PLoS ONE: CXCR2 Hæmning Kombineret med Sorafenib Forbedret Antitumor og Antiangiogenisk respons i prækliniske modeller af kræft i æggestokkene

abstrakt

Antiangiogenisk terapi er vigtig til behandling af gynækologiske cancer. Men den terapeutiske fordel stammer fra disse behandlinger er forbigående, hovedsageligt på grund af den selektive aktivering af kompenserende proangiogene veje, der fører til en hurtig udvikling af resistens. Vi havde til formål at identificere og målrette potentielt alternativ signalering til anti-vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) terapi med henblik mod at udvikle en kombination af antiangiogeniske midler til at stille udvidede terapeutiske fordele. Vi udviklede et præklinisk

in vivo

fænotypisk resistens model af ovariecancer resistente over for antiangiogenisk terapi. Vi målte dynamiske ændringer i secernerede chemokiner og angiogen signalering i tumorer og plasma som reaktion på anti-VEGF behandling, som tumorer fremad fra den indledende responsive fase til progressiv sygdom. I tumorer, der progredieret efter behandling med sorafenib, gen- og protein ekspressionsniveauer af proangiogene CXC chemokiner og deres receptorer var signifikant forhøjet sammenlignet med responsive tumorer. Chemokinet (C-X-C-motivet) ligand 8 (CXCL8), også kendt som interleukin-8 (IL-8) stigning var tidsafhængig og faldt sammen med dynamikken i tumorudvikling. Vi anvendte SB225002, en farmakologisk inhibitor af chemokin (CXC-motivet) receptor 2 (CXCR2), at forstyrre CXC chemokin-medieret funktioner af ovariecancerceller i

in vitro

assays af cellevækstinhibering, kugleformet dannelse, og celle migration. Kombinationen af ​​CXCR2 inhibitor med sorafenib førte til en synergistisk inhibering af cellevækst

in vitro

, og yderligere stabiliseret tumorprogression efter sorafenib

in vivo

. Vores resultater antyder, at CXCR2-medierede kemokiner kan være en vigtig kompenserende pathway, der fremmer resistens over for antiangiogenisk terapi i ovariecancer. Således samtidig blokering af denne proangiogen cytokin vej ved hjælp CXCR2 inhibitorer og VEGF receptor (VEGFR) pathway kunne forbedre resultaterne af antiangiogenisk terapi

Henvisning:. Devapatla B, Sharma A, Woo S (2015) CXCR2 Inhibition Kombineret med Sorafenib Forbedret Antitumor og Antiangiogenisk respons i prækliniske modeller af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 10 (9): e0139237. doi: 10,1371 /journal.pone.0139237

Redaktør: Domenico Ribatti, University of Bari Medical School, ITALIEN

Modtaget: 10 juni, 2015; Accepteret: 10. september 2015; Udgivet: 28 September, 2015

Copyright: © 2015 Devapatla et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af National Institutes of General Medical Sciences i National Institutes of Health i henhold Award nummer P20GM103639. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den hyppigste dødsårsag fra gynækologiske kræftformer i USA Ved behandling med nuværende standard-of-care kemoterapi, de fem-års overlevelse på fremskreden sygdom er fortsat lav. Æggestokkene tumorer er rigt vaskulariserede; eksisterer en sammenhæng mellem mikrovaskulær tæller og biologiske aggressivitet [1, 2]. Angiogenese spiller en central rolle i både normal ovariefunktion og udviklingen og progressionen af ​​ovariecancer [3]. Tumorangiogenese er kritisk for ascites udvikling og æggestokkræft metastase i det peritoneale rum [4]. Som angiogenese er et kritisk trin i udbredelsen af ​​malign tumorvækst og metastase [5], angiogenese er en gyldig mål i behandlingen af ​​ovariecancer [6]. Flere proangiogene faktorer fremme processen med dannelse fartøj med VEGF som en central aktør i tumor medieret angiogenese [5]. En række antiangiogene midler, herunder terapeutisk antistof mod VEGF bevacizumab og multi-målrettede kinase hæmmere af VEGF-receptorer (VEGFR), har været aktivt undersøgt eller er i udvikling som behandlinger for fremskreden sygdom. Behandling med bevacizumab forudsat en progressionsfri overlevelse (PFS) fordel i fremskreden kræft i æggestokkene, når det gives i kombination med kemoterapi [7, 8]. Adskillige VEGFR-targeting multi-kinase hæmmere såsom nintedanib, trebananib, pazopanib, sunitinib, sorafenib, cediranib er blevet testet i forskellige faser af kræft i æggestokkene kliniske forsøg [9]. Nogle af disse midler, herunder pazopanib, nintedanib, cediranib, og trebananib, er blevet evalueret i randomiserede kliniske fase III studier, og alle har vist en progressionsfri overlevelse (PFS) fordel [10]. Men den terapeutiske fordel af anti-VEGF-terapi er kortvarig. Tumor progression er sidst restaureret efter en indledende respons, hvilket indikerer spirende modstand. Forstå mekanismerne i tumorundvigelse fra anti-VEGF behandling er afgørende for at finde strategier til at omgå resistens. Adskillige mekanismer er involveret i erhvervet resistens over for anti-VEGF behandling, herunder aktivering af alternative veje til at omgå VEGF hæmning, hvorved genoptage tumorangiogenese og tumorvækst [11]. Således kan kombinere forskellige antiangiogene terapier være en strategi til at give varige terapeutiske fordele.

Mange vækstfaktorer, som er involveret i æggestokkene invasion kræft er også fremtrædende i sin angiogenese [4]. Inflammatoriske chemokiner spiller en vigtig rolle i angiogenese og progression af ovariecancer. Samspillet mellem kemokiner produceret af ovariecancerceller og kemokinreceptorer udtrykkes af endotelceller og tumormikromiljøet fremme tumorvækst ved at stimulere angiogenese og forøgelse migration, invasion, og celleproliferation [12-14]. Blandt chemokin delmængder, CXC chemokiner med 3-aminosyre (Glu-Leu-Arg /ELR) motiv (ELR

+), herunder CXCL1, 2, og 3 (GRO-α, β og γ), CXCL5 , CXCL6, CXCL7, og CXCL8 (IL-8), er potente regulatorer af angiogenese og medierer deres angiogen aktivitet gennem kemokinreceptoren CXCR2 [14]. Overekspression af proangiogene kemokiner og CXCR2 var korreleret med dårlig prognose hos patienter med ovariecancer [12, 15-17]. Således ELR

+ CXC proangiogen kemokin veje er et potentielt alternativ til fremme angiogenese i tumorer i æggestokkene.

For at identificere effektive strategier til at omgå den mekanisme, hvormed ovariecancer omgår anti-VEGF behandling, genereret vi en xenograft model af antiangiogenisk terapi modstand, der nøje efterligner klinisk resistens over for ovariecancer. Vi identificerede ændringer i cytokin og angiogene veje i tumorer er resistente over for antiangiogeniske terapier, som tumorer udviklet sig fra den indledende responsive fase til den ildfaste fase. Vores

in vitro

in vivo

resultater viste, at co-targeting CXCR2 proangiogen cytokin akse med anti-VEGF hæmning er en effektiv strategi til at stille udvidede terapeutiske fordele i prækliniske modeller af æggestokkene kræft.

Materialer og metoder

Celler og reagenser

SKOV-3 æggestokkræft cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection. A2780 og OVCAR429 ovariecancerceller blev venligst stillet til rådighed af Dr. Danny Dhanasekharan (Stephenson Cancer Center, OUHSC). Den A2780 ovariecancer cellelinje blev oprindeligt opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). OVCAR429 er ovariecancerceller, som tidligere er blevet offentliggjort [18, 19]. A2780 og OVCAR429 celler blev holdt i RPMI-medium (Invitrogen). SKOV-3-celler blev opretholdt i McCoys 5A-medium (Invitrogen). Medier blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (Invitrogen), 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen) ved 37 ° C i en fugtig inkubator indeholdende 5% CO

2. Humane umbilical vene endotelceller (HUVEC’er) og endotheliale celle medier blev købt fra Cell Applications (San Diego, CA). Sorafenib blev opnået fra LC Laboratories (Woburn, MA). SB225002 (

N

– (2-hydroxy-4-nitrophenyl) –

N

‘- (2-bromphenyl) urea) er en potent og selektiv ikke-peptid-inhibitor af CXCR2 (IL 8R) kemokinreceptor. SB225002 blev indkøbt fra Tocris Bioscience (Bristol, UK). Drug forberedelserne til sorafenib og SB225002 blev udført i overensstemmelse med metoderne beskrevet andetsteds [20, 21].

Dyr og narkotikabehandling

Seks uger gammel kvinde athymiske

nu /nu

nøgne mus blev købt hos Charles River Laboratories, Inc., gennem NCI (Frederick, MD). Alle procedurer, der involverer mus blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), og protokollen blev godkendt af University of Oklahoma Health Sciences Center (OUHSC) Institutional Animal Care og brug Udvalg (Protokol nummer: 12-154-H). Mus fik subkutane injektioner af 5 × 10

6 SKOV-3 celler i højre flanke. Tumor størrelse blev målt to gange ugentligt ved hjælp af digitale skydelære (Mitutoyo) med en nøjagtighed på ± 0,02 mm. Tumor volumen blev beregnet som 4/3 π længde x bredde x højde. Mus blev behandlet med saltvand eller sorafenib når tumorerne nåede ca. 80 mm

3 volumen, 32 dage efter tumorcelleimplantation. Sorafenib blev administreret dagligt ved oral sondeernæring ved en dosis på 30 mg /kg. Behandlingen fortsættes, indtil tumorerne voksede til 20 mm (den maksimale vækst tilladte ved IACUC), på hvilket tidspunkt blev musene aflivet. Xenotransplantattumorer at øget mindre end 50% af det oprindelige tumorvolumen ved starten af ​​behandlingen blev betragtet behandling-responsiv, da dette viste en langsigtet tendens mod tumorstase [22]. Tumorer, der skred med en langsigtet tendens til fortsat vækst efter en indledende reaktion på behandlingen blev anset for at vise nye fænotypisk behandling-resistens. På forskellige tidspunkter anvendte vi retroorbital punktur at indsamle omkring 30 pi blod i EDTA-holdige rør til bestemmelse af tiden profiler af cirkulerende cytokiner og angiogene faktorer. Dyrene blev bedøvet før retroorbital blodprøvetagning under anvendelse af 2% isofluran i et inhalationskammer reguleres med et kalibreret fordamper. Musene blev monitoreret dagligt og aflivet, når der var nogen beviser for, at musen havde smerter fra tumoren eller narkotika eller hvis tumorbelastning nåede 20 mm. De tidlige eutanasi endpoints inkluderer moderat eller svær toksicitet, herunder hurtigt vægttab på mere end 10% af kropsvægten, gradvis vægttab på mere end 15%, svaghed, ikke-lydhørhed, åndedrætsbesvær, alvorlige abnorme neurologiske tegn, blødning, traume eller manglende evne til at spise eller drikke. Efter otte ugers narkotika behandling blev alle musene aflivet ved hjælp af CO

2 kvælning og obduceret. Blod og tumorvæv blev indsamlet til de nedenfor beskrevne analyser. Plasma blev isoleret og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse.

I

in vivo

kombinationsstudie, SKOV-3 xenotransplantater blev behandlet med 30 mg /kg /dag sorafenib indtil fremkomsten af fænotypisk resistens som defineret ovenfor. Sorafenib-resistente dyr blev randomiseret i tre grupper til at modtage sorafenib, SB225002, eller en kombination af sorafenib og SB225002. SB225002 blev administreret en gang dagligt ved intraperitoneal (IP) injektion i en dosis på 10 mg /kg. Kombinationsbehandling gruppe dagligt fik en oral dosis på 30 mg /kg sorafenib plus 10 mg /kg SB225002 (IP), indtil afslutningen af ​​undersøgelsen.

Cytokine og angiogen vækstfaktor multiplex assay

Vi udføres en multipleks-assay at identificere ændringer i cirkulerende niveauer af angiogene vækstfaktorer i behandlingsrelaterede følsomme og resistente dyr. Plasmakoncentrationerne af tumor- og stroma /vært-stammer angiogene vækst proteiner blev separat bestemt ved anvendelse humane (Millipore, kat # HAGP1MAG-12K) og mus (Millipore, kat # MAGPMAG-24K) angiogenese /vækstfaktor-magnetisk perle paneler henholdsvis. I alt 17 mennesker og 24 mus opløselige angiogene faktorer blev kvantificeret. En liste over kvantificerede analytter findes i de understøttende metoder (S1 File). De opløselige niveauer af CXC chemokiner CXCL1, 2, 5 og 6 i mus plasmaprøver blev bestemt via en multiplex assay (Bio-Rad, katalog nr 171- AK99MR2).

Vækst inhiberingsassay

In vitro

cellevækstinhibering blev målt via MTS assay (Promega). Kort fortalt, 5 x 10

3 HUVEC eller SKOV-3-celler blev podet i plader med 96 brønde og inkuberet natten over. Vi tilsat forskellige koncentrationer i området fra 0,01 til 100 uM af sorafenib eller SB225002 til 100 pi frisk medium og inkuberet cellerne i den angivne tid. Vi tilsat 20 pi CellTiter 96 vandige opløsning reagens og inkuberes cellerne i 1 time. Absorbans blev målt ved 450 nm. Cellelevedygtighed blev beregnet i forhold til kontroller (celler behandlet med bærer alene). Gennemsnit af tre gentagelser per prøve blev anvendt til analyse.

Den samlede virkning af sorafenib og SB225002 blev bestemt under anvendelse af forskellige ovariecancerceller og HUVEC’er. IC

50 værdier blev bestemt for begge lægemidler med hver cellelinie. Den øverste koncentration af kombinationen blev fremstillet ved blanding af sorafenib og SB225002 ved 1: 2-forhold af deres IC

50 for ovariecancerceller og 1: 1 forhold til HUVEC’er baseret på deres IC

50 værdier. Seriel fortynding (3x) blev udført fra toppen koncentration til opnåelse af i alt 5 fortyndinger (

n

= 3 replikater). Cellerne (5000 celler /brønd) blev derefter inkuberet ved 37 ° C i 48 timer. Celleoverlevelse blev undersøgt under anvendelse MTS assay som beskrevet ovenfor. Arten af ​​kombinatoriske virkninger af de to lægemidler blev bestemt ved at beregne kombinationen indeks (CI) værdier, som kendetegner synergi (CI 1), additivitet (Cl = 1), eller antagonisme (Cl 1), under anvendelse af CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, UK).

Angiogenese kanaldannelse assay

vækstfaktor-reduceret Matrigel matrix (Corning) blev optøet ved 4 ° C natten over og derefter bunden overtrukket i en 96-brønds plade (50 pi per brønd) ved 37 ° C i 30 minutter. Dernæst blev 100 pi medium indeholdende HUVEC’er (10.000 celler), med eller uden sorafenib, og SB225002 tilsat til hver brønd på toppen af ​​den størknede Matrigel matrix og inkuberet ved 37 ° C i 16 timer. Brønde blev fikseret i 4% paraformaldehyd og netværk blev afbildet ved hjælp af et fasekontrast-mikroskop. Til kvantificering af netværk, blev WimTube software, der bruges (Wimasis).

Transwell migration assay

Cell migration blev udført ved hjælp af 8-um-pore transwell indsatser (Corning) som tidligere beskrevet [23 ]. Til de nedre kamre blev 500 pi endothelial vækstmedie tilsat. Alikvoter af 2 × 10

4 HUVEC’er i 200 pi endotel basalt medium blev podet i de øvre kamre. Både øvre og nedre kamre indeholdt sorafenib eller SB225002 ved de angivne koncentrationer. Efter assayet kørte i 24 timer ved 37 ° C blev ikke-migrerede celler fjernet fra den øvre overflade af filteret under anvendelse af vatpinde. Celler på den nedre overflade af membranen blev fikseret med iskold methanol og farvet med krystalviolet. Celler blev talt under et optisk mikroskop (× 40).

Sfæroide assay

SKOV-3 celle sfæroider blev dyrket ved hjælp af den flydende overlay metoden [24]. Celler blev udpladet i agarose-coatede plader med 96 brønde indeholdende 200 pi medium (2000 celler /brønd). Celler blev inkuberet i 72 timer, indtil sphæroider er dannet. Celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af sorafenib eller SB225002. Hver anden dag, vi udskiftet 100 ul gamle medium med frisk medium og narkotika. Sfæroider blev overvåget i op til 10 dage. Størrelserne af sfæroider blev målt ved hjælp af ImageJ software (https://imagej.nih.gov/ij/).

Immunhistokemi

Immunhistokemi (IHC) data kvantificering er beskrevet i de understøttende metoder ( S1 fil). Vi bruges antistoffer specifikke for CD-31 (Abcam, cat # ab28364) og Ki-67 (Abcam, cat # ab16667) for at bestemme mikrokar densitet og tumorcelleproliferation hhv. En komplet CXCR2 ekspression i tumorceller og stromaceller blev bestemt i mus xenotransplantattumorer anvendelse af anti-CXCR2-antistof (Abcam, cat # ab14935).

genekspression af ELR

+ CXC chemokiner

transkriptom sekventering blev udført ved hjælp af Illumina MiSeq sequencer og Illumina TruSeq RNA v2 prøveforberedelse kit og protokoller (Illumina, Inc.). Prøveforberedelse og bibliotek konstruktion er beskrevet i de understøttende metoder (S1 File).

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med middelværdi ± standardafvigelse (SD) værdier under anvendelse t-test, medmindre andet er anført. Statistisk signifikans blev sat til

P

0,05. Drug kombination data blev analyseret ved CalcuSyn software ved hjælp af median-effekt-metoden af ​​Chou og Talalay [25]. Immunhistokemi data blev analyseret under anvendelse ImageJ software. Korte metoder er givet i de bagvedliggende data. Vi brugte GeneSifter software (Geospiza, Inc.) til at analysere data fra vores studier af genekspression i xenotransplantattumorer.

Resultater

In vivo

fænotypiske tumor resistens mod antiangiogenisk behandling

Vi observerede tumorvækstinhibering i op til tre ugers behandling med sorafenib (fig 1A). Efter denne indledende responsiv periode, nogle svulster begyndte forløber, som det fremgår af forøget tumorstørrelse trods af fortsat behandling. Over behandlingen periode på to måneder, viste 10 af 19 (53%) xenograft mus tumor progression og genvækst. Ingen af ​​musene blev syg eller døde før den eksperimentelle slutpunkt. Data fra IHC-farvning afslørede typiske antiangiogene-resistente signatur i tumorvæv (figur 1B). Tumor fartøj densitet (CD-31), og celleproliferation (Ki-67) var signifikant højere (2-4 fold,

P

0,05) i tumorer, der udviklet sig fra behandlingen end i responsive tumorer (Fig 1C), hvilket antyder, at de progressive tumorer var i stand til at genoptage angiogenese og derved tumorgenvækst.

A) SKOV-3 xenotransplantater blev behandlet i otte uger med 30 mg /kg sorafenib via daglig oral sondeernæring. Kontroller blev behandlet med behandlingen vehikel alene. Tumorvolumener blev målt to gange om ugen og er repræsenteret som mm

3 ± SEM. Ud af 19 mus, 10 udviklet resistens over for sorafenib behandling. Sort, rød og grønne linjer angiver de gennemsnitlige tumor volumen progressioner af kontrol, SR, og SS mus hhv. En væsentlig forskel i tumor volumen (*

P

0,05) blev observeret mellem behandlings–resistente og følsomme grupper, der starter i uge fem af behandlingen. SS = sorafenib-følsom; og SR = sorafenib-resistente. B) Repræsentant immunfarvning for CD-31 (øverste række), og Ki-67 (nederste række) i kontrol, sorafenib-følsom (SS), og sorafenib-resistente (SR) tumorer. C) Fartøjs densitet (CD-31) og spredning indeks (Ki-67) blev forøget betydeligt i sorafenib tumorer sammenlignet med sorafenib-følsomme tumorer.

Dynamiske ændringer af cirkulerende angiogene faktorer som svar til anti-VEGF behandling

at identificere ændringerne i udskilt angiogene og cytokin signalering, vi sammenlignet cirkulerende angiogene faktor koncentrationer i plasma prøver fra behandlingsrelaterede følsomme og resistente mus. Prøver blev opnået i løbet af de reagerende (2-3 uger efter behandling) og ildfaste faser (6-8 uger efter behandlingen). Fordi tumorvaskulatur i xenografter er dannet af mus endotel stamceller, vi brugte multiplex angiogene paneler til både mus og mennesker, til at skelne oprindelsen.

I de første tre uger af behandlingen, var der ingen signifikante forskelle mellem koncentrationer af angiogene proteiner i nogle grupper (fig 2A). Når fænotypisk resistens opstod 6-8 uger efter behandling, angiogene faktor forskelle var tydelig mellem grupperne. Forskellige mus-stammer angiogene faktorer, herunder fibroblastvækstfaktor (FGF) -2, hepatocytvækstfaktor (HGF), KC, og prolactin, blev opreguleret i sorafenib-resistente gruppe, men ikke i sorafenib-følsomme gruppe (Fig 2A) . Under den ildfaste fase, tumor-secernerede CXCL8 (IL-8) -niveauer steg 4 folder (

P

0,05). I sorafenib tumorer

A) Fold ændringer i cirkulerende angiogene faktorer mellem behandling-resistente og følsomme grupper under lydhør (2-3 uger) og resistente (6-8 uger) faser i mus behandlet med sorafenib. Både mus (stroma) og human (tumorcelle) opløselige angiogene faktorer blev kvantificeret ved multiplex assay. Kun angiogene faktorer, der blev detekteret fra både mus og menneskelige arrays er repræsenteret som Log

2 fold ændringer i behandling-resistent versus behandling følsomme xenografter. Signifikant (

P

0,05) ændringer mellem lydhøre og modstandsdygtige faser er angivet med stjerne (*). B) Time-afhængig sammenligning af plasma-IL-8-koncentration (pg /ml ± S.D.) mellem behandlingsresistente (SR) og-sensitive (SS) grupper af mus behandlet med sorafenib. Tidsprofiler af plasma IL-8 var i overensstemmelse med tumorudvikling af fænotypiske-resistente og-følsomme tumorer. Under behandling blev plasma opsamlet ugentligt af forskudte prøveudtagningsmetode, og IL-8-niveauer blev målt ved hjælp af multipleks assay. C) Illumina sekventering analyse af mennesker og mus ELR

+

CXC

chemokin genekspression. Menneskelig ELR

+

CXC

chemokin genekspression analyse viste, at

CXCL6

udtryk var signifikant højere i den resistente gruppe (2,5 gange højere,

P

0,05) end i den følsomme gruppe. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem sorafenib-følsomme og resistente grupper for CXCL1, 2, 3, 4, 5, og 7 ekspressionsniveauer. Mus ELR

+

CXC

chemokin genekspression analyse viste, at alle angivne cytokiner, undtagen

Cxcl2

, var signifikant højere i resistente grupper ( 2 folder,

P

0,05) end de følsomme grupper. SS = sorafenib-følsom; og SR = sorafenib-resistente. D) CXC-kemokin plasmakoncentrationer (pg /ml) i SKOV-3 xenograft-mus. CXCL1, CXCL2, og CXCL6 niveauer signifikant (

P

0,05). Højere i sorafenib-resistente grupper end i sorafenib-følsomme grupper

Vi kvantificerede også IL-8 niveauer ugentligt i op til otte uger af sorafenib behandling. For op til 4 ugers sorafenib administration, vi fandt ingen signifikante forskelle i IL-8 niveau mellem behandlingsgrupperne-følsomme og resistente grupper (Fig 2B). Fra uge fem, signifikant forhøjet (

P

0,05) niveauer af IL-8 blev noteret i sorafenib-resistente tumorer. Disse resultater indikerer, at IL-8 niveauer dynamisk ændret sig over tid, hvilket faldt sammen med den tid profil tumor progression. Foruden IL-8, data fra vores genekspression undersøgelse (Fig 2C) og cytokin multiplex assay (Fig 2D) viste, at ekspression af andre ELR

+ CXC chemokiner (f.eks CXCL1, -2, -5, og – 6) var høj i behandling-resistente tumorer, sammenlignet med deres modparter.

CXCR2 udtryk i ovarietumorer

Vi udførte CXCR2 farvning i xenotransplantattumorer sorafenib behandlinger til at sammenligne sit udtryk (fig 3A) i følsomme og resistente grupper. CXCR2 ekspression blev forhøjet i tumorer i forhold til følsomme og kontrol tumorer. Vi observerede en tredobling af tumorer i forhold til følsomme tumorer (

P

0,05, figur 3B). I sorafenib behandlingsgruppen

A) Repræsentant immunfarvning for CXCR2 i kontrol, sorafenib- følsom (SS), og sorafenib-resistente (SR) tumorer. B) CXCR2 ekspression blev forhøjet i sorafenib tumorer (

P

. 0,05) sammenlignet med sorafenib-følsomme tumorer

In vitro

synergistiske virkninger af sorafenib og SB225002

på baggrund af ovenstående resultater af opregulering af CXCR2 udtryk og flere ELR

+ CXC proangiogene cytokiner, der formidler deres angiogene effekter via CXCR2 receptor, vi undersøgte CXCR2-medieret cytokin effekter ved hjælp SB225002, en lille molekyle hæmmer af kemokinreceptoren CXCR2 (IL-8R), i kombination med sorafenib

in vitro

. Vi valgte CXCR2 receptor inhibitorer end anti-CXC chemokin antistoffer for at undgå redundante funktion af ELR

+ CXC kemokin signalering. Kombinationen af ​​sorafenib og SB225002 producerede signifikant højere væksthæmning (

P

0,005) i tumorceller og HUVEC’er end gjorde enten behandling alene (Fig 4A og 4B). De Cl-værdier ved forskellige koncentrationsforhold i SKOV-3 (0,32-0,61) og HUVEC’er (0,87-1,1) indikerede synergi eller additivitet mellem SB225002 og sorafenib. IC

50 værdier af sorafenib og SB225002 i de testede ovariecancer cellelinjer og HUVEC’er findes i de understøttende data (S1 tabel). Koncentration-effekt-kurverne for kombinationsbehandlingen sammenlignet med sorafenib alene er vist i S1 Fig.

SB225002 væsentligt forbedret vækstinhiberingen virkninger af sorafenib på SKOV-3 (A) og HUVEC (B) celler. A) En kombination af 10 uM sorafenib og 4 uM SB225002 synergistisk hæmmede væksten af ​​SKOV-3 celler sammenlignet med hvert lægemiddel alene (

P

0,005). B) En kombination af 4 uM sorafenib og 2 uM SB225002 synergistisk hæmmede væksten af ​​HUVEC celler sammenlignet med hvert lægemiddel alene (

P

0,01). C) Repræsentative billeder af dannelse rør assay af HUVEC’er behandlet med eller uden 1 pM SB225002 eller 2 pM sorafenib. Tube formation blev analyseret under anvendelse Wimtube analysesoftware og slangestykket præsenteres i pixels. Tilsætning af SB225002 til sorafenib behandling inducerede et statistisk signifikant fald i formation HUVEC’er rør (

P

0,005). Data er vist som middelværdi rørlængde i pixels ± S.D. af tre uafhængige forsøg. D) Repræsentative billeder af HUVEC’er migration assay under anvendelse Transwell kammer. At kvantificere migrerende celler blev tre uafhængige områder af migrerende celler pr fotograferet under fasekontrastmikroskop. Antallet af celler pr blev talt, og gennemsnittet. Celletællinger er udtrykt som andelen af ​​celler migreret til undersiden af ​​Transwell kammer med resultaterne fra kontrolceller givet som 1. Den inhiberende virkning af sorafenib (2 uM) om migration blev forbedret betydeligt ved 1 uM SB225002 (

P

0,01). E) Spheroidal vækst hæmmes af CXCR2 hæmning i SKOV-3 celler. Sfæroide områder blev målt ved anvendelse ImageJ software. Værdierne er repræsenteret på Y-aksen er pixels ± standardafvigelse af tre uafhængige forsøg.

Endothelial rør dannelse og migration er vigtige egenskaber for tumor angiogenese. Vi udførte transwell kammer migration assays og Matrigel-baserede rørdannelse assays under anvendelse HUVEC’er at evaluere antiangiogene potentiale af sorafenib og SB225002 i kombination. Som vist i fig 4C sorafenib (2 uM) og SB225002 (1 uM) kombinationsbehandling næsten fuldstændig undertrykt HUVEC kanaldannelse. Kombinationen af ​​sorafenib og SB225002 signifikant hæmmede endotel rørlængde sammenlignet med sorafenib (≥ 2 gange,

P

0,005) eller SB225002 (≥ 3 gange,

P

0,005) alene. Desuden skyldes Transwell migration assay viste, at SB225002 signifikant forstærkede sorafenib-medieret hæmning af endotel migration (Fig 4D). Denne kombination forårsagede en cirka dobbelt fald i HUVEC’er migration sammenlignet med sorafenib og SB225002 behandlinger alene (

P

0,01). Tilsammen indikerer disse resultater, at kombinationsbehandling af sorafenib og SB225002 væsentlig grad kan forringe angiogene potentiale HUVEC’er

in vitro

.

Da IL-8 spiller en rolle i tumor celle sammenlægning, vi udførte en klumpformet assay at studere virkningerne af sorafenib og SB225002 på klumpformet vækst. SB225002 forstyrret dannelsen af ​​SKOV-3 sfæroider på en 2 uM koncentration: sorafenib ikke (Fig 4E). En kombination af sorafenib og SB225002 reducerede væksten af ​​sfæroider (Fig 4E).

SB225002 og sorafenib kombinationsbehandling i sorafenib-resistent xenograft mus

Vi evalueres yderligere effekten af ​​kombineret behandling i sorafenib- resistente tumorxenoplantater

in vivo

. Vi behandlede mus med sorafenib indtil xenotransplantattumorer udviklet resistens. Efter 46 dages sorafenib behandling, mus med sorafenib tumorer modtaget sorafenib, SB225002, eller en kombination af de to lægemidler. Tumorer behandlet med sorafenib alene skred frem, men gjorde det langsommere end kontrol- tumorer (Fig 5). Tumor progression var signifikant undertrykt da SB225002 blev tilføjet til sorafenib (figur 5). Ved afslutningen af ​​behandlingen, tumorerne fra mus, som modtog kombinationsbehandlingen var 42% mindre i volumen end tumorer fra mus, der modtog sorafenib alene. Interessant, behandling med SB225002 alene ikke hæmme tumorvækst, der skred fra sorafenib behandling, hvilket tyder på behovet for fortsat blokering af VEGF signalvejen. Vores resultater viser, at den kombinerede CXCR2 inhibering med sorafenib effektivt afhjælpes tumorprogression og billede forlænget terapeutisk fordel.

SKOV-3 xenotransplantater blev behandlet med en daglig dosis på 30 mg /kg sorafenib indtil tumorer udviklede fænotypiske resistens mod behandlingen (~ 46 dage). Mus med tumorer blev derefter randomiseret i grupper til at modtage et af følgende: 30 mg /kg sorafenib alene (

n

= 6), 10 mg /kg SB225002 alene (

n

= 6 ), eller sorafenib plus SB225002 (

n

= 6). Pilen angiver starten af ​​behandlingen på dag 46. Tumor volumen blev målt ved de angivne tidspunkter og præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse Kombinationen sorafenib og SB225002 førte til 42% reduktion i tumorvækst i forhold til sorafenib alene (

P

0,05).

Diskussion

Angiogenese spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​kræft i æggestokkene. Ovarietumorer er rigt vaskulariseret, og en høj grad af tumorangiogenese i ovarietumorer forudsiger dårlig klinisk resultat [1, 2, 26]. Ovarietumorer overudtrykke proangiogene faktorer, herunder VEGF’erne, FGF’er, angiopoietin, blodpladeafledte vækstfaktorer (PDGF’er), og flere pro-angiogene cytokiner [10]. Til dato har opmuntrende resultater blevet opnået med ovariecancer undersøgelser inkorporerer VEGF-pathway hæmmere, den terapeutiske antistof bevacizumab og små molekylære receptor tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) [27]. Tilføjelse bevacizumab til kemoterapi reducerede risikoen for sygdom forværring og /eller død med 62% sammenlignet med kemoterapi alene [8, 28]. Dette fund førte til den seneste FDA godkendelse af bevacizumab i kombination med kemoterapi i recidiverende sygdom.