPR1A

, er ansvarlige for unge polypose syndrom, en anden arvelig CRC tilstand [22]. I betragtning af alle disse oplysninger, vi troede, det ville være interessant at screene nogle af den genetiske variabilitet inden for disse veje for tegn på nye CRC relaterede varianter, der kunne forklare det mindste en del af de manglende arvelighed. Vores tilgang var primært funktionelle, kun SNPs inden exon eller

cis

reguleringsmyndigheder sekvenser (5 ‘og 3’ unstranslated regioner) blev udvalgt til at analysere deres forhold til CRC modtagelighed.

Resultater og diskussion

Efter vores vej-baserede kandidat-gen udvælgelsesmetode, udførte vi vores undersøgelse i alt 45 SNPs, der var i enten exoniske eller lovgivningsmæssige regioner i en samlet af 21 gener fra både Wnt og BMP veje. Nærmere oplysninger om SNP funktioner og foreningens værdier for de 37 SNPs der bestået kvalitetskontrolkriterier vises på tabel 1. Ingen af ​​de screenede SNPs var signifikant associeret med en ændret risiko for CRC, overvejer odds-ratio og relaterede p-værdier for allel og genotypiske tests (trend, dominante og recessive). Logistisk regression for alder og justering sex blev udført, selv om det ikke blev bedre p værdi resultater. Haplotypeanalyse resultaterne var konsekvente i både unphased og Haploview, og viste ingen tegn på positive associationer enten til en af ​​de 8 gener for der blev udført denne analyse (

AXIN1

,

HDAC9

,

BMP4

,

DACT1

,

CDH3

,

CDH1

,

BTRC

, og

APC)

, (Figur S1). Stratificering analyse sammenligner sporadiske og familiære tilfælde blev også gennemført, men det gav ikke noget bevis for forskelle i modtagelighed mellem grupperne, der kunne være et tegn på nogen specifikke foreninger under en af ​​grupperne (tabel 2).

således vores strategi har ikke formået at afsløre eventuelle nye modtagelighed loci for CRC risiko.

Pathway-baserede forventninger har vist sig at være ganske nedslående i litteraturen så godt, for stærk kandidat veje, såsom DNA-reparation dem, overraskende undladt også at identificere nye risici varianter [7], [23] – [24]. Ud over dette er de fleste af de genetiske varianter, der er blevet fundet at være associeret med sygdom er placeret i intergeniske regioner, med potentielle funktioner, som er endnu ukendte.

Still, i lyset af de seneste opdagelser, der følges op analyse af genom-dækkende data, både Wnt og BMP har tjent en fornyet berømmelse. Følsomheden locus fundet på 8q24 (rs6983267) har været knyttet til en forbedret Wnt signalering gennem dens samspil med TCF4 [25], [26], og en meta-analyse udført på en række GWAS data lykkedes at knytte to varianter i

BMP4

CDH1

genregioner med sygdommen (rs4444235 og rs9929218 henholdsvis) [8].

Selv om dette er faktisk den første forening undersøgelse, der betragter veje som helhed for gen udvælgelse, nogle af de gener, der indgår i vores analyse (dvs.

APC, CCND1

,

CDH1

og

TCF7

) allerede var blevet screenet for risikofaktorer alleler [ ,,,0],6], [27] – [30]. Det er ganske bemærkelsesværdigt, at der har været en voksende debat om nogle af disse loci, specielt p.V1822D variant i

APC Hotel (rs459552). Denne missense ændring er bredt dokumenteret i litteraturen, med nogle undersøgelser forsvare det som neutral (denne undersøgelse og andre) [31], og nogle giver sin mindre allel en beskyttende virkning [6], [28]. Mangel på passende undersøgelse magt, har resulterende fra utilstrækkeligt antal prøver været et stort problem i mange af disse undersøgelser, og dermed de fleste af dem har ikke leveret meget overbevisende resultater [32].

Selvom vores undersøgelse havde over 80% magt at opdage eller så lavt som 1,21 med mindre allel frekvenser på 0,30 (57% af vores SNP’er), og 1,24 for MAFs ned til 0,2 (78% af SNP’er), under antagelse af en log-additiv model og α = 0,05, var vi ude af stand til at opdage eventuelle positive associationer tyder tilstedeværelsen af ​​eventuelle nye CRC modtagelighed varianter. Ikke desto mindre er det ganske bemærkelsesværdigt, at, om end vores manglende evne til at replikere foreningerne for

BMP4

CDH1

SNPs, dette er den første undersøgelse, der undersøger en af ​​de såkaldte 10 nye GWAS -discovered modtagelighed loci i en sydlige-europæiske befolkning.

på trods af vores negative resultater, må vi overveje, at vi ikke overhovedet omfattende dække alle mulige lav penetrans varianter inden for de udvalgte gener. Dette skyldes primært det faktum, at vores strategi var rent funktionel, vælge varianter, der var

a priori

gode kandidater til at være direkte forbundet med sygdommen. Dette faktisk kan udgøre en begrænsning i undersøgelsen, for det meste af den genetiske variation i loci ikke blev undersøgt. mener derfor, at vi bør gøres en yderligere indsats for at screene en bredere vifte af loci inden for disse veje, specielt i betragtning af de foregående positive associationer beskrevet hidtil for både Wnt og BMP-relaterede gener.

Pondering de potentielle odds forhold mellem de beskrevne hidtil varianter (1.11, CI 1.08-1.15 og 0,91, CI 0.89-0.94 for rs4444235 og rs9929218 henholdsvis), antager vi større årgange kan være nødvendigt at opdage sådanne subtile effekter. På den anden side, når man overvejer kandidat-gen tilgange, ville det også være nyttigt at meta-analyse tidligere undersøgelser og træk oplysninger på tværs af dem helt i søgningen af ​​beviser på potentielle nye veje knyttet til patogenesen af ​​sygdommen.

Materialer og Metoder

undersøgelse befolkninger

emner var 933 CRC patienter og 969 kontroller, der tilhørte den EPICOLON projekt, et prospektivt, multicenter, populationsbaseret epidemiologi undersøgelse studere forekomsten og funktioner i familiær og sporadisk CRC i den spanske befolkning [33]. Sager blev udvalgt på tværs 11 hospitaler i Spanien som alle patienter med en

de-novo

histologisk bekræftet diagnose af kolorektal adenocarcinom og der deltog 11 community hospitaler i hele Spanien mellem november 2006 og december 2007. Patienter hos hvem CRC udviklet i forbindelse med familiær adenomatøs polypose eller inflammatorisk tarmsygdom, og dem, hvor patienter eller familie nægtede at deltage i undersøgelsen, blev udelukket. Demografiske, kliniske og tumorrelaterede karakteristika probander, samt en detaljeret familiehistorie blev opnået under anvendelse af en forud fastsat spørgeskema, og er registreret i en enkelt database. Af disse 592 (63%) var mænd og 341 (37%) kvinder. Median alder for sager var 73 (spændvidde 26-95), mens betyde var 71 (SD ± 10,7). Hospital-baserede kontroller blev rekrutteret sammen med sager og blev bekræftet at have nogen kræft eller tidligere har haft neoplasma, og ingen familie historie CRC. Alle kontroller blev tilfældigt udvalgt og matches med tilfælde for køn og alder (± 5 år) i et 01:01 forhold. Begge sager og kontroller var af europæisk afstamning og fra Spanien.

Etik erklæring

Undersøgelsen blev godkendt af “Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia”, og hver af de institutionelle anmeldelse bestyrelser de hospitaler, hvor prøverne blev indsamlet ( “etiske komité i Hospital Clínic-Barcelona”, “etiske komité af Hospital del mar-Barcelona”, “etiske komité i Hospital tyske Trias i Pujol-Barcelona”, “etiske komité i Hospital Sant Pau-Barcelona “,” etiske komité i Hospital Universitari Arnau de Vilanova-Lleida “,” etiske komité i Sygehus Generelt-Alicante “,” etiske komité i Hospital de Donosti “,” etiske komité i Hospital General de Asturias -Oviedo “,” etiske komité i Hospital klinisk-Zaragoza “,” etiske komité i Hospital de Calahorra-La Rioja “,” etiske komité i Sygehus Meixoeiro-Vigo “). Alle prøver blev opnået med skriftligt informeret samtykke gennemgået af etiske bestyrelse den tilsvarende hospital

DNA-ekstraktion

DNA blev opnået fra frosne perifert blod.; ekstraktion blev udført i en Chemagen robot (Chemagen Biopolymer-Technologie AG, Baesweiler, Tyskland) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger, på den galiciske Public Fundation af Genomisk Medicin i Santiago de Compostela. Cases og kontroller blev udvundet i blandede partier for at undgå enhver form for partiskhed.

Kandidat-gen valg

Både Wnt og BMP veje blev oprindeligt udvalgt efter resultaterne af Nishanian et al. [34], som påviste interaktionen mellem disse to veje. Begge veje blev grundigt undersøgt gennem Cancer Genome Anatomi Project websted [35], men vi kunne ikke finde nogen oplysninger om BMP-vejen i enten denne eller andre webbrowsere. Derfor blev Wnt gener udvalgt ved at gennemse vejen gennem Biocarta [36], mens BMP generne måtte være strengt udvalgt fra tidligere litteratur [17], [34]. Fyrre-én gener blev endeligt udvalgt til at indgå i analysen.

SNP udvælgelse og genotyping

udvælgelseskriterier SNP kun betragtes funktionelle markører med mindre allelfrekvenserne over 0,05 og mindst to uafhængige valideringskriterier som fastsat i dbSNP [37]. Dette omfattede alle exoniske varianter er valgt med Pupasuite [38] og gen-regulatoriske regioner i

cis Hotel (5’or 3’UTR ender), som defineret af FESD webbrowseren [39]. 5’UTR varianter blev kun medtaget, da de opfyldte de ovennævnte kriterier og blev formodes at være i det potentielle bindingssted af en kendt transctiptional bindende faktor. 3’UTR varianter blev medtaget på grund af deres potentielle forhold med miRNA-bindende regioner [40]. Fordi nogle af de udvalgte gener havde ingen SNPs på sådanne slags i nogen af ​​de tre browsere på tidspunktet for SNP udvælgelse, havde de i sidste ende at være faldet ud af undersøgelsen. Endelig blev 43 SNPs vælges inden 21 gener skal screenes som potentielle direkte modifikatorer af CRC modtagelighed (tabel 3).

rs4444235 og rs9929218 er to varianter liggende i de nær-ved og intron regioner

BMP4

CDH1

henholdsvis som for nylig er blevet rapporteret at være forbundet med sygdommen [8]. I betragtning af, at de SNPs, som vi havde valgt inden for disse to gener ikke var gode taggers for disse to varianter (R-kvadreret værdier var 0,6 for SNPs i

BMP4

, og 0,02 for dem i

CHD1

) (Figur 1), besluttede vi at inkludere dem i vores undersøgelse så godt, selv om de ikke opfyldte vores udvælgelseskriterier, hvilket gør det samlede antal forhørt SNPs stige til 45.

R-squared relationer mellem SNP par:. A. rs4444235-rs17563 i

BMP4

og B. rs9929218-rs1801552 i

CDH1

Genotypning blev udført med MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, USA) teknologi i Santiago de Compostela node i den spanske Genotypning center. Opkald af genotyper blev udført med Sequenom Typer v4.0 software ved hjælp af alle data fra studiet samtidigt.

statistiske analyser

Kvalitetskontrol blev udført, først ved at udelukke både SNPs og prøver med genotype succes på under 95%, med hjælp fra Genotypning data Filter (GDF) [41]. Genotypiske distributioner for alle SNPs i kontroller var i overensstemmelse med Hardy-Weinberg ligevægt som vurderes ved hjælp af en X

2 test (1

df). Alle p-værdier var de opnåede ≥0.05, hvilket udelukker muligheden for genotypebestemmelse artefakter (data ikke vist). Populationsstratificering blev vurderet med Structure v2.2 [42]. Kort fortalt blev posibility forskellige scenarier testet under antagelse et forskelligt antal underliggende populationer (k i området fra 1 til 4), der giver mulighed for et stort antal iterationer (25 K i indbrændingsperioden efterfulgt af 500 K gentagelser). Den logaritmiske middelværdi sandsynlighed blev estimeret for de data for en given k (benævnt L (K)) i hver kørsel. Vi så godt udført flere kørsler for hver værdi af k computing det samlede gennemsnit L (K) og dens standardafvigelse. Alle resultater syntes at være overensstemmende med den oprindelige antagelse af en enkelt eksisterende befolkning. Desuden blev yderligere procedurer for bedre confounding variable visualisering foretaget ved hjælp af en Principal Component Analysis (PCA) ved hjælp af EIGENSOFT værktøjet

smartpca

[43], selv om antallet af markører var meget lav. Der blev ikke fundet af befolkningen lagdeling mellem cases og kontroller til enten struktur eller de første 10 komponenter i PCA analyse (figur S2). Efter kvalitetskontrol 1746 prøver (854 tilfælde og 892 kontroller) og 37 SNPs forblev for yderligere analyser.

Association tests blev udført ved chi-squared test for hver eneste SNP og haplotyper hvor det er muligt med både Haploview v4.0 [ ,,,0],44] og unphased [45]. Kort sagt, LD mønstre på tværs af gener, hvor mere end én SNP blev genotypede blev kontrolleret Haploview og testet for association hjælp unphased (for at kontrollere i nogen af ​​haplotyperne var forbundet) og Haploview (for at se, hvilke af de haplotyperne var forbundet). Genotypiske forening tests, logistisk regressionsanalyse til sex og justering alder, og stratificeret analyse mellem sporadiske og familiær grupper blev estimeret med Plink v1.03 [46]. OR og 95% konfidensintervaller blev beregnet for hver statistik, og at behandle spørgsmålet om multiple-test, permutations- tests og Bonferroni korrektion blev brugt. Undersøgelse magt blev estimeret med CATS software [47].

Støtte Information

Figur S1.

Haplotype struktur og analyse for de 8 gener, hvor mere end én SNP blev genotype. Tabellen viser foreningens værdier for hver SNP genereret af Haploview

doi:. 10,1371 /journal.pone.0012673.s001

(3,40 MB TIF)

Figur S2.

Principal komponent analyse plot for første vs. anden komponent, sammenligne vores case og kontrolpopulationer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0012673.s002

(0,96 MB TIF)

Note S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0012673.s003

(0,03 MB DOC)

Tak

Vi er oprigtigt taknemmelig for alle patienter, der deltager i denne undersøgelse, som blev ansat i 11 spanske hospitaler som en del af EPICOLON projektet. Vi takker Maria Magdalena-Castro (MMC), Olga Lortes (OL) og Eva Fernández (EF) for deres fremragende teknisk bistand.