PLoS ONE: DNA Methylering-Guided Forudsigelse af Klinisk Svigt i High-Risk Prostata Cancer

Abstrakt

Baggrund

Prostatakræft (PCA) er en meget heterogen sygdom med hensyn til kliniske resultat. Denne undersøgelse udforskede differential DNA methylering i a priori udvalgte gener til at diagnosticere PCa og forudsige klinisk svigt (CF) hos patienter med høj risiko.

Metoder

En kvantitativ multiplex, methylering-specifik PCR assay blev udviklet til at vurdere promotor methylering af

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

og

RaRb

gener i formalinfikserede faste, paraffinindstøbte vævsprøver fra 42 patienter med benign prostatahyperplasi og radikal prostatektomi eksemplarer af patienter med høj risiko PCa, der omfatter uddannelse og validering kohorter af 147 og 71 patienter. Log-rank test, blev univariate og multivariate Cox modeller bruges til at undersøge den prognostiske værdi af DNA methylering.

Resultater

Hypermethylering af

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

og

RaRb

var meget kræft-specifikke. Men kun

GSTP1

methylering var signifikant associeret med CF i både uafhængige højrisiko PCA kohorter. Vigtigere, trichotomization ind lav, moderat og høj

GSTP1

methylering niveau undergrupper var yderst prædiktive for CF. Patienter med enten en lav eller høj

GSTP1

methylering niveau, i forhold til de moderate methylering grupper var på en højere risiko for CF i både uddannelse (Hazard ratio [HR], 3,65; 95% CI, 1,65 til 8.07) og validering sæt (HR, 4,27; 95% CI, 1,03-17,72) samt i den kombinerede kohorte (HR, 2,74; 95% CI, 1,42-5,27) i multivariat analyse

konklusioner.

Klassifikation af primære højrisiko-tumorer i tre undertyper baseret på DNA-methylering kan kombineres med klinisk-patologiske parametre for en mere informativ risiko-lagdeling af disse PCA patienter

Henvisning:. Litovkin K , Van Eynde A, Joniau S, Lerut E, Laenen A, Gevaert T, et al. (2015) DNA Methylering-Guided Forudsigelse af Klinisk Svigt i High-Risk prostatakræft. PLoS ONE 10 (6): e0130651. doi: 10,1371 /journal.pone.0130651

Academic Redaktør: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, ØSTRIG

Modtaget: August 29, 2014 Accepteret: 25. maj 2015; Udgivet: 18 Jun 2015

Dette er en åben adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af Fonden Fournier-Majoie (FFM ), Industrial Research Fund af KU Leuven (IOF-HB 07/04 og IBS-HB /12/011), og den belgiske Kræftplan (aktion 29_023). DNAlytics SA ydet støtte i form af løn til forfattere [PG og TH], men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. . De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« afsnittet

Konkurrerende interesser: En GB patent med overskriften »Marker gen baseret prognose for prostatakræft«, blev indgivet i UK med prioritetsdato den 27. januar 2014 (GB1401371.8), og med AVE, KL og MB som opfindere. TH er den administrerende direktør og Pierre Gram den ledende analytiker af DNAlytics, SA (Chemin du Cyklotron 6, 1348 Louvain-la-Neuve, Belgien). Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

I de seneste to årtier, den udbredte implementering af serum prostata-specifikt antigen (PSA) test har ført til en dramatisk stigning i diagnosticering af prostatacancer (PSA) [1]. Men mange af de PSA-diagnosticeret tumorer er klinisk irrelevant. Kun omkring en fjerdedel af patienterne med nydiagnosticeret PCa anses for at være i høj risiko for at udvikle dødelig sygdom, manifesteret ved klinisk svigt (CF) og kræft dødsfald (CRD) [2-4]. Ifølge European Association of Urology (EAU) og (NCCN) National Comprehensive Cancer Network retningslinjer, er disse højrisiko PCA patienter defineret ved klinisk fase ≥T3a, en biopsi Gleason score på 8-10 og /eller et serum PSA-niveau 20 ng /ml [5,6]. Ikke desto mindre er 62-84% af PCA højrisikopatienter oplever kræft-specifik overlevelse på mindst 15 år efter radikal prostatektomi (RP), hvilket viser, at ikke alle patienter i denne gruppe har en dårlig prognose [7]. Denne heterogene kliniske resultat i gruppen med høj risiko er potentielt forklares ved brug af risikoen lagdeling modeller, som ikke tager hensyn til underliggende (EPI) genetiske og molekylære karakteristika tumoren, der bestemmer tilstedeværelsen af ​​mikrometastaser. Derfor er et af de vigtigste udfordringer i moderne PCa forskning er at identificere biomarkører, der forbedrer forudsigelsen af ​​CF og CRD. En bedre karakterisering af patienter med høj risiko PCa på molekylært niveau bør give en mere personlig medicin, der matcher behandling intensitet til sygdom aggressivitet og forventet prognose. Men til dato er der ingen etableret klinisk indikation for brug af molekylære forudsigelsesværktøjer.

Det er nu velkendt, at både mutationer og epigenetiske ændringer, især forskellen DNA methylering, spille en rolle i carcinogenese [8]. DNA methylering, som primært forekommer på cytosin rester i en sekvens forbindelse med CpG-dinukleotider, finder sted på forskellige regioner i genomet, dvs. promoter CpG øer (promoter-associerede CpG-tætte regioner), promoter CpG ø kyster (region med lavere CpG tæthed i nærheden af ​​CpG ø), gen-organer og repetitive sekvenser [9]. I den voksne humane genom fleste CpG’er er methyleret, med undtagelse af promotoren CpG-øer og kyster. Det er almindeligt accepteret, at PCa er forbundet med ændring af disse mønstre, der omfatter hele genomet hypometylering samt promotor-specifik hypermethylering [8-12]. En global hypometylering opdages ved mange genomisk loci, herunder gentagne elementer og gen-organer, der bidrager til genome ustabilitet og falsk transkriptionelle indvielser, hhv. Promotor-associeret hypermethylering er forbundet med gendæmpning og fremmer PCa progression ved inaktivering af tumorsuppressorgener [8,13]. I PCa har forskellige hypermethyleret gener blevet identificeret, med

GSTP1

bliver de oftest ændret og studerede [13].

Med den foreliggende undersøgelse, vi havde til formål at udvikle en pålidelig kvantitativ analyse til samtidigt bestemme promotor methylering niveauer i a priori valgte PCa-koblede gener

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

RaRb

PTGS2

, og for at vurdere deres diagnostiske og prognostiske værdi for højrisiko PCA patienter [13].

Materialer og Metoder

patienter og prøvetagning

patienter med højt -risk PCa blev udvalgt i henhold til de kriterier, som EAU og NCCN, dvs. et klinisk fase ≥T3a, en biopsi Gleason score på 8-10 og /eller PSA niveauer 20 ng /ml [5,6]. Formalin-fikseret, paraffin-indstøbt (FFPE) normal prostata og PCA væv blev opnået fra University Hospitals Leuven (UHL, Leuven, Belgien) og University Hospital i Würzburg (UHW, Würzburg, Tyskland). På UHL opnåedes prøver fra patienter med benign prostatahyperplasi (BPH, n = 42) eller høj-risiko PCa (PCa2, n = 71). Prøver fra højrisiko PCA patienter blev også opnået fra UHW (PCa1, n = 147). Præoperativ staging i begge kohorter omfattede en digital rektal undersøgelse, en abdominopelvic-computertomografi (CT) scanning og en knoglescanning. Neoadjuverende hormonelle, strålebehandling eller kemoterapi behandling var et kriterium udstødelse. Staging og planering af prostatacancer prøver (hele mount sektioner, 4 mM intervaller) blev udført ifølge TNM klassifikationen 2002 og Gleason klassificeringssystem, som tidligere beskrevet [14]. Opfølgning blev udført hver 3. måned i de første 2 år efter operationen, hver 6. måned i de følgende 3 år, og derefter årligt. CF blev erklæret når enten lokalt recidiv eller fjernmetastaser blev histologisk påvist eller bekræftet af CT eller knoglescanning. De klinisk-patologiske karakteristika for alle kohorter er beskrevet i tabel 1. Af de patienter af PCa1 og PCa2 kohorter, 84% og 21%, henholdsvis modtaget adjuverende behandlinger (radioterapi og /eller hormonbehandling). Undersøgelsen blev godkendt af Medical Ethics Kommissionen Universitetshospital Leuven. Sidstnævnte tilladelse til at udføre denne retrospektiv undersøgelse uden informeret samtykke, fordi kun arkiveret PCA prøver (venstre-over FFPE blokke) blev anvendt. Alle prøver blev analyseret anonymt.

Cell kultur

Menneskelig prostata PC-3 (CRL-1435, American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA), LNCaP ( ATCC, CRL-1740) og DU 145 (ATCC, HTB-81) celler blev dyrket som monolag i 50% Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og 50% Hams F12, RPMI1640 og DMEM henholdsvis suppleret med 10% føtalt kalveserum . PZ-HPV-7-celler (ATCC, CRL-2221), en udødeliggjort cellelinie afledt fra normale humane prostataceller, blev dyrket i keratinocyt-serumfrit medium suppleret med 5 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor og 0,05 mg /ml bovint hypofyse ekstrakt. Den benign prostatahyperplasi BPH-1-celler venligst stillet til rådighed af professor J. Swinnen (KU Leuven, Belgien) og blev opretholdt i RPMI medium 1640 plus 10% føtalt kalveserum [15].

dna-ekstraktion og bisulfit konvertering

Fuldblod humant genomisk DNA blev købt fra Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA. Fra cellelinier genomisk DNA blev ekstraheret under anvendelse af GenElute Mammalian Genomisk DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). I BPH kohorten, blev genomisk DNA ekstraheret fra hele paraffin sektion, ved hjælp af WaxFreeTM DNA kit (TrimGen, Sparks, MD, USA). For begge PCA kohorter blev FFPE blokken med den største tumor område hentet frem, og områder med 90% kræft væv, som omfatter både tumor epitelial og tumor-associerede stromaceller, var præget af den samme uro-patolog og efterfølgende macrodissected. Isolering af genomisk DNA udførtes ifølge en standard phenol-chloroform procedure. Dernæst genomisk DNA (~ 500 ng) fra hver prøve var bisulfit omdannet ved anvendelse af EZ DNA-methylering kit (Zymo Research Corp., Orange, CA, USA) ifølge producentens protokol, og elueret i 25 pi H

2O .

Methylering-uafhængig (MI) PCR og kloning Salg

MI primere indeholdende maksimalt én CpG stedet tæt på 5 ‘enden blev udformet til at amplificere 100-200 basepar (bp) fragmenter omkring transkriptionsstartsitet af

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

RaRb Hotel (tabel A i S1-fil , figur A i S1 File). MI-PCR blev udført som tidligere beskrevet [16]. Efterfølgende blev amplificerede fragmenter klonet i DH5a kompetente celler (Invitrogen Ltd, Paisley, UK) ved anvendelse af pGEM-T Easy Vector System (Promega Corporation, Madison, WI, USA) og omkring 4 kolonier blev tilfældigt udvalgt og analyseret ved dideoxynukleotidsekventering. Plasmider med DNA-inserter, der svarer til fuldt methyleret (afledt af LNCaP eller PC-3-celler) eller umethyleret (afledt af humant fuldblod) promotorregioner efter omdannelse med bisulfit, betegnet plasmider pM og Pu, henholdsvis blev udvalgt til yderligere anvendelse i andet trin i den kvantitative multiplex methylering-specifik PCR (QM-MSP) assay [16].

QM-MSP assay

En QM-MSP assay blev udviklet for at kvantificere promotor methylering tilstand

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

og

RaRb Hotel (Figur A i S1 File). En detaljeret protokol er beskrevet i [15], og alle primersæt er defineret i tabel A i S1 Fil. Kort fortalt i den første PCR-reaktion af en blanding af validerede gen-specifikke primere blev anvendt til at co-forstærke initiativtagere til

GSTP1

,

CCND2

,

RaRb

,

PTGS2

og

APC

gener uanset deres methylering status (MI primersættene i tabel A i S1-fil). For at sikre at QM-MSP kan anvendes med stærkt fragmenteret DNA, som ofte er problematisk i DNA isoleret fra FFPE væv blev de multiplex primere designet til at amplificere PCR-fragmenter af ≈ 100-200 bp. I den anden PCR-reaktion blev den absolutte kvantificering af methylerede og ikke-methylerede DNA-fragmenter separat udført for hvert gen med de validerede kvantitative methylerede og ikke-methylerede primere (MSP og USP primere sæt henholdsvis i tabel A i S1 Filer Figur B i S1 Fil). Endelig, for at beregne% af DNA-methylering mængden af ​​totalt DNA blev afledt fra summen af ​​methyleret og umethyleret DNA (U + M). Kun prøver, der indeholder 3000 gen kopier efter præ-forstærkning blev accepteret til kvantificering, som beskrevet i [16]. Den methylering af

GSTP1

,

APC

og

CCND2

blev kvantificeret i 147 og 70 prøver fra PCa1 og PCa2 kohorter, hhv.

PTGS2

blev kvantificeret i 147 og 66 prøver og

RaRb

i 146 og 66 prøver fra PCa1 og PCa2 kohorter, henholdsvis.

Immunhistokemi

FFPE sektioner af kohorte PCa2 blev farvet på en BOND MAX autostaineren (Leica). Kort fortalt blev paraffinindlejrede sektioner først afvokset, og antigen hentning blev udført i BOND epitop-hentning løsning 1 (Leica). Muse monoklonalt 3F2 anti-GSTP1 (1: 2000, 3369) og kanin monoklonalt anti-ERG (1: 100, ab92513) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA) og Abcam (Cambridge, UK), hhv. Slides blev analyseret ved lysmikroskopi, revideret og scoret af en uropathologist, ifølge den Allred metoden [17]. Den Allred score er en semi-kvantitativ system, der tager højde for den andel af positive celler (skala 0-5) og farvning intensitet (skala 0-3). Andelen og intensitet score blev summeret for at opnå de samlede score på 0, 2-8. En score på 0-2 blev betragtet som negative, mens 3-8 blev taget som positiv [17].

Statistisk analyse

BPH kohorten blev brugt til at bestemme baseline methylering niveauer for alle DNA methylering markører. Modtageren-operativsystemer-egenskaber (ROC) analyse, følsomhed, specificitet, og positiv /negativ prædiktiv værdi blev bestemt ved hjælp MedCalc til Windows, version 12.5 (MedCalc Software, Ostend, Belgien). Associationen mellem methylering (som kontinuerlig variabel) og klinisk-patologiske parametre (Gleason score og patologisk stadium), blev ERG og GSTP1 immunfarvninger og stroma indhold undersøgt ved hjælp af Mann-Whitney U-test (for to kategorier) eller Kruskal-Wallis test ( i mere end to kategorier). Fisher eksakt test bruges til tilslutningen mellem to kategoriske variable. Korrelationer mellem methylering af forskellige gener blev estimeret ved Pearsons korrelationskoefficient (

r

).

Kategorisering af DNA methylering for risiko-klassificering var baseret på Cox modeller. Den funktionelle sammenhæng mellem omfanget af DNA methylering og tid-til-hændelse udfald (CF) blev udforsket ved at sammenligne en lineær trend til kvadratiske og kubiske-splines baserede funktioner ved hjælp af likelihood ratio test [18]. En eller to afskæringsværdier blev bestemt i tilfælde af manglende linearitet. Den første cut-off-værdi blev bestemt ved at overveje alle mulige dichotomizations, mens den anden blev bestemt ved fastsættelse af den første cut-off og i betragtning af alle mulige trichotomizations. Både model fit (sandsynlighed) og klinisk resultat pr datasæt blev behandlet i den endelige udvælgelse af disse afskæringsværdier.

Forskellen i risiko mellem methylering grupper blev analyseret ved univariate Cox modeller og log-rank test . Resultaterne er vist ved hjælp af hazard ratio (HR) og deres konfidensintervaller 95% (CI), og med en grafisk repræsentation tilvejebragt ved at plotte Kaplan-Meier-estimater. Multivariate Cox analyser blev anvendt til at designe klinisk-patologiske modeller med og uden methylering markører. Den prædiktive nøjagtighed begge modeller blev evalueret ved hjælp af Concordance Sandsynlighed Estimate (CPE), en AUC-lignende indeks for tid-til-hændelse data, med værdier mellem 0,5 (ingen prædiktiv værdi) og 1 (perfekt prædiktiv værdi) [19 ]. For at sikre, at den målte CPE er reproducerbar på out-of-sample patienter, gentagne tilfældige sub-sampling krydsvalidering blev anvendt. Kategoriseringen af ​​DNA methylering beskrevet ovenfor, og vægten af ​​en Cox model blev indstillet på uddannelsesmæssige sæt og evalueret på de tilsvarende test sæt. Vi udførte 200 tilfældige splittelser i den kohorte i 80% uddannelse sæt og 20% ​​test sæt. Analyser blev udført under anvendelse af SAS-software version 9.2 til Windows (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

P

-værdier. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Methylering af de fem markørgener i humane prostata-cellelinjer og fuldblod

genspecifikke primerpar blev designet til at opformere de CpG-øer i promotorregionen af ​​

GSTP1

,

APC

,

RaRb

,

CCND2

, og

PTGS2

, uafhængigt af deres methylering status (tabel A i S1 File). Amplifikation af disse loci blev udført i natrium-bisulfit omdannede genomisk DNA isoleret fra 5 humane prostata cellelinjer, herunder tre PCa (LNCaP, PC-3 og DU 145) og to godartede (PZ-HPV-7 og BPH-1) cellelinier og i genomisk DNA isoleret fra humant helblod fra en cancer-fri person. DNA bisulfit sekventering af disse klonede fragmenter viste, at næsten alle CpG-dinukleotider blev methyleret i LNCaP og /eller PC-3-cancercellelinjer, men ikke i godartede cellelinjer og blod (illustreret i figur A i S1-fil for

APC

). Dernæst blev QM-MSP for de fem udvalgte gener udviklet som beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet og udføres i disse seks genotyper (tabel 2). Alle gener blev fuldstændigt methyleret (≥99% methylering) i de hormon-sensitive LNCaP-celler, i overensstemmelse med vores bisulfit sekventering data og tidligere undersøgelser [20]. I hormon-refraktær cellelinjer PC-3 og DU 145, DNA methylering niveauerne var mindre fremtrædende, da kun to gener (

APC

og

PTGS2

) var 100% denatureret i PC 3 linje, mens ingen af ​​generne blev fuldstændig methyleret i DU 145 celler. DNA methylering i de ikke-maligne genotyper, herunder BPH-1, PZ-HPV7 og fuldblod, blev ikke detekteret i

GSTP1

,

RaRb

,

PTGS2

,

CCND2

, og

APC

gen loci, bortset fra

CCND2

i BPH-1, hvilket var 13% methyleret.

kræft- specifik DNA methylering i PCa

højrisiko

Næste, promotoren methylering af

APC

,

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

og

RaRb

blev kvantificeret i FFPE prostata vævsprøver, ved hjælp af QM-MSP procedure. Prøverne blev afledt af transuretral resektion eller adenomectomy eksemplarer af 42 patienter med BPH og radikal prostatektomi eksemplarer af 218 patienter med høj risiko PSA. PCA patienter omfattede to grupper, yderligere betegnet som PCa1 eller uddannelse kohorte (

n

= 147) og PCa2 eller validering (

n

= 71) kohorte. I BPH kohorte, har den gennemsnitlige methylering niveauet af disse markørgener ikke overstige 2% (figur 1, tabel B S1 File). Der blev imidlertid påvist en langt højere grad af CpG-methylering for alle gener i både høj risiko PCA kohorter, hvilket indikerer en cancer-specifik methylering af udvalgte markører (figur 1, tabel C og D i S1 File). Med en methylering cutoff værdi på 1 eller 2%,

GSTP1

viste den højeste følsomhed i PCa1 (0,99) og PCa2 (0,97) kohorter, ved en specificitet på 1,00 for de fem enkelte markører (tabel E i S1-fil ). Andre kombinationer af markørgener ikke yderligere at forbedre følsomheden uden at reducere specificiteten (tabel E i S1 File). For yderligere at vurdere nøjagtigheden i udslagsgivende højrisiko-PCa fra BPH blev receiver-operativsystemer-egenskaber (ROC) analyse for hver af de enkelte markører udføres, og arealet under kurven (AUC) blev beregnet (figur 1). AUC varierede fra 0,85 (

PTGS2

) til 0,99 (

GSTP1

), hvilket bekræfter kræftspecifikke methylering, med

GSTP1

methylering som den bedste klassificeringen.

methylering af

RaRb

,

GSTP1

,

APC

,

CCND2

PTGS2

blev bestemt ved QM-MSP i radikal prostatektomi prøver fra 42 patienter med BPH og fra 147 (PCa1) og 71 (PCa2) patienter med høj risiko PCa. Dataene er vist i dot grunde til de angivne gener (A-E, venstre grafer). Methylering niveauer af hvert gen i hver PCa kohorte var betydeligt højere end i BPH-gruppen, som bestemt ved Mann-Whitney U-test (*, P 0,001). Receiver-operativsystem-karakteristik (ROC) analyse af methylering markører til at skelne BHP fra prøver højrisiko-prostatacancer (A-E, middle, PCa1 og højre, PCa2), ved hjælp af de data, der vises i dot plots blev udført. Grå linje, median; AUC, areal under kurven.

Methylering heterogenitet i højrisiko PCa

methylering niveau alle enkelte gener varierede fra 0% til ~ 80%, hvilket tyder på en enorm inter og intratumor molekylær heterogenitet i prostata tumorer højrisiko-(figur 1). Siden DNA blev ekstraheret fra områder med 90% kræft væv, som omfatter både tumor-epiteliale og tumor-associerede stromaceller, vi har semi-kvantificeres stroma indhold af væv fra PCa2 kohorten og analyseret sammenhængen med

GSTP1

DNA-methylering. Stroma indhold varierede fra 10% til 35% med to outliers på 40 og 60% (tabel F i S1 fil). Vigtigt er det, er der ikke sammenhæng fundet mellem

GSTP1

indhold DNA methylering og stroma, som analyseres af Spearman (

P

-værdi, 0.1550), Kruskal-Wallis og Fisher eksakte test (tabel G i S1 fil), hvilket indikerer, at forskellen i stroma indhold er ikke den underliggende årsag til inter- og intra- heterogenitet af DNA-methylering. Derfor er vores data er i overensstemmelse med den opfattelse, at der er en stor inter og intra- heterogenitet i højrisiko-PCa på DNA methylering niveau.

Interessant, ved rangordning patienterne af uddannelsen og validering kohorter i henhold til den methylering niveau af

GSTP1

, den hyppigst methylerede markørgen, fandt vi, at methylering niveauet for de øvrige 4 markører generelt fulgt det samme mønster i begge kohorter (fig 2A). Desuden scatter plot analyser mellem methylering af

GSTP1

og de andre gener (Fig 2B og figur C S1 File) viste, at tumorer, som ikke var methylerede på

APC

,

CCND2

,

PTGS2

eller

RaRb

, blev ofte methylerede på

GSTP1

, med niveauer fra ~ 5 til 70%. Men hvis tumorerne hypermethyleret på

APC

,

CCND2

,

PTGS2

eller

RaRb

, deres methylering grad var generelt proportional med

GSTP1

methylering niveauer. Disse resultater blev bekræftet af de meget betydelige positive Pearson korrelationskoefficienter af methylering niveauer af disse markører (

r

= 0,45-0,82;

P

0,001; Tabel H i ​​S1 File). Tilsammen viser disse data, at methylering af de fem gener er moderat til stærkt korreleret og sandsynligvis forekommer i de samme celler.

Farve-skaleret repræsentation af DNA methylering i tumorer fra PCa1 og PCa2 kohorter. (A) Patienterne blev beordret i henhold til deres

GSTP1

methylering værdi. Den% af methylering af andre 4 markørgener er også vist. Grå felter angiver manglende værdier. (B) Scatter plots af sammenhængen mellem

GSTP1

methylering og

RaRb

methylering i PCa1 (venstre panel) og PCa2 (højre panel) kohorter.

Promotor hypermethylering versus klinisk-patologiske parametre

Korrelationer mellem methylering af gen loci, blev den patologiske stadium (pT), og Gleason score (GS) evalueret i begge PCA kohorter. Ingen af ​​markørerne viste en signifikant association med pT, som blev kategoriseret i fire grupper (pT2, pT3a, pT3b og pt4). For GS blev data adskilt i grupper med lav (GS2-6), mellemprodukt (GS7) og høj kvalitet (GS8-10). De mediane methylering niveauer for disse grupper er givet i tabel 3. Baseret på Kruskal-Wallis og Mann-Whitney U test blev ingen af ​​markørerne signifikant associeret med GS i begge kohorter (tabel 3 og Tabel I i S1 File). Parvise sammenligninger af GS grupper viste, at kun

PTGS2

methylering blev øget betydeligt i GS8-10 og GS7 i forhold til GS2-6, i PCa1 (tabel I i S1 File).

APC

og

RaRb

methyleringer kun var signifikant højere i GS7 i forhold til GS2-6, i PCa2 (tabel I i S1 File).

GSTP1

methylering forudsiger klinisk svigt i højrisiko-PCa patienter

Dernæst har vi undersøgt sammenhængen mellem omfanget af markør methylering og klinisk svigt, hjælp Cox modeller [21]. Klinisk fiasko blev erklæret når enten lokalt recidiv eller fjernmetastaser blev histologisk påvist eller bekræftet af CT eller knoglescanning. Ingen signifikant lineært forhold blev fundet mellem hver af de fem gener og CF. Da det er velkendt, at biomarkører, når de anvendes klinisk, ofte dikotomiseret, vi brugte cox-modeller til at vælge de optimale cutoffs for hver af de enkelte markører [22]. Univariate og multivariate cox regressionsanalyse viste, at dichotomization baseret på

CCND2

,

GSTP1

,

PTGS2

, eller

RaRb

methylering blev kun signifikant korreleret med CF i en kohorte, hvilket indikerer, at det er klinisk irrelevant (tabel J i S1 File). Ikke desto mindre, bemærkede vi, at

GSTP1

methylering var signifikant forbundet med CF i PCa1 og PCa2 når forskellige cutoffs blev brugt, dvs., 15% og 50% (tabel J i S1 File). Derfor undersøgte vi det kliniske resultat af flere

GSTP1

methylering undergrupper. De højrisiko tumorer blev kategoriseret i tre grupper, baseret på den

GSTP1

methylering niveau, dvs. lav methylering (LM, methylering 15%), moderat methylering (MM, methylering 15-50%) og høj methylering (HM, methylering 50%). Patienter med enten lav eller høj methylering, sammenlignet med de moderate methylering grupper, var på et væsentligt højere risiko for CF i uddannelse PCa1 kohorte, som vist ved univariate Cox regressionsanalyse (tabel 4; HR, 2,96; 95% Cl, 1,38 -6,36;

P

-værdi 0,005). Denne øgede risiko blev valideret i PCa2 kohorten (tabel 4, HR, 3,34; 95% CI, 1,03-10,89;

P

-værdi 0,045) samt den kombinerede kohorte (tabel 4, HR, 2,59; 95% Cl, 1,38-4,87;

P

-værdi 0,003). Desuden univariate Cox regressionsanalyse af præoperativ PSA, GS og pT viste, at kun GS var en signifikant prædiktor for klinisk svigt i begge kohorter (tabel 4). Den prognostiske magt GS i disse kohorter er i overensstemmelse med adskillige tidligere undersøgelser [14,23,24].

For yderligere at understøtte den opfattelse, at trichotomization af PCA højrisikopatienter baseret på deres

GSTP1

methylering niveau forbedrer forudsigelse af kliniske resultater, overlevelsessandsynligheder for hver gruppe blev vist ved hjælp af Kaplan-Meier plot (fig 3). Denne analyse viste en signifikant adskillelse i kurverne i både uddannelse (log-rank test,

P

-værdi 0,014) og validering (log-rank test,

P

-værdi 0,043) kohorter samt i den kombinerede kohorte (log-rank test,

P

-værdi 0,006) (fig 3A, 3C og 3E). En sammenligning af LM + HM og MM grupper viste, at mere end halvdelen af ​​PCA højrisikopatienter blev klassificeret i MM undergruppen og havde en meget bedre CF overlevelse i PCa1 (log-rank test,

P

-værdi 0,007) og den kombinerede gruppe (log-rank test,

P

-værdi 0,002). Men denne forskel var borderline i PCa2 kohorten (log-rank test,

P

-værdi 0,062).

Kurverne viser CF-overlevelse af patienterne fra det lave (LM, 50%

GSTP1

methylering) grupper i PCa1 (A), PCa2 (C) og PCa1 + 2 (E). Sammenligning af CF-overlevelse mellem MM og LM + HM grupper PCa1 (B), PCa2 (D) og i PCa1 + 2 (F) er også vist. CF, klinisk svigt;

P

, log-rank test

P

-værdi.

P

-værdi, log rank test.

Det er vigtigt, at trichotomized

GSTP1

methylering opstod som en selvstændig indikator for CF, når der korrigeres for pT, endelig GS, præoperativ PSA-niveau i både uddannelse (tabel 4, HR, 3,65; 95% CI, 1,65-8,07;

P

-værdi 0,001) og validering kohorter (tabel 4, HR, 4,27; 95% CI , 1,03-17,72;

P

-værdi 0,046), såvel som i den fælles kohorte (tabel 4, HR, 2,74; 95% CI, 1,42-5,27;

P

-værdi 0,003 ). Blandt de andre testede variabler, kun GS også opstået som selvstændig indikator for CF i både den enkelte og kombinerede kohorter. Således DNA methylering har forudsigelseskraft uafhængig af GS i højrisiko-PCa.

Næste sammenlignede vi den prædiktive værdi af modellen for CF, herunder alle klinisk-patologiske parametre, med og uden trichotomized

GSTP1

methylering, ved hjælp af Concordance Probability Skøn (CPE’ere) [19]. Forestillingen foranstaltninger blev væsentligt forbedret ved inddragelse af

GSTP1

methylering i den kliniske model i begge kohorter (tabel 5). Således kan nøjagtigheden af ​​prædiktive modeller for CF baseret på klinisk-patologiske parametre forbedres yderligere ved optagelse af trichotomized

GSTP1

methylering model.

Methylering-guidede risiko-stratificering af patienter med høj risiko PCa

Da overlevelsen analyser viste, at patienter med enten lave eller høje niveauer af

GSTP1

methylering er på et højere risiko for CF end dem med moderat

GSTP1 Salg methylering niveauer, vi udforsket methylering af den anden 4 testede markører i disse undergrupper. Først, vi stratificeret patienterne af uddannelsen, validering og kombinerede kohorter i tre grupper, dvs. lav ( 15%), moderat (15% -50%) og høj ( 50%) methylering, ved rangordning dem efter

GSTP1

methylering niveau (fig 4A). Når data fra alle fem markørgener blev kombineret, var median methylering værdier i LM grupperne ikke overstige 6%, og bortset fra et par outliers, de absolutte værdier var mindre end 25% i både de enkelte og kombinerede kohorter (Fig 4B -4D). Dette er i overensstemmelse med de høje Pearson korrelationskoefficienter (tabel H i ​​S1 fil) og foreslår, at kun en lille procentdel af cellerne i LM tumorer blev methyleret ved markørgener. Derimod er den gennemsnitlige methylering værdier for markørgener i MM /HM grupper fyldt 18/45% (træningssæt), 28/50% (validering sæt) og 25/50% (kombineret sæt), hhv.