PLoS ONE: Sporadisk Kolorektal Cancer Development Shows rejuvenescence hensyn epitelproliferation og Apoptose

Abstrakt

Baggrund og Formål

Sporadisk kolorektal cancer (CRC) udvikling er en sekventiel proces viser alder-afhængighed, ukontrolleret epitelproliferation og nedsat apoptose. Under juvenile vækst celleproliferation og apoptose er velafbalanceret, som kan forstyrres ved ældning. Vores mål var at korrelere proliferative og apoptotiske aktiviteter i aldrende menneske colon epitel og tarmkræft. Vi testede også den underliggende molekylærbiologi om spredningsfølsomme og apoptose-regulering af genekspression ændringer.

Materialer og metoder

tyktarms biopsier fra raske børn (n

1 = 14), sund voksne (n

2 = 10), voksne adenomer (n

3 = 10) og CRC’er (n

4 = 10) hos voksne blev testet for Ki-67 immunhistokemi og TUNEL apoptose assay. Mitosis- og apoptose-relaterede genekspression blev også undersøgt hos raske børn (n

1 = 6), voksne (n

2 = 41) prøver og i CRC (n

3 = 34) i HGU133plus2. 0 microarray platform. Målte ændringer blev bekræftet med RT-PCR på både afhængige og uafhængige prøvesæt (n

1 = 6, n

2 = 6, n

3 = 6).

Resultater

Mitoseindeks (MI) var signifikant højere (p 0,05) i intakt juvenil (MI = 0,33 ± 0,06) og CRC prøver (MI = 0,42 ± 0,10) sammenlignet med raske voksne prøver (MI = 0,15 ± 0,06). I modsætning hertil blev apoptotiske indeks (AI) faldt i børn (0,13 ± 0,06) og signifikant lavere i cancer (0,06 ± 0,03) sammenlignet med raske voksne prøver (0,17 ± 0,05). Otte spredningsfølsomme (fx MKI67, CCNE1) og 11 apoptose-associerede gener (fx TNFSF10, IFI6) havde ændret mRNA-ekspression både i løbet af den normale aldring og carcinogenese, primært inducere spredning og reducere apoptose sammenlignet med raske voksne. Otte spredning-associerede gener herunder CCND1, CDK1, CDK6 og 26 apoptose-regulerende gener (f.eks SOCS3) blev anderledes udtrykt mellem unge og kræft grupper meste understøtter udtalt cellevækst i CRC.

Konklusion

tyktarms prøver fra børn og CRC patienter kan karakteriseres ved tilsvarende øget proliferativ og faldt apoptotiske aktiviteter sammenlignet med raske colon prøver fra voksne. Derfor celle kinetiske ændringer under kolorektal cancerudvikling vise ukontrolleret rejuvenescence i modsætning til den styrede cellevækst i juvenil tyktarmsepitelet

Henvisning:. Leiszter K, Galamb O, Sipos F, Krenács T, Veres G, Wichmann B, et al. (2013) Sporadisk Kolorektal Cancer Development Shows rejuvenescence hensyn epitelproliferation og apoptose. PLoS ONE 8 (10): e74140. doi: 10,1371 /journal.pone.0074140

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: Marts 19, 2013; Accepteret: 29 Juli 2013; Udgivet: 3 oktober 2013

Copyright: © 2013 Leiszter et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af ungarske Research Fund Scientific (Országos Tudományos Kutatási Alapprogram /OTKA-K /) 105530. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den normale celle fornyelse af sunde colon epitel tager ca. 5 dage, gennem celledeling, differentiering og apoptose.. Placeringen af ​​forskellige typer af epitelceller i krypterne er meget typisk. Prolifererende celler meste opholde sig på grundlag af krypterne, differentierede celler i midten zone, medens de apoptotiske celler er tæt på den luminale overflade. Adskillige molekylære veje spiller vigtig rolle i den fysiologiske selvfornyelse af epitelceller i menneskets tyktarm [1] – [4].

Men reguleringen af ​​proliferative og apoptotiske mekanismer kan ændre under normal aldring og kolorektal carcinogenese. Aldring er en fysiologisk mekanisme, der begynder efter undfangelsen. Det påvirker næsten hver celle i organismen med den mulige undtagelse af stamceller og tumorceller. Makroskopiske og mikroskopiske ændringer er til stede i den aldrende mavetarmkanalen herunder tyktarmen [5] – [6]. Ændringer i proliferativ aktivitet i løbet af aldring er blevet analyseret i dyremodeller i tidligere undersøgelser [7] – [8]. Ifølge resultaterne af

Mandir et al

, har den mest intensive epitel regenerering (proliferation og apoptose) blevet bevist i unge rotter.; og forfatterne konkluderede, at dramatiske ændringer i unge tyktarmsepitelet kan relateres til intestinal udvikling. Imidlertid har den normale gastrointestinal aldring ingen effekt på epitel fornyelse [7]. Tværtimod i alderen dyrepopulationer øget celleproliferation og nedsat apoptose i tyktarmsepitelet blev observeret og menes at lette ukontrolleret celleproliferation og tumorigenese, hvilket kan forklare den højere forekomst af kolorektal cancer hos ældre menneske [8].

desuden er nogle af disse ændringer kan også være relateret til colorektal carcinogenese. Ændringer i epitelcellevækst og programmeret celledød blev også tidligere undersøgt i forskellige stadier af colorektal carcinogenese, men resultaterne er ikke samstemmende. Celledeling og apoptose kan blive dysreguleret og ubalanceret celle produktion og celletab bestemme adfærd præmaligne eller maligne lidelser og tumorvækst [9] – [12]

opdagelse sats af adenomer og forekomsten af ​​fremskreden. kolorektale adenomer og kræft løbende ophøje efter det fyldte 40-50, viser stærk alder afhængighed [13] – [14]. Sporadiske tyktarmskræft viser sig for det meste i den ældre voksne befolkning på samme måde som mange neoplastiske og forstadier til kræft. Ifølge Vogelstein model [15], colorektal cancer udvikler sig fra normalt epitel gennem præmaligne adenom i en multi-trins proces, som tager flere år. Udover generne (f.eks APC, KRAS, DCC og TP53) traditionelt impliceret i denne cancer progression model, der for nylig hidtil ukendte gener med ændring mRNA-ekspression også blevet foreslået at være bidrage til malign transformation af colorektal epitel [16] – [18].

der er flere genetiske og epigenetiske ændringer, der kan påvise en mulig sammenhæng mellem aldring og kolorektal carcinogenese. Akkumulering af DNA-mutationer og skader, promotor hypermethylering, ændringer i DNA-reparation, telomeraseaktivitet og cellulær metabolisme kan i stigende grad påvirke alderen populationer fører til forhøjet celleproliferation og nedsat apoptose, der kan føre til malign transformation og ukontrolleret celleproliferation [19].

samtidig, flere mennesker og dyr undersøgelser har afsløret den modsatte regulering af visse molekylære veje under normal aldring og carcinogenese. I modsætning til normal ældning, prolifererende cancerceller udviser øget metabolisme, kendetegnet ved kontinuerlig proliferative aktivitet og de-differentiering, kan de producere embryonale proteiner og er potentielt udødelige ved at undslippe apoptose [20]. Især apoptose-regulerende proteiner viser distinkt ekspression i ældede og cancerceller fremhævede ved nedregulering af apoptoseinducerende tumor suppressor p53 protein [21] og Fas /CD95 protein [22] og overekspressionen af ​​antiapoptotisk protoonkogen Bcl-2 i cancer i modsætning til normal ældning celler [23] – [25]. Onkogener såsom Ras, transkriptionsfaktorer fx Myc, og vækst signaltransduktion-relateret tyrosin-kinase receptorer fx medlemmer af EGFR familien er opreguleret i nogle kræftformer, mens nedreguleret i aldrende celler [26] – [28]

Kræft udvikling kan betragtes som en lokal, ukontrolleret “foryngelse”, som anvender samme molekylære veje. men med modsatrettede regulering. Dereguleret celleproliferation og apoptose veje kan tillade overlevelse fordele for kræftceller mod tilstødende aldrende celler, på grund af tabt evne for kræft for normal aldring [20]. Øget epitelcelleproliferation i mave-tarmkanalen kan ses ikke kun i colorektal cancer, men også i embryonisk og juvenil udvikling. En væsentlig vej, der spiller fundamentale roller både i tarmen udvikling og i sporadiske eller familiære kolorektal kræft er Wnt /β-catenin signalering [29] – [30].

Da vi er klar over, er der ingen undersøgelse med fokus på spredning og apoptose regulering i juvenile menneskelige kolorektal epitel i forhold til normal aldring og carcinogenese. Formålet med denne undersøgelse var at analysere den proliferative og apoptotiske aktivitet i human tyktarmsepitel under normal aldring og colorektal carcinogenese både protein og genekspression niveau. Kolorektale biopsier repræsenterer juvenile kontrolleret vækst fase, den sunde status voksne og ukontrolleret kolorektal cancer udvikling blev testet for mulige sammenhænge.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Efter informeret samtykke, blev kolorektale biopsiprøver taget under rutinemæssig endoskopisk indgreb på 2. Institut for Intern Medicin og 1. Institut for Pædiatri, Semmelweis University, Budapest, Ungarn. I alt blev 44 vævsprøver analyseret i immunhistokemiske undersøgelse (14 raske børn, 10 raske voksne, 10 adenomer fra voksne og 10 CRC’er fra voksne); 81 biopsi prøver blev analyseret i microarray analyse (6 raske børn, 41 raske voksne og 34 CRC’er fra voksne); og 36 biopsiprøver var involveret i real-time PCR validering (12 raske børn, 12 raske voksne og 12 CRC’er fra voksne). Halvfjerds-fem mikroarrays (de voksne prøver) var blevet hybridiseret tidligere; deres datafiler blev anvendt i en tidligere publicerede undersøgelser under anvendelse af forskellige sammenligninger [31] – [32] og er tilgængelige i Gene Expession Omnibus database (serie accession nummer: GSE10714 og GSE37364). De datasæt af de nyligt hybridiseret 6 mikroarrays er registreret på GSE37267 serienummer tiltrædelse nummer. Kontrol børn blev henvist til ambulatoriet med rektal blødning, forstoppelse eller kronisk mavesmerter. Ileocolonoscopy var en del af deres diagnostiske procedure (udelukke organisk sygdom) og biopsi prøver viste normal makroskopisk udseende og histologi. Hver prøve blev verificeret ved histopathologists.

For immunhistokemi kolorektale biopsi prøver blev rutinemæssigt fikseret i formaldehyd og indlejret i paraffinvoks. For mRNA undersøgelser blev koloskopi prøver opbevaret i RNAlater Reagent (Qiagen Inc, Germantown, US) ved -80 ° C før total RNA-ekstraktion til genekspression analyse og Taqman RT-PCR forsøg. Etiske godkendelser (nr .: 69/2008 og 202/2009) for denne undersøgelse blev udstedt af regionale og institutionelle Udvalg for Videnskab og Forskning etik Semmelweis University (Budapest, Ungarn). Skriftligt informeret samtykke blev opnået på forhånd fra alle voksne deltagere og fra de pårørende, pedeller, eller værger på vegne af mindreårige /børn er godkendt af etiske udvalg. Detaljeret klinisk-patologisk specifikation af patientprøverne er opsummeret i

Tabel 1

og

Tabel 2

.

Immunhistokemi for celledeling

arkiverede prøver fra 14 histologisk normale colon biopsier fra børn, 10 normale colon biopsier fra voksne, samt 10 voksne adenomer og 10 CRC’er blev indsamlet under rutinemæssig endoskopi. 1 mm diameter kerner blev udstanset fra paraffinblokke af voksent prøver og opsamlet i væv microarrays (TMA). Fire um tykke snit skåret både fra TMAs og fra enkelte barn biopsiprøver blev afvokset og rehydreret til immunfarvning.

Efter antigen-genvinding i en pH 9,0 Tris-EDTA-buffer under anvendelse af en mikrobølgeovn ved 900 W i 10 minutter og derefter ved 370 W i 40 minutter, blokering af endogene peroxidaser i 1% hydrogenperoxid opløses i methanol og af specifikke bindingssteder anvendelse af 1% bovint serumalbumin i 20 minutter hver blev udført. Objektglas blev inkuberet med monoklonalt muse-anti-Ki-67-antistof (Klon: MIB-1, 1:100, Dako, Glostrup, Danmark) i 60 minutter i et fugtigt kammer og derefter med anti-muse IgG F (ab ‘)

2 Alexa Fluor 546-konjugat (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) i 30 min.

Apoptose detektion ved anvendelse TDT-medieret dUTP nick-endemærkning (TUNEL) assay

efter fordøjelse med proteinase-K (20 ug /ml, 20 min), 50 pi TUNEL (TUNEL in situ Celledød Detection Kit, Fluorescein, Roche, 11684795910) reaktionsblandingen (5 pi TdT enzym + 45 pi dUTP) blev tilsat til vævssnit og TMA lysbilleder. Derefter blev prøverne inkuberet i et mørkt fugtigt kammer ved 37 C ° i 120 minutter. Cellekerner blev farvet med Hoechst (5 pi Hoechst farvestof + 10 ml TBS, 1 min, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo, USA).

Tælling af mitose og apoptotisk indeks i digitale dias

Farvede biopsi prøver og TMA dias var digitaliseret med en høj opløsning digital scanner (Pannoramic Scan, 3DHISTECH Ltd. Budapest, Ungarn) ved hjælp af flerlags fluorescerende scanning med en høj numerisk blænde (0,8) × 20 objektiv og en high dynamic range AxioCam MRM Rev.3 sort-hvid kamera tilsluttet scanneren. Digitale slides blev adgang til via en computerskærm og analyseret ved hjælp af Pannoramic Viewer-softwaren (version 1.11.43.0). Den Marker Counter software modul resulterer i permanente anmærkninger på de optalte celler blev brugt til at estimere det relative forhold af proliferative, apoptotiske og normale celler.

Ki-67, TUNEL og Hoechst positivities optrådte alle som stærke kernekraft mærkning i lysbilleder. Afhængig af prøvens størrelse blev 500-1000 epitelceller tælles i langsgående godt orienterede krypter. Vi har bestemt den proliferative-apoptotiske forhold (PAR: forholdet mellem proliferative og apoptotiske celler i krypter), Mitoseindekset (MI: forholdet mellem proliferative celler og totale tælles celler i krypter) og apoptotiske indeks (AI: Forholdet mellem apoptotiske celler og totale optalte celler i krypter).

mRNA microarray ekspressionsanalyse

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Germantown, USA) ifølge producentens anvisninger. Mængde af isoleret RNA blev karakteriseret ved at måle absorbans (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc., Wilmington, USA). Kvaliteten af ​​isolerede RNA blev testet med kapillær gelelektroforese (2100Bioanalyzer og RNA 6000 Pico Kit /Agilent Inc., Santa Clara, CA, USA /). Biotinyleret cRNA prober blev syntetiseret fra 1 til 8 pg totalt RNA og fragmenteret ved hjælp af One-Cycle Target mærkning og kontrol Kit (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/expression_s2_manual.pdf), i henhold til Affymetrix beskrivelse. Tyve mikrogram af hver fragmenterede cRNA prøve blev hybridiseret i HGU133 Plus2.0 array (Affymetrix) ved 45 ° C i 16 timer. Objektglas blev vasket og farvet under anvendelse Fluidik Station 450 og antistof amplifikation farvning fremgangsmåde ifølge producentens instruktioner. Fluorescerende signaler blev opdaget af GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix).

TaqMan RT-PCR

Efter microarray genekspression analyse blev resultaterne sammenlignet med andre datasæt til rådighed i Gene Expression Omnibus databank (http : //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo; series tiltrædelse nummer er GSE18105). TaqMan polymerasekædereaktion blev anvendt til måling mRNA-ekspression af 12 udvalgte gener, der deltager i reguleringen af ​​cellecyklussen, proliferation eller apoptose, på originale (6 histologisk intakte børn, 6 histologisk intakte voksne og 6 CRC voksne prøver) og uafhængige sæt af prøver ( 6 histologisk intakte børn, 6 histologisk intakt voksen, 6 CRC voksne prøver). 18S ribosomale RNA og GAPDH blev brugt som reference.

Total RNA ekstraktion, kvalitet og kvantitet kontroller blev udført som beskrevet tidligere. Anvendelse af High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit med RNase Inhibitor, 1 ug totalt RNA pr prøve blev revers transkriberet (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Kvaliteten af ​​cDNA blev kontrolleret ved SDHA real-time PCR (F. Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Schweiz). Derefter 16,7 ng cDNA skabelon pr prøve blev anvendt til ekspression af udvalgte gener med TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies). Målingen blev udført på LightCycler 480 (Roche) med Mono Farve Hydrolyse Probe /UPL Probe afsløring format. Efter denaturering ved 95 ° C i 10 minutter blev 40 PCR-cykler udføres (opformering ved 95 ° C i 15 sekunder, og ved 60 ° C i 1 min).

Statistisk vurdering

til statistisk analyse af Ki-67 immunfarvning og TUNEL resultater ANOVA test og Tukey HSD post-test blev anvendt. I begge metoder væsentlighedskriterier var p. 0,05

For mRNA udtryk profiler Affymetrix udtryk arrays primært pre-behandlet af GCRMA baggrund korrektion metode med fraktil normalisering og median polsk sammendrag. SAM-analyse blev anvendt til bestemmelse af spredningsfølsomme og apoptose-regulerende gener med at ændre mRNA-ekspression. Følgende SAM kriterier blev anvendt: LogFC≥abs 1, p-værdi 0,05. Alle disse gener blev sammenlignet, og de differentielt udtrykte dem blev yderligere undersøgt. Udtrykket af hver udvalgt gen mellem forskellige prøve grupper blev yderligere analyseret af ANOVA og post-test Tukey HSD

De datasæt er tilgængelige i Gene Expression Omnibus databank (http:. //www.ncbi.nlm.nih .gov /geo /), serie tiltrædelse numre:. GSE10714, GSE37364 og GSE37267

For real-time PCR validering 12 prøver blev analyseret i hvert trin (børn, sunde /normale voksne og voksne CRCs). For normalisering blev 18S ribosomale RNA anvendt som intern kontrol. Til statistisk analyse ANOVA test og Tukey HSD post-test blev anvendt. Følgende kriterier blev anvendt: Fold change≤0.5 eller Fold change≥2 og p-værdi 0,05

Resultater

spredning og apoptose i juvenile, normal voksen, adenom og kolorektal carcinom prøver

Prolifererende epitelceller blev overvejende lokaliseret i bunden af ​​krypterne mens apoptotiske celler lå tæt på den luminale overflade i normal kolonmucosa

(

Figur 1

)

. Proliferativ-apoptotisk forhold (PAR: forholdet mellem proliferative og apoptotiske epitelceller i krypter) og MI var signifikant højere hos børn (PAR = 3,51 ± 2,49; MI = 0,33 ± 0,06) og CRC prøver (PAR = 9,83 ± 7,72; MI = 0,42 ± 0,10) end hos raske voksne prøver (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) (p 0,05). De viste kontinuerlig stigning i løbet af adenom-carcinom-sekvensen (ACS). PAR var 3.99 gange højere hos raske børn colon epitel og 11.17 gange højere i CRC sammenlignet med raske voksne epitel; og PAR var 2,8 gange højere i CRC i modsætning til de juvenile prøver. Baseret på vores immunhistochemical resultater, MI var 2,2 gange højere hos børn og 2,8 gange højere i CRC sammenlignet at til sunde normale, og 1,27 gange højere i CRC i modsætning til unge prøver. Den højeste PAR og MI blev fundet i tarmkræft prøver

(

Figur 2

)

.

Blå pletter repræsenterer kerner af inaktive celler. Billeder blev taget med digital mikroskop: normalt barn væv (Ch), normalt voksent væv (N), adenom (Ad) og carcinom (CRC) hos voksne. Mitotisk aktivitet falder under aldring og stiger i løbet af ACS i modsætning til apoptotisk aktivitet.

PAR og MI fald under aldring og øget under carcinogenese, i modsætning til AI.

AI blev reduceret hos raske børn prøver (0,13 ± 0,06) og signifikant lavere i tyktarmskræft prøver (0,06 ± 0,03) end i de histologisk intakt voksne colon prøver (0,17 ± 0,05) (p 0,05). AI viste konstant fald parallelt med kolorektal ACS. Apoptotisk indeks blev bevist 0.76 gange lavere hos børn, og 0,35 gange lavere i CRC sammenlignet med raske normale prøver; og det var 0,46 gange lavere i CRC sammenligne med juvenile prøver. Den laveste AI blev påvist i kolorektale cancer prøver

(

Figur 1

–

2

).

Markant ændring i proliferativ aktivitet blev ikke fundet mellem raske voksne colon mucosa (PAR = 0,88 ± 0,22; MI = 0,15 ± 0,06) og adenom prøver (PAR = 1,45 ± 0,89; MI = 0,13 ± 0,05); mens AI viste sig at være betydeligt lavere i adenom prøver (Normal AI = 0,17 ± 0,05; Adenom AI = 0,10 ± 0,04) (p 0,05).

Angivelse af spredningsfølsomme og apoptose-regulerende gener i juvenile , normal voksen og kolorektal karcinom prøver

mRNA ekspressionen af ​​117 spredningsfølsomme regulerende gener blev undersøgt i HGU133 Plus2.0 microarrays. Genekspression af 5 prober (tilhører 4 gener) ændret i løbet af aldringen alene i histologisk intakt colon mucosa; mRNA ekspressionen af ​​18 prober (tilhører 13 gener) blev ændret under kolorektal carcinogenese; og 11 prober (tilhører 8 gener /BRCA1, CCNB1, CCNE1, CDC20, CDK1, CDKN2B, MKI67 og TFDP1 /) blev forskelligt udtryk i både gruppe af prøver (

3A

). Tilsvarende blev genekspression af 534 apoptose-regulerende gener også analyseret i denne undersøgelse. mRNA-ekspression af 15 prober (tilhører 9 gener) ændret i løbet af aldringen alene i histologisk intakt colon mucosa; 46 sonder (tilhører 32 gener) viste ændringer i løbet kolorektal carcinogenese; og 12 sonder (tilhører 11 gener /ACVR1B, BRCA1, CHEK2, DYRK2, IFI6, SERPINB9, SFRP1, SOCS3, SST, TNFSF10 og Zak /) blev forskelligt udtryk i både gruppe af prøver

(

Figur 3B

)

.

på zonekort, øges genekspression repræsenteret med røde linjer, mens nedsat udtryk med grønt. De første 6 prøver med lyseblå show gener hos børn, den mørkeblå er fra raske voksne, mens de sidste prøver i grøn er fra kræftpatienter.

Gene udtryk ændringer mellem unge og CRC prøver

spredningsfølsomme og apoptose-regulerende gener blev yderligere undersøgt for at finde gener med forskellig mRNA-ekspression, der kan forklare forskellene mellem det kontrollerede og ukontrollerede celleproliferation. Tolv sonder tilhører 8 sprednings-kontrollerende gener (BCL2, CDKN2B, RAD9A, BRCA2, CCND1, CDK1, cdk6 og RBL1)

(

Figur 4A

)

og 26 apoptose-regulerende gener (AIFM2, AIFM3, BTK, CIDEB, CIDEC, DAPK2, MAL, NLRP1 (LOC728392), SFRP1, SIVA1, SPN, SST, TR53I3, TNFRSF25, ANXA1, CBX4, CASP4, INHBA, MYC, PLAGL2, PMAIP1, POLB, PROK2, SOCS3, TNFRSF10B og ZAK) med 39 sonder

(

Figur 4B

)

viste signifikant ændring mellem børn og kræft grupper, efter p-værdien .

på zonekort, øges genekspression repræsenteret med røde linjer, mens nedsat udtryk med grønt. De mørkeblå prøver fra raske børn colon mucosa (Ch), og den lyseblå er fra kolorektal cancer prøver (CRC).

Validering af genekspression ved hjælp TaqMan RT-PCR

mRNA ekspressionen af ​​10 gener, herunder CDKN2B, MKI67 cdc2 /CDK1, CCNE1, ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 og SERPINB9 blev valideret med TaqMan RT-PCR

(

tabel 3

)

.

Ifølge resultaterne af microarray analyse af spredning-regulerende gener (CDKN2B, MKI67, cdc2 /CDK1 og CCNE1), blev påvist signifikante mRNA ekspression ændringer af værdien af Fold ændringer (FC≤0.5 eller FC≥2) og ANOVA-test (p 0,05) hos børn vs. Normal og normal vs CRC sammenligninger; og disse resultater blev også bekræftet med Tukey-test i tilfælde af Cdc2 /CDK1 og CCNE1. PCR validering bekræftede tendensen af ​​genekspression ændringer i alle tilfælde i forhold til proliferation regulering. CDKN2B, MKI67 cdc2 /CDK1 og CCNE1 viste borderline væsentlige mRNA ekspression ændringer i tidligere nævnte sammenligninger, ifølge Fold forandring. Tukey post-test rekrutteret genekspression ændringer under aldring og kolorektal carcinogenese i tilfælde af CDC2 /CDK1 (p 0,05).

Antallet af apoptose-regulerende gener (ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 og SERPINB9) blev også analyseret med RT-PCR. Genekspression af ACVR1B, TNFSF10 og DYRK2 var signifikant lavere hos børn og CRC prøver sammenlignet med normale voksne tyktarmsslimhinde (FC≤0.5 eller FC≥2; p 0,05); og disse resultater blev bekræftet af RT-PCR samt. Ifølge resultaterne af Affymetrix undersøgelse, mRNA-ekspression af anti-apoptotiske gener, såsom SOCS3, IFI6 og SERPINB9, viste signifikant højere ekspression hos børn og CRC prøver sammenlignet at for at histologisk intakt voksne colon prøver. PCR validering bekræftede tendensen af ​​genekspression ændringer mellem børn vs. Adult Normal and Adult Normal vs. CRC. ANOVA og Tukey-test analyse af RT-PCR-resultater har kontrolleret disse ændringer i tilfælde af SOCS3 og IFI6 (p 0,05). Ekspressionssystemer ændringer af de udvalgte gener er opsummeret i

Tabel 4

.

Diskussion

Aging er associeret med øget forekomst af sporadiske colorektale maligniteter, som er en af ​​de fremtrædende årsager til dødelighed i de vestlige lande [33]. Kolorektal cancer er relateret til ukontrolleret celleproliferation og dysreguleret apoptose. Juvenile vækst, på den anden side, er karakteriseret ved kontrolleret vækst, cellulær proliferation og apoptose [34].

I denne undersøgelse den proliferative og apoptotiske aktivitet i intakt humant colorektal epitel fra børn og voksne sammenlignet med den i adenom og kolorektal cancer blev undersøgt. Ekspression af de beslægtede gener blev også testet i mRNA microarrays. Vi fandt en øget proliferativ og en nedsat apoptotisk aktivitet hos børn og kræft prøver i forhold til normal voksen epitel.

Disse resultater tyder på en modstander molekylær regulering af proliferation og apoptose under normal aldring og kolorektal carcinogenese. Forbedret cellulær proliferation af tumorceller uden “aging” kan bidrage til deres overlevelse fordel over tilstødende aldrende celler.

En øget cellulær proliferation påvises hos børn colorectal slimhinde kan relateres til den fysiologiske vækst i tyktarmen imidlertid cellefornyelsen sinker under normal ældning i histologisk intakte voksne colon krypt. Celledeling og apoptose regulering mellem kontrolleret vækst i barndommen og ukontrolleret vækst i CRC ikke er korreleret før i colon mucosa. Her fandt vi flere spredning fremme gener, herunder cyclin B1 /CCNB1 /cyclin E1 /CCNE1 /og cyklin-afhængige kinase (CDK1), der skal opreguleret i både unge og kræft prøver i forhold til normal voksen slimhinde (

Figur 3

). Disse resultater korrelerer godt med vores finde væsentligt højere prolifererende celle fraktioner hos børn og kræft vævssnit sammenlignet med normale voksne prøver. CDKer, ja, har afgørende rolle i reguleringen af ​​celle-cyklus og vækst i eukaryote celler. CDK-komplekser er en særdeles konserveret familie af Ser /Thr-proteinkinaser, der består af en katalytisk CDK-underenhed og en aktiverende cyclin subunit. Forskellige CDK’er kan styre forskellige dele af cellecyklen; disse komplekser kan aktiveres ved phosphorylering, binding aktiverende cykliner eller inhibering underenheder [35] – [36]. CCNB1, CCNE1 og CDK1 udtryk, som kan korrelerer til en øget proliferativ aktivitet, var højere hos børn og neoplastisk colon mucosa i forhold til normal voksen slimhinde. Desuden cyclin D1 (CCND1), CDK1 og CDK6 mRNA niveauer signifikant højere i CRC sammenlignet med normale børn prøver, som kan være relateret til celleproliferation i kræft (

Figur 4

). Cyclin D1 har adskillige regulatoriske virkninger i normal cellulær differentiering, vækst og metabolisme; imidlertid overekspression af CCND1 er en af ​​de mest almindeligt observerede ændring i humane cancere, som det har cellecyklus-regulerende virkninger i G1-fasen [37]. Ifølge

Zhang et al.

Resultater, kan den abnorme opregulering af cyclin D1 være et tidligt begivenhed i intestinal carcinogenese [38].

Sahl et al.

Har undersøgt ekspressionen af ​​forskellige cyclin-afhængige kinaser i human coloncancer. De bemærkede, at aktiveringen af ​​CDK1, CDK2 og CDK6, som kan phosphorylere retinoblastomaproteinet, hvilket resulterer i frigivelse fra inhibering af forward progression af G1-fasen, er i forbindelse med human colorectal carcinogenese [39].

der er flere regulatoriske molekyler, der kan modulere og blokerer funktionen af ​​CKDs, kaldet cyclinafhængige kinaseinhibitorer. I vores foreliggende undersøgelse undersøgte vi mRNA-ekspression ændringer af CDKN2B i fremgangsmåderne ifølge aldring og colorektal carcinogenese. CDKN2B er også kendt som multipel tumorsuppressor 2 (MTS2), cyclin-afhængige kinaser 4 og 6 bindende protein eller p15-INK4b (p15). CDKN2B er placeret ved siden tumor suppressor CDKN2A i kromosomet 9, som ofte er muteret og slettes i en bred vifte af neoplasmer. Dette gen koder for et cyclin-afhængig kinase inhibitor, der kan producere komplekser med CDK4 og CDK6, inhibering af cellevækst eller celle-cyklus. I microarray analyse blev fundet en moderat mRNA udtryk for CDKN2B i velkontrollerede, hyper-proliferativ colon biopsiprøver fra børn i forhold til histologisk intakt voksen colon mucosa, og en bemærkelsesværdig reduktion genekspression blev observeret i CRC prøver (

Figur 3

). Ifølge tidligere undersøgelser, kan CDKN2B fungere som et tumorsuppressorgen og et potentielt effektor af TGFp-induceret celle-cellecyklusstandsnings [40].

Herman et al.

Attesteret, at gen-silencing af p15 ved CpG ø hypermethylering kan forårsage neoplastiske lidelser [41]. Signifikant tab af disse geners funktioner kan bidrage til celleproliferation i CRC.

I immunhistokemisk analyse, en moderat nedsat apoptotisk aktivitet blev fundet hos raske børn kolorektale biopsiprøver sammenlignet med raske voksne, og det blev dramatisk reduceret i løbet af adenom-carcinom-sekvensen. mRNA ekspression ændringer af apoptose-fremkaldende eller hæmmende gener analyseret i vores undersøgelse (fx ACVR1B, TNFSF10, DYRK2, SOCS3, IFI6 og SERPINB9) kan forklare dette fænomen.