PLoS ONE: Simulering af Swansons Litteratur-Based Discovery: Anandamide Behandling inhiberer vækst af mavekræft celler in vitro og in silico

Abstrakte

Swanson litteratur-baserede opdagelse fokus på at genoplive tidligere offentliggjort, men forsømt viden. I denne undersøgelse foreslår vi en totrins model af opdagelsesprocessen og generere en hypotese mellem anandamid og gastrisk cancer. Endvidere blev potentielle forhold bekræftet ved opfølgende eksperimenter. Den anandamid behandling resulterede i cellecyklus omfordeling af gastriske cancerceller. Vigtigst var variationen af ​​cellecyklus medieret af nogle gener fra B-form af den lukkede opdagelse, hvilket indikerer den potentielle rolle for B-vilkår. Swanson litteratur-baserede opdagelse samler ikke kun data for mulige interaktioner, men giver også mulighed for at observere større baggrunden bag disse direkte links og er et uvurderligt opdagelse værktøj for efterforskere

Henvisning:. Dong W, Liu Y, Zhu W, Mou Q, Wang J, Hu Y (2014) Simulering af Swanson litteraturpris-Based Discovery: Anandamide Behandling inhiberer vækst af mavekræft Cells

In vitro

i Silico

. PLoS ONE 9 (6): e100436. doi: 10,1371 /journal.pone.0100436

Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italien

Modtaget: Januar 12, 2014 Accepteret: 25. maj 2014 Udgivet: 20 Jun 2014

Copyright: © 2014 Dong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af den kinesiske Geriatrisk Oncology Society (onkologi program, tildeler CGOS-03-2013-1-1-00600). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den hurtige udvikling af videnskab har ført til en eksponentiel vækst i vores vidensbase. Derfor er det meget udfordrende for medicinske efterforskere til at hente og indarbejde de mest relevante, opdaterede oplysninger fra den daglige syndflod af publiceret litteratur. For eksempel, det samlede antal publikationer indekseret af søgeordet “mavekræft ‘steg mere end 4 gange i 2012 i forhold til 1980. Ofte de mest relevante oplysninger tendens til at blive overset eller forsømt i aktuelle undersøgelser [1]. Derudover, med stigende specialisering inden for videnskab og teknologi, der findes større udfordringer i at dele information på tværs af funktionelt, som den videnskabelige forståelse bliver mere fokuseret og mindre diversificeret. Dog skal en meningsfuld sammenhæng eksisterer mellem de forskellige forskningsområder. Derfor er det mere vigtigt at bestemme den ignorerede viden end de oplysninger vækst selv [2].

Swanson (1990) udviklet og implementeret et nyt redskab til at udvinde det eksisterende videngrundlag for urapporteret eller underrapporteret relationer, og genoplive tidligere offentliggjort, men forsømte hypoteser, en proces kendt som litteratur-baserede opdagelse [3]. Denne proces fungerer som en måde at forbinde 2 tilsyneladende uafhængige resultater, andet er anført i denne form: hvis “A er relateret til B” og “B er relateret til C”, så den hypotese, at “En forårsager C” stærkt foreslået [4 ]. Selv om denne fremgangsmåde ikke giver et afgørende bevis, opdagelsen er i sig selv meget nyttige i at afdække hidtil ukendte relationer [5]. Endvidere kan det hjælpe efterforskerne adgang kontekst og mine viden, som måske ikke blive afsløret ved hjælp af en traditionel søgning.

I den foreliggende undersøgelse, vi udførte en 2-trins tilgang til at simulere Swanson litteratur-baserede opdagelse metode i to områder af biologisk forskning litteratur, der normalt ikke bibliografisk tilsluttet: mavekræft og psykologi. Mavekræft er en af ​​de mest almindeligt diagnosticeret kræft, den næststørste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, og et alvorligt sundhedsmæssigt problem [6]. Tidligere forskning har også vist, at en række psykologiske faktorer kan have en betydelig indvirkning på fysiske sygdomme. Imidlertid har forholdet mellem mavekræft og psykologi tidligere blevet negligeret. Derfor blev disse 2 forskningsområder valgt med det mål at finde et forsømt fælles forbindelse.

2-trins discovery proces genereres en hypotese om sammenhængen mellem anandamid og gastrisk kræft og forudsat en mulig fælles molekylær netværk, som kan mediere virkningerne. Hypotesen blev derefter undersøgt eksperimentelt. Anandamid viste sig at hæmme væksten i 4 gastrisk cancer cellelinjer, herunder BGC823, SGC7901, AGS, og N87. Flowcytometri data viste, at tilstedeværelsen af ​​anandamid inducerede G2 /M standsning af cellecyklus i AGS og N87-celler. Endvidere har vi bekræftet, at anandamid kan virke til at regulere cellecyklus forbundne gener, herunder CHEK1, CDKN1A, CDKN2A, opnået fra den lukkede søgeprocessen. Tilsammen indikerer disse data, at anandamid påvirker cellecyklusfordeling af gastriske cancerceller ved at regulere B-terms cellecyklus regulatorer, der gjaldt som valideret eksperimentelt i denne undersøgelse, hvorved der tilvejebringes undersøgere med en alternativ synspunkt med hensyn til rollen af ​​anandamid. Ved hjælp af denne metode, var vi i stand til at sammenstykke en tidligere skjult sammenhæng mellem 2 forskellige områder og tilføje til den samlede videnbase.

Metoder og Materialer

Artiklerne i MEDLINE databasen

The National Institutes of Health (NIH) -sponsorerede MEDLINE /PubMed database indeholder links til artikler publiceret i mere end 5500 førende tidsskrifter. At erhverve den mest komplette serie af artikler til “mavekræft,” et rummeligt serie af søgestrenge (Neoplasma, mave eller mave Neoplasma eller Neoplasmer, mave eller Neoplasmer, Gastric eller Gastric Neoplasmer eller gastrisk Neoplasma eller Neoplasma, Gastric eller Kræft i mave eller mavekræft eller mavekræft eller kræft, mave eller Kræft, mave eller mavekræft eller Gastric Cancer eller kræft, Gastric eller Kræft, og Gastric eller gastrisk kræft eller mave Neoplasmer) blev anvendt til at hente de passende artikler. Denne søgning hentet 86,536 poster (adgang den 27. oktober, 2011), som omfattede alle publikationer indgået denne database. Derudover at erhverve den mest komplette serie af artikler til “psykologi”, et rummeligt serie af søgestrenge (psykologi eller bivirkninger, psykologisk eller psykologisk bivirkninger eller psykisk bivirkning eller bivirkning, psykologisk eller psykosociale faktorer eller faktor; Psykosocial eller Faktorer ; Psykosocial eller Psykosocial Factor eller psykologiske faktorer eller faktorer Psykologiske eller faktor, og Psykologiske eller psykologiske faktor eller psykologer eller psykolog) hentet 911,793 poster. Alle disse publikationer blev reddet i Medline format til opsamling mesh (mesh) vilkår.

MeSH termer

MeSH er kontrolleret ordforråd tesaurus af National Library of Medicine. MeSH består af sæt af termer kaldes deskriptorer, der er arrangeret i både alfabetiske og hierarkiske strukturer, derfor kan MeSH termer identificere det primære fokus for offentliggørelsen, og kan bruges til at indeksere Medline poster. I denne undersøgelse blev disse deskriptorer filtreret ved hjælp af en MeSH stoplist af 5.569 deskriptorer specifikke for de fagområder af denne undersøgelse.

Stoplists

En stoplist er en liste over ord, der skal udelukkes, enten fordi de er for brede eller er meningsløse som mål for en søgning. Stoplists kan omfatte så mange som flere hundrede funktionelle ord, der ikke er underlagt orienteret. I denne undersøgelse blev en lang stoplist af 5.569 ord kompileret til at filtrere MeSH termer. Brug MeSH kategorier leveret af Medline-databasen og investigator dom, vi samlet lister over stop-vilkår, med de øverste niveau MeSH kategorier, der vises i tabel kan findes 1. Nærmere oplysninger om MeSH kategorier på http: //www.nlm.nih .gov /maske /2012 /mesh_bro-wser /MeSHtree.Dhtml.

Åbn opdagelse proces

den åbne opdagelse begynder med en videnskabelig problemstilling og generering af en hypotese. I denne undersøgelse blev udvalgt områderne mavekræft og psykologi at søge efter skjulte relationer. Vi hentede publikationerne vedrørende mavekræft og psykologi som tidligere beskrevet. Dernæst blev MeSH profil konstrueret til at indlede A eller B emne. Vi konstrueret topic profiler ved at identificere en relevant delmængde af karakteristiske udtryk fra udvælgelsen af ​​teksten. Vilkår blev udvundet fra dokumenterne og vurderet for deres relative betydning som deskriptorer for emnet. I denne undersøgelse, vores profiler var vægtede vektorer af MeSH termer, som vist nedenfor for et emne X

i:

(1), hvor m

j repræsenterer en MeSH term, w

i , j repræsenterer dens vægt, med i alt n betingelser i MeSH ordforråd [7].

Efter emner a og B blev konstrueret, den endelige kombination-en C-profil-blev konstrueret ved anvendelse af en Java-applet, som vi udviklede sig. I denne fremgangsmåde blev begreber, der fremgår i både A- og B-profiler slået sammen med udtryk, som kun var til stede i en profil. Endelig MeSH termer der var kun til stede i B-profil og sjældent dukkede op i En profil blev udvalgt og kaldes C-profil. Vilkårene i C-profil viste tætte forbindelser med emne B og få eller ingen links til emnet A. Med andre ord, disse begreber forblev tæt forbundet med “psykologi”, men blev sjældent rapporteret sammen med “mavekræft.” Men tidligere urapporteret kan eksistere forbindelser, som kan afdækkes ved hjælp af den efterfølgende procedure

lukket opdagelse proces

den lukkede opdagelse proces blev udført ved hjælp af web-baserede model Arrowsmith (http:. //arrowsmith.psych. uic.edu/arrowsmith_uic/index.html, University of Illinois, Chicago, Psykiatrisk afdeling), som er designet til at hjælpe med forståelsen og anerkendelsen af ​​skjulte forbindelser mellem A og C litteratur komponenter [8], [9]. Vi indledte den lukkede opdagelse proces med de første 2 Medline søgninger ved hjælp af Arrowsmith behandling: Et emne profil søgning og C sigt litteratursøgning. Dernæst Arrowsmith programmet genereret en liste over udtryk, der kunne findes i titlerne på både A og C litteratur søgninger. Disse ord blev analyseret for at generere en B-liste, med en tredjeparts filtrering skridt, ved:

vælge bestemte semantiske kategorier (Aktiviteter Behaviors, Anatomi, Genes Molekylær sekvenser og Gene Protein Navne; Kemi og amp; Narkotika; Fysiologi),

fjerne B-vilkår, der optrådte færre end 5 gange i enten litteratur

udelukkende holder B-termer, der først dukkede op i de sidste 10 år;

fjerne B-vilkår har samhørigheds- litteratur scores mindre end 0,1.

Endelig genereret vi vores liste over B-koncepter og derefter ses de tilsvarende AB og BC litteratur søgninger.

Celledyrkning

De cellelinjer, der anvendes i nærværende studie var alle gastrisk kræft cellelinjer. De N87 og AGS cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). AGS cellelinje blev afledt fra fragmenter af en tumor resekteret fra en patient, som var en 54-årig hvid kvinde og havde modtaget nogen tidligere behandling. N87 cellelinje blev afledt fra en levermetastase af en brønd differentieret mave carcinom i en kaukasisk mand taget før kemoterapi. AGS og N87 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). De cellelinier BGC823 og SGC7901 blev etableret i Kina. Den BGC823 cellelinje blev etableret i 1984 gennem 60 passager af cellekultur i periode på 2 år fra en kirurgisk eksemplar af en mavekræft patient, der blev diagnosticeret som lav differentieret adenocarcinom. SGC7901 cellelinje blev etableret i 1979 og stammer fra en lymfe metastase af gastrisk adenocarcinom af en 56-årig kinesisk kvinde. De BGC823and SGC7901 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS); Alle cellelinjer blev opretholdt ved 37 ° C i 5% CO

2.

Flowcytometrisk analyse af cellecyklus status og apoptose

AGS og N87-celler (1 x 10

5) blev rutinemæssigt høstet ved trypsin fordøjelse efter behandling med anandamid (Sigma, A0580), vasket med PBS og fikseret i koldt 75% ethanol ved 4 ° C natten over. Efter farvning med propidiumiodid (PI) opløsning i 30 minutter, blev cellecyklusanalyse udført ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at bestemme procentdelen og fordelingen af ​​celler i G1, S og G2 /M-faser.

til påvisning af phosphatidylserin eksternalisering, trypsinerede celler var dobbelt-farvet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret Annexin V (20 ug /ml) og PI (50 ug /ml) ifølge fabrikantens protokol (Biosea, Nelson, New Zealand ). Ti tusind celler blev indsamlet og analyseret af FACSorter, og cellecyklus-profiler blev analyseret ved hjælp af Cell Quest software (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

MTT assay

BGC823, SGC7901, AGS, og N87-celler blev udpladet i 96-brønds kulturplader og inkuberet med anandamid ved forskellige koncentrationer, efterfulgt af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-d-iphenyltetrazolium (MTT) 24, 48, 72 og 96 timer. Efter 4-timers inkubation ved 37 ° C i 5% CO

2, 200 pi dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat for at opløseliggøre formazanprodukt. Absorbansen ved 570 nm blev bestemt ved anvendelse af en mikropladelæser. (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

Genekspression profilering analyse

2 forskellige RT2 Profiler PCR Arrays (SA Biosciences , QIAGEN) blev anvendt til at analysere ekspressionsniveauerne af 84 gener involveret i regulering af cellecyklus (human Cell Cycle array, PAH’er-020) i AGS celler behandlet med anandamid eller vehikel. Cellerne blev høstet ved 24 timer efter anandamid behandling og totalt RNA blev ekstraktion med RNeasy Plus kit (QIAGEN). Den syntetiske cDNA blev anvendt som template til at udføre kvantitativ polymerasekædereaktion (PCR) analyse. Den RT2 profiler PCR Array Dataanalyse software (v3.5) blev anvendt til PCR-array dataanalyse. Vi valgte GAPDH og ACTB som referencepunkter gener. Gener med ekspression fold ændringer mellem prøver større end 2 er valgt som differential-gener.

Western blot-analyse

Proteinlysater blev adskilt ved 12% Tris-glycin polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidenfluorid ( PVDF) membraner (GE Healthcare, Lille Chalfont, UK). Membraner blev inkuberet med monoklonalt muse-antistof mod humant Chk1, p-Chk1 (Abcam, Cambridge, UK), Cdc25A, CyclinB1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), efterfulgt af peberrodsperoxidase (HRP) -mærket gede-anti -mouse IgG (PTGLab, Chicago, IL, USA). β-actin (Sigma Chemicals; St. Louis, MO, USA) blev anvendt som et protein loading kontrol. HRP konjugat blev detekteret ved en chemioluminescence ECL kit (Amersham) og autofluorography. Protein intensitet blev kvantificeret ved hjælp af LANE 1D Analyzer software (Sage Creation, Beijing, Kina).

Statistisk analyse

t-test blev anvendt til at analysere betydningen af ​​forskellen mellem to grupper af data. P

.

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Køb af MeSH termer for mavekræft og psykologi

I den åbne opdagelse proces, det første skridt var at udtrække MeSH termer fra litteraturen søgninger. Vi genererede 12.001 MeSH termer (Profil A) ved hjælp af tekst til “mavekræft.” Disse MeSH termer involverede aspekter af mavekræft, der omfatter diagnostik, behandling, medicin, overlevelse, kræft scene, celle funktion, gener, proteiner og nogle kemiske stoffer lignende estere. Vi genererede 9,635 MeSH termer (Profil B) ved hjælp af tekst til “psykologi”, som er nært beslægtet med sociale miljø, adfærd, personlighed, følelser, former for sygdomme, terapi, medicin, kemisk stof, etc. De ti MeSH vilkår fra hvert emne er vist i tabel 2.

Fund af anandamid i C-profil (BA)

Brug af førnævnte Java-applet, vi elimineret udtryk optræder i en profil fra B profil, så kun udtryk stede i B-profil, men aldrig vises i en profil. Dette nye sæt blev identificeret som “C-profil.” Vilkår i C-profil blev rapporteret at have mere end en relation med psykologi, men få eller ingen publikationer samtidigt refererer både psykologi og mavekræft. Dog kan tidligere urapporteret forbindelser eksisterer der ikke er blevet opdaget, eller blev ignoreret.

For yderligere at udforske de potentielle relationer mellem disse områder, vi klassificeret vilkårene for C-profil i 6 kategorier, herunder adfærd, orgel og væv, stemninger, sygdomme, medicin og kemiske stoffer, og andre. Hver term besad sin egen frekvens; udtrykkene besidder de højere frekvenser og repræsentativiteten er vist i tabel 3. Endelig valgte vi 1 udtryk fra lægemidlet og kemiske stof kategori, anandamid, til yderligere undersøgelse. Årsagerne til vores udvalg er sammenfattet nedenfor:.

Vilkårene i stoffet og kemiske kategori var den nemmeste at bruge til eksperimentel afprøvning af den potentielle sammenhæng mellem psykologi og mavekræft

Inden for kategorien af ​​narkotika og kemiske, den højere frekvens af anandamid tilkendegivet større relativ betydning.

Andre vilkår med højere frekvens, såsom diazepam, er alle velkendte, mens anandamid er et relativt nyt stof.

Selvom få undersøgelser blev fundet undersøge både anandamid og mavekræft sammen [10], [11], vores arbejde for opstandelse fokuserer på at analysere veje eller mekanismer, der måske ikke være kendt.

Prediction af forholdet mellem anandamid og mavekræft

Vores hypotese om anandamid og mavekræft blev testet gennem den lukkede opdagelse proces. Denne proces blev udført ved hjælp af web-baserede model Arrowsmith; startende fra sygdommen af ​​gastrisk cancer (A) og indholdet af anandamid (C), søgte vi efter fælles mellemliggende B-terms. De B-listen titel ord og sætninger (vilkår), der dukkede op i både A og C litteratur. Som veje fundet mellem A og C blev mere almindelige, steg den sandsynlige gyldighed vores hypotese. Efter de nødvendige førnævnte filter trin, 446 termer var til stede på den aktuelle B-liste, rangordnet efter forudsagt relevans. Dernæst vi begrænset disse vilkår ved semantiske kategorier af Genes Molekylære Sekvenser og Gene Protein Navne og indsamlet målet gener involveret i forskellige signalveje, herunder cellecyklus, apoptose, inflammation og etc (tabel 4). Samtidig en vej netværk blev bygget for at vise den fælles molekylære regulering netværk mellem mavekræft og anandamid handling. Som det ses i figur 1, disse gener udviste høj afhængighed angiver de regulatoriske relationer mellem dem. For yderligere at undersøge gyldigheden af ​​disse målgener, flere proteiner /gener blev valgt som eksempler for at verificere deres forhold til gastrisk kræft eller anandamid gennem Arrowsmith SYSTEM. Og som vist i tabel 5, en gruppe af kritiske gener involveret i adskillige veje, der er knyttet både til gastrisk cancer og anandamid. Alle disse spor stiltiende en potentielt skjult forbindelse mellem anandamid og mavekræft, som var værdig til yderligere undersøgelse

De kritiske gener af B-vilkår blev indsamlet og bruge Mas 3,0 annotation systemet (Capital Bio http:. //bioinfo.capitalbio.com/mas3/) en molekylær netværk blev bygget. Forkortelserne repræsenterede forskellige gener involveret i nogle vigtige signalveje i relation til både mavekræft og anandamid. fx The PTGS2 genet koder for COX-2, et enzym ansvarligt for inflammation og smerte, blev rapporteret, at dens mutationsmay være ansvarlig for en højere risiko for mavecancer, i mellemtiden, COX-2 metaboliserer også anandamid dannende prostaglandin-ethanolamider (PG -EA). Numrene og farve på de, der er tilsluttet gener betyder tællinger af genet optrådt i forskellige signalveje i tre biologisk vej database herunder Biocarta, GenMAPP andKEGG (Rød: Biocarta; Grøn: GenMAPP; Blå: Kegg).

Påvisning af effekten af ​​anandamid på mavens kræftceller

anandamide, som et medlem af den endocannabinoide familien, også kendt som

N

-arachidonoylethanolamine eller AEA, blev vist at aktivere 2 distinkte G-protein-koblede cannabinoidreceptorer, cannabinoid receptor type 1 (CB1) og cannabinoid receptor type 2 (CB2) [12]. Anandamid syntetiseres ud fra N-arachidonoyl phosphatidylethanolamin (NAPE) og dens nedbrydning primært katalyseres af fedtsyreamidfamilien hydrolase (FAAH) enzym, som også katalyserer den nedstrøms omdannelse af anandamid til ethanolamin og arachidonsyre. Strukturen af ​​anandamid omfatter funktionelle grupper på amider, estere og ethere af langkædede polyumættede fedtsyrer [13]. Disse forbindelser udviser “cannabimimetisk aktivitet”; med andre ord, de fungerer som “D-9-tetrahydrocannabinol (THC) mimetika”, den aktive bestanddel af cannabis. De anandamid struktur deler kritiske farmakoforer med THC [14] (figur 2A).

anandamid funktionelle grupper indbefatter amider, estere og ethere af langkædede polyumættede fedtsyrer, og strukturelt deler kritiske farmakoforer med D-9- tetrahydrocannabinol (THC). B.Anandamide behandling hæmmer spredning af gastriske kræftceller. BGC823, SGC7901, AGS, og N87-celler blev behandlet med syntetisk anandamid ved koncentrationer på 0, 50, og 100 uM i 24 timer. Proliferationshastigheden blev detekteret ved MTT-assayet. Celler behandlet med køretøj ethanol blev anvendt som en kontrol. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3), * viser

s 0,01

sammenlignet med kontrol. C.Anandamide behandling hæmmede udbredelsen af ​​AGS og N87 celler. AGS og N87-celler blev behandlet med syntetisk anandamid med stigende koncentrationer af 0, 0,01, 0,1, 1, og 10 uM i 24 timer. Proliferationshastigheden blev detekteret ved MTT-assayet. Data er præsenteret som middelværdi ± SD (n = 3). * Angiver

s 0,01

sammenlignet med kontrol. D.The virkning anandamid på apoptose i AGS og N87-celler. AGS og N87-celler blev behandlet med anandamid ved en koncentration på 10 uM i 24 timer. Apoptose blev analyseret ved flowcytometri. Celler behandlet med køretøj blev anvendt som kontrol.

For at undersøge effekten af ​​anandamid på spredning af gastrisk cancerceller, blev BGC823, SGC7901, AGS, og N87 behandlet med stigende koncentrationer af syntetisk anandamid. Efterfølgende blev proliferationen af ​​disse cellelinier påvises ved MTT. Resultaterne viste, at anandamid stærkt reduceret proliferationshastigheder af disse 4 gastriske cancercellelinier på en dosis-afhængig måde, med statistisk signifikante reduktioner (

s 0,01

) ved 100 uM. Desuden AGS og N87 cellelinjer udviste en mere følsom og dramatisk fald (

s 0,01

) selv ved 50 uM koncentration (figur 2B). Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​anandamid ved lavere koncentrationer på celleproliferation i gastriske cancerceller. Som vist i figur 2C, en signifikant, dosisafhængig fald (

s 0,01

) i proliferation af AGS og N87-celler blev observeret med en inhibering. Imidlertid anandamid ved lavere koncentrationer produceret ringe virkning på BGC823 og SGC7901 cellelinier (data ikke vist). Derfor AGS og N87 cellelinier var mere følsomme over for anandamid end BGC823 og SGC7901 cellelinier.

Anandamide reducerede væksten evne AGS og N87-celler, mens det havde ringe virkning på apoptose i AGS og N87-celler (figur 2D). Derfor skal der være andre grunde, der førte til nedsat proliferation.

Effekt af anandamid behandling på cellecyklus distribution af gastriske kræftceller

For yderligere at undersøge de særlige kendetegn ved væksthæmning ved anandamid, den cellecyklus fase blev påvist ved flowcytometri. AGS og N87 celler ved perioden logaritmisk vækst blev inkuberet med 10 pM anandamid eller ethanol opløsningsmiddel i 24 timer, derefter standset i G2 fase af cellecyklussen (figur 3A og 3B). For at undersøge virkningen af ​​anandamid på cellecyklusprogression mere detaljeret blev AGS og N87 celler synkroniseret i G1- fase ved serumudsultning. Cellecyklussen blev analyseret, når cellerne blev frigjort fra denne blokade med komplet medium i nærvær eller fravær af anandamid. Celler behandlet med ethanol opløsningsmiddel i stedet for anandamid blev ansat som kontroller. Som det ses i figur 3C, blev AGS celler synkroniseret med mere end 70% G1-fasen DNA-indhold efter at de var dyrket i fri-serum kultur. Ved 6 timer, ca. 46% af kontrolceller var i G1-fasen, og ved 12 timer, flertallet (57,45%) var i S-fase. Mellem 12 og 24 timer blev cellerne i G2 /M-fase og undergik hurtig mitose og ved 24 timer, de kom ind i næste cellecyklus. Men når cellerne blev behandlet med anandamid efter frigivelse fra G1-fasen, blev 33,47% af de behandlede celler standset i G2 /M-fase i op til 24 timer, og viste en forsinket indtræden i næste cellecyklus. En lignende tendens blev også observeret i N87-celler (Figur 3D). Taget sammen indikerer disse resultater, at anandamid behandling forårsagede G2 /M arrest observeret i AGS og N87-celler.

A. De AGS celler ved perioden logaritmisk vækst blev inkuberet med 10 pM anandamid eller ethanol opløsningsmiddel i 24 timer. Cellecyklussen fase blev analyseret med flowcytometri. Celler behandlet med anandamid oplevet en betydelig G2 blok. B. N87 celler blev behandlet med anandamid (10 uM) i 24 hånd derefter standset i G2 fase af cellecyklussen. Kontrolcellerne blev behandlet med ethanol opløsningsmiddel. Cellecyklussen fase blev analyseret med flowcytometri. C. AGS Cells anholdt ved G1 fasen af ​​serum sult blev løsladt ved t = 0h og inkuberes med anandamid (10 uM) eller ethanol. Cellerne blev opsamlet ved 6h, 12h, og 24 timer, og DNA-indholdet blev analyseret ved flowcytometri. Procentdelen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen viste anandamid forårsager G2 /M-faser på 24 timer. Grafer er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter med lignende resultater. D. N87 celler blev synkroniseret i G1-fasen af ​​serum sult og blev frigivet ved t = 0, samtidigt de blev behandlet med anandamid (10 uM) eller ethanol. Cellerne blev høstet ved 6h, 12h, 24h og forberedt til flowcytometrianalyse. Grafer er repræsentative for 2 uafhængige eksperimenter med lignende resultater.

Effekt af anandamid på cellecyklus regulatorer

For at analysere de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for øget cellecyklusstop forårsaget af anandamid, vi brugte 2 forskellige RT2 Profiler PCR arrays (SA Biosciences, Qiagen) at bestemme ekspressionsniveauerne af gener involveret i reguleringen af ​​cellecyklus. Gener med ekspression fold ændringer mellem celler behandlet med anandamid og køretøj større end 2 blev udvalgt som differentielle gener. Resultaterne viste, at AGS celler behandlet med anandamid i 24 timer viste en samlet stigning i ekspression af G2 /M-anholdelse gener, herunder GADD45 og p21

WAF og en tilsyneladende fald i G2 cellecyklus regulatorer herunder CHEK1, CHEK2, Cdc25, CCNA2, CCNB1, CDKN1A, CDKN2A, etc. (figur 4A). For yderligere at undersøge, om anandamid forårsaget cellecyklusstandsning ved G2 /M checkpoint kontrol, udførte vi en Western blot-analyse af AGS celler efter anandamid behandling i 24 timer. Celler behandlet med ethanol opløsningsmiddel i stedet for anandamid blev ansat som kontroller. Som vist i figur 4B og 4C, anandamid forårsagede en stigning på Chk1 phosphorylering og nedsat ekspressionsniveauerne af cyclin B1 og Cdc25A sammenlignet med observationerne i kontrolceller. Disse data antydede, at anandamid behandling førte til øget aktivitet på G2 /M checkpoints.

A. Analyse af differentiel genekspression profilering i AGS celler med tilstedeværelse og fravær af anandamid. Data blev opnået fra tre prøver hver gruppe. Den differentielle genet med gennemsnitlige ændringer (fold 2) efter udsættelse for anandamid (10 uM) i 24 timer blev plukket, graferne viser fold ændringer i disse cellecyklus beslægtede gener. B. Virkning af anandamid på ekspressionen af ​​cellecyklus regulatorer. Celler blev høstet efter anandamid (10 uM) eller ethanol behandling opløsningsmiddel i 24 timer og analyseret ved western blotting med antistoffer mod Chk1, p-Chk1, Cdc25A, og CyclinB1. C. Resultaterne af western blotting blev normaliseret mod β-actin. Fold ændringer af disse proteiner blev bestemt ved sammenligning med niveauer målt i kontrol ethanol behandlede celler. Data præsenteres som gennemsnit ± SD (n = 3), * angiver

s. 0,05

sammenlignet med kontrol

Diskussion

Brug Swanson litteratur-baserede opdagelse metode, kan efterforskerne bestemme nye relationer mellem tilsyneladende uafhængige områder, og genoplive tidligere publicerede, men forsømte hypoteser [15]. I den foreliggende undersøgelse, vi simulerede Swanson litteratur-baserede opdagelse metode i 2 inden for medicinsk forskning, litteratur, som ikke er bibliografisk tilsluttet: mavekræft og psykologi. Efter en 2-trins opdagelse proces blev anandamid udvalgt og forudsagt at være knyttet til gastrisk cancer. Dernæst blev den potentielle sammenhæng mellem mavekræft og anandamid bekræftet ved opfølgende eksperimenter. Derfor har vi med succes simuleret litteratur-baserede opdagelser fordi hypoteser genererede en roman forhold, der har vist sig at være pålidelige.

Gastrisk kræft er en multifaktoriel sygdom, med mange sygdomsfremkaldende variabler er blevet rapporteret, herunder

H . pylori

, høj natrium kost, drikke og rygning [16]. Tidligere undersøgelser i vores laboratorium har specialiseret sig i gastrisk cancer; Derfor er formålet med denne undersøgelse var at finde ny viden i mavekræft forskningsfelt. Denne tilgang, ved hjælp af Swanson litteratur-baserede opdagelse, førte til identifikationen af ​​anandamid, et medlem af endocannabinoids. Anandamid er blevet rapporteret at udvise anti-spredning egenskaber ved behandling af visse former for cancer, herunder neuroblastom, prostatacarcinom og melanom [17] – [20]. Mayato [21] også rapporteret forskning i anandamid i gastrisk cancer.