PLoS ONE: miR-18a Hæmmer cdc42 og spiller en Tumor Suppressor Rolle i Colorectal Cancer Cells

Abstrakt

MIR-17-92 klynge af microRNA er forhøjet i kolorektal cancer, og har en forårsagende rolle i udviklingen af ​​kræft. Af de seks miR-17-92 klynge medlemmer, miR-19a og b især er vigtige initiativtagere til udviklingen af ​​kræft og celleproliferation, mens foreløbige beviser tyder på, at miR-18a kan handle i opposition til andre klynge medlemmer til at nedsætte celleproliferation. Det blev antaget, at MIR-18a kan have en homeostatiske funktion i at hjælpe til at indeholde den onkogene virkning af hele MIR-17-92 klynge, og at forhøjede MIR-17-92 klynge aktivitet uden en tilsvarende forøgelse af MIR-18a kan fremme kolorektal tumorprogression. I tarmkræft prøver og tilsvarende normal kolorektal slimhinde, miR-18a vises lavere samlet udtryk end andre miR-17-92 klynge medlemmer. miR-18a viste sig at have en modsat rolle til andre miR-17-92 klynge medlemmer, især de vigtigste onkogene miRNA, miR-19a og b. Transfektion af HCT116 og LIM1215 kolorektale cancer cellelinjer med miR-18a efterligner nedsat proliferation, mens en miR-18a-hæmmer øget spredning. miR-18a var også ansvarlig for faldende celle migration, ændre celle morfologi, overtalelse G1 /S cyklus fasen celle anholdelse, øget apoptose, og forbedre virkningen af ​​et pro-apoptotisk middel.

cdc42

, en mediator af PI3K pathway, blev identificeret som en ny miR-18a target. Overekspression af miR-18a reduceret

cdc42

udtryk, og en luciferaseanalyse bekræftede, at miR-18a direkte er rettet mod 3’UTR af

cdc42

. MIR-18a efterligner havde en lignende effekt på proliferation som et lille molekyle inhibitor af Cdc42. Hæmning af

cdc42

udtryk vil sandsynligvis være en vigtig mekanisme, ved hvilken miR-18a svækker kræft cellevækst, med et mål protektor eksperiment afslører miR-18a påvirkninger spredning via direkte hæmning af

cdc42

. Hæmning af

CCND1

af miR-18a kan også hjælpe i denne vækst-undertrykkelse effekt. Den homeostatiske funktion miR-18a i miR-17-92 klynge i kolorektal cancer celler kan opnås gennem undertrykkelse af

cdc42

og PI3K pathway

Henvisning:. Humphreys KJ, McKinnon RA Michael MZ (2014) miR-18a Forhindrer

cdc42

Afspiller en Tumor Suppressor rolle i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 9 (11): e112288. doi: 10,1371 /journal.pone.0112288

Redaktør: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, USA

Modtaget: Juni 29, 2014, Accepteret: 9 okt 2014; Udgivet: November 7, 2014

Copyright: © 2014 Humphreys et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af en Flinders Center for Innovation i Cancer Research Grant. Denne undersøgelse blev produceret med den finansielle og anden støtte for Cancer Rådets SA Beat Cancer Project på vegne af sine donorer og delstatsregeringen i South Australia gennem Department of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Afbrydelse af normale miRNA ekspressionsniveauerne hyppigt forekommer i kolorektal cancer (CRC) udvikling [1]. miRNA, som er små ikke-kodende RNA-sekvenser, kan slå-transkriptionelt regulere ekspressionen af ​​målgener ved at binde til komplementært mål mRNA’er. De kan kløve komplementære mRNA, eller hvor der er ufuldkommen komplementaritet, kan handle gennem translationel hæmning og udskrift destabilisering [2] – [4]. Mens humane tumorer ofte er karakteriseret ved en generel mangel ved miRNA produktion og global miRNA nedregulering [5], [6], talrige undersøgelser har også vist specifikke miRNA at være forhøjet i CRC [1], [7]. Reducerede niveauer af tumor suppressor miRNA, eller over-ekspression af onkogene miRNA, bidrager til tumorudvikling ved at ændre genekspression og påvirke signalveje [8], [9]. Faktisk har nogle miRNA blevet vist at være førere af den onkogene proces, og afgørende for tumorprogression [10] – [13].

Et sådant eksempel på en miRNA med en forårsagende rolle i udviklingen af ​​kræft er miR -17-92 klynge af miRNA, som er udpeget OncomiR -1 på grund af sin onkogent potentiale [14]. MIR-17-92 klynge, der omfatter miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, og miR-92a, er almindeligt forhøjet i lymfomer og i solide tumorer, herunder kolorektal tumorer [1 ], [14] – [17]. Klyngen funktioner under både normal udvikling og onkogen transformation til at fremme spredning og angiogenese, og hæmme differentiering og apoptose [11], [12]. miRNA i miR-17-92 klynge har også været forbundet med invasion og metastase af CRC celler [18], og med dårligere overlevelse [19]. Klyngen har vist sig at koordinere flere onkogene veje, og inhibering af disse veje har terapeutisk potentiale til behandling af cancere forårsaget af MIR-17-92 dysregulering [13].

Af de seks MIR-17-92 klynge medlemmer , mIR-19a og b især er centrale promotorer af cancerudvikling og cancercelleproliferation [11], [12], [20]. I CRC-celler, har vi tidligere vist, at af klyngen medlemmer, MIR-19a og b er ansvarlige for at øge proliferation [20]. Flere undersøgelser har også vist, at miR-19a og b er påkrævet, og stort set tilstrækkelige til at fremme de onkogene egenskaber klyngen i lymfom modeller [11], [12].

In vivo

, MIR-19 var nødvendig for at fremme lymphomagenesis i en Eu-myc muse B-celle lymfom modellen [11], [12]. miR-19 overekspression førte til meget ondartede tidlig debut B lymfomer, mens invaliderende miR-19 biogenese resulterede i forsinket tumor debut, ufuldstændig penetrans, og forlænget levetid [12]. Efter miR-17-92 sletning i lymfomceller, genindførelse af miR-19 alene restaureret vækst og undertrykt apoptose [11].

I modsætning til den pro-proliferative virkning af miR-19, foreløbige beviser tyder på, at miR -18a kan virke mod de andre klynge medlemmer til at mindske celledeling [20]. MIR-18a kan være mindre forhøjet end andre medlemmer af MIR-17-92 klynge i kolorektale tumorer [17], og denne relative stigning i andre medlemmer af MIR-17-92 klynge kan begunstige øget proliferation. Det er kendt, at forskellige post-transkriptionelle regulatoriske mekanismer kan føre til forskellige niveauer af enkelte klynge medlemmer, med MIR-18a det eneste medlem af klyngen at kræve hnRNPA1 til forarbejdning [21]. Den tertiære struktur af det foldede PRI-MIR-17-92 transkript kan også bidrage til mindre effektiv behandling af MIR-18a [22], [23]. Vi antaget, at MIR-18a kan have en homeostatiske funktion i at hjælpe til at indeholde den onkogene virkning af hele MIR-17-92 klynge, og at forhøjede MIR-17-92 klynge aktivitet uden en tilsvarende forøgelse af MIR-18a kan fremme kolorektal tumor progression. Denne undersøgelse havde til formål at bestemme tumor suppressor egenskaber miR-18a i CRC-cellelinjer.

Materialer og metoder

Cell kultur

HCT116 kolorektal carcinom celler (ATCC, Manassas, VA, USA) blev opretholdt i McCoys 5A-medium (modificeret) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Bovogen Biologicals, Essendon, VIC, Australia). LIM1215 colorektal carcinomceller (ECACC, Salisbury, Wiltshire, UK) blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. Celler blev dyrket ved 37 ° C og 5% CO

2, fastholdes på 80% sammenløb, og var mycoplasma gratis

Menneskelige kolorektal vævsprøver

CRC prøver og tilsvarende normale. colorectal slimhinde blev opnået fra Flinders Tissue Bank (n = 30). Disse prøver blev indsamlet ved stump dissektion af friske kirurgiske resektioner, efter etik godkendelse fra den sydlige Adelaide Klinisk menneskelige forskningspotentiale etiske komité og skriftligt informeret samtykke fra patienterne. Specifik undersøgelse godkendelse til at undersøge miRNA ændringer i denne kolorektal væv blev opnået fra det sydlige Adelaide Klinisk menneskelige Research Ethics Committee (autorisationsnummer 204,13).

Transfektioner

cellelinjer blev omvendt transficeret med miRNA efterligner, miRNA-inhibitorer, siRNA’er, plasmid contructs og target beskyttere anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge fabrikantens protokol, i 24 og 96 brønds plade formater (100 000 og 20 000 celler pr henholdsvis). For efterligne eksperimenter, miR-18a, miR-19a og b, og negativ kontrol (NC) miRNA oligonucleotidduplexer (GenePharma, Shanghai, Kina) blev anvendt ved 20 nM hver. miR-18a og NC Locked Nucleic Acid (LNA) hæmmere (Exiqon, Vedbæk, Danmark) (IDSs: 18a: 410101-00, NC: 199.004-00) blev anvendt ved 50 nM. Pre-designede Mission siRNAs for

cdc42

(celledeling cyklus 42) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (ID’er: SASI_Hs01_00222990, SASI_Hs02_00332553) eller en NC siRNA (ID: SIC001) blev omvendt transficeret ved en total koncentration på 20 nM. Co-transfektion blev udført under anvendelse af 200 ng plasmid-DNA (nærmere oplysninger om konstruktioner nedenfor) med 50 nM MIR-18a eller NC miRNA efterligner. Supplerende co-transfektionsforsøg blev udført med 20 nm MIR-18a eller NC miRNA efterligner og med miScript target beskyttere (Qiagen, Valencia, CA) konstrueret til MIR-18a forudsagte målgen

cdc42

, eller en negativ kontrol miScript mål protector (ID: MTP0000002). Target beskyttere blev designet til de to potentielle miR-18a bindingssteder i

cdc42

3’UTR ved hjælp af en Qiagen algoritme, og blev omvendt transfekteret i den anbefalede koncentration på 500 nM for hvert mål protektor. Målet protector kontekst sekvens (region 3’UTR flankerer bindingssted) for første målsted i

cdc42

3’UTR var 5’AATGAAGAAAAGTATTGCACCTTTGAAATGCACCAAATGA3 ‘, og for det andet target-stedet i

cdc42

3’UTR var 5’GTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTG3 «. Yderligere mål beskyttere blev designet til den enkelte potentielle miR-18a bindingssted i

CCND1

3’UTR (kontekst sekvens: 5’TAGATGTGTAACCTCTTCACCTTATTCATGGCTGAAGTCA3 «), og forsøg blev udført som for

cdc42

ovenfor . Celler blev dyrket i 24-48 timer efter transfektion.

Relativ kvantificering real-time RT-PCR

TRIzol Reagent (Invitrogen) blev anvendt til at lysere dyrkede celler og humane vævsprøver. Totalt RNA blev ekstraheret ifølge producentens anvisninger. RNA blev kvantificeret under anvendelse af en NanoDrop-8000 spektrofotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). miRNA ekspression analyse blev udført ved relativ kvantificering real-time RT-PCR under anvendelse af TaqMan miRNA assays (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). cDNA blev syntetiseret fra 20 ng samlet RNA under anvendelse af miRNA-specifikke primere ifølge TaqMan miRNA Assay protokol, anvendelse af 3,5 pi mastermix og 1,5 pi RT primer i en 7,5 pi slutvolumen. Real-time PCR blev udført ifølge TaqMan-protokollen, under anvendelse triplo 10 pi reaktioner for hver biologisk replikat herunder 1 pi af revers transkriptionsproduktet, 0,5 pi miRNA-specifik primer og probe-assay mix (assay ID’er: MIR-17: 002.308, miR-18a: 002.422, miR-19a: 000.395, miR-20a: 000.580, miR-19b: 000.396, miR-92a: 000.431), og 1 × TaqMan Universal PCR Master Mix Ingen AmpErase UNG (Applied Biosystems). Termisk cyklisering blev udført under anvendelse af en rotor-Gene Q (Qiagen, Valencia, CA, USA). Resultater blev normaliseret i forhold til det endogene lille nukleare RNA, RNU6B (assay ID: 001.093). Relative ekspressionsniveauer blev beregnet fra Ct-værdier under anvendelse Qgene [24].

I mRNA-ekspression analyse, RNA var DNase I-behandlet, og cDNA blev syntetiseret ud fra 1 ug samlet RNA under anvendelse af M-MLV revers transkriptase, RNase H minus (Promega, Madison, WI, USA) og tilfældige hexamere primere i en 25 pi reaktion. Real-time PCR blev udført i henhold til Power SYBR Green protokol (Applied Biosystems) med følgende primere til

cdc42

: 5’ACGACCGCTGAGTTATCCAC3 “(frem) og 5’GGCACCCACTTTTCTTTCACG3« (tilbage), og for

CCND1

: 5’GATCAAGTGTGACCCGGACTG3 “(frem) og 5’CCTTGGGGTCCATGTTCTGC3« (tilbage), ved hjælp af tre eksemplarer 20 pi reaktioner, herunder 2 pi revers transkription produkt, 300 nM frem og reverse primere, og 1 × Power SYBR Green Master mix (Applied Biosystems). Resultaterne blev normaliseret i forhold til endogen kontrol

ACTB

(beta-actin) niveauer, ved hjælp af følgende primere:. 5’TTGCCGACAGGATGCAGAAG3 “(frem) og 5’GCCGATCCACACGGAGTACT3 ‘(omvendt), og ekspressionsniveauer beregnet ved hjælp Qgene

Western blot-analyse

RIPA puffer blev anvendt til opnåelse helcelle proteinekstrakter, som blev kvantificeret under anvendelse af et EZQ protein Kvantificering kit (Invitrogen). Protein ekstrakter blev løst ved SDS-PAGE under anvendelse af præfabrikerede Mini-Protean TGX Stain-Free Gels (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og elektro-blottet på polyvinylidendifluorid membraner ved hjælp af Trans-Blot Turbo transfer-system og Mini PVDF Transfer Packs (Bio-Rad). Membraner blev blokeret med 5% bovint serumalbumin eller skummetmælkspulver i TBS-T før inkubation natten over med kanin monoklonalt anti-Cdc42 (11A11) (1:1000) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Kanin monoklonalt anti-GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase) (D16H11) (1:1000) (Cell Signalling Technology) blev anvendt som en loading kontrol. Sekundær peberrodsperoxidasekonjugeret gede anti-kanin IgG (Immunopure, Thermo Scientific, Rockford, IL) blev anvendt i forbindelse med forøget kemiluminescens (ECL) systemet (SuperSignal West Pico, Rockford, IL, USA) for at visualisere bånd vha ChemiDoc MP afbildningssystem (Bio-Rad). Densitometri resultater blev normaliseret til GAPDH niveauer.

Fast tid cellevækst analyse

Cell proliferation blev målt ved hjælp af xCELLigence RTCA DP instrument (ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA). Celler blev podet ved 20 000 celler pr brønd i en E-plade og dyrket med egnede behandlinger. Foruden transfektionerne behandlinger omfattede også anvendelse af et lille molekyle inhibitor af Cdc42 aktivitet, ML141 (Sigma-Aldrich) ved en dosis på 20 uM, eller en DMSO-vehikelkontrol [25], [26]. Væksten blev målt hvert 30. minut i løbet af 48-72 timer. Den xCELLigence systemet blev også anvendt til at måle migrering i 24 timer under anvendelse af CIM-pladen 16 med celler podet i serumfrit medium i den øverste kammer ved 30 000 per brønd, og 10% føtalt bovint serum anvendes som et tiltrækkende i nederste kammer. Den Incucyte Kinetic Imaging System (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) blev anvendt som en yderligere spredning foranstaltning. Celler blev podet ved 100 000 celler pr brønd i en plade med 24 brønde, og afbildes hver time i løbet af 48 timer, med 9 billeder pr brønd. De levende celle fasekontrast billeder blev anvendt til at beregne sammenløb ved hjælp af Incucyte software, og give morfologi oplysninger. Ud over den live-cell imaging blev celler også fikseret med formaldehyd ved 48 h, og cytoskelettet blev fluorescens farvet med Alexa Fluor 488 Phalloidin (Cell Signalling Technology) gennem bindingen af ​​phalloidin til F-actin, med celler afbildet under anvendelse af et Olympus BX63 fluorescens mikroskop med 20 × objektiv (Olympus, center Valley, PA, USA).

Caspase apoptose analyser

Apoptose blev målt til 24 timer ved hjælp af en Caspase-glo 3/7 assay ( Promega) ifølge producentens instruktioner, med det luminescerende signal proportionalt med caspase-3/7-aktivitet. Den Incucyte gav også en ekstra real-time foranstaltning; den CellPlayer Caspase 3/7 reagens (Essen BioScience) blev tilsat til cellerne i en endelig koncentration på 5 uM, og real-time fluorescerende billeder blev taget hver time i løbet af 24 timer. Disse billeder blev anvendt til at beregne fluorescerende celletælling under anvendelse af IncuCyte Object Counting v2.0 Analysis software. Apoptose blev monitoreret efter transfektion med miRNA efterligner, med eller uden yderligere behandling med det pro-apoptotiske middel natriumbutyrat (Sigma-Aldrich), ved 2,5 mM i 24 timer.

flowcytometri

Celler blev høstet med trypsin 48 timer efter transfektion, vasket med PBS og fikseret med 4% formaldehyd med 20 minutters inkubation på is. Celler blev vasket med PBS og derefter resuspenderet i 0,2% Triton X i 1% BSA i PBS-opløsning, og inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter. Celler blev vasket i 1% saponin vaskeopløsningen med PBS, dernæst resuspenderet i PBS /propidiumiodid /RNase A og inkuberet i 30 minutter, efterfulgt af FACS-analyse under anvendelse af en BD FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) med PI 680/40 filter.

miRNA target forudsigelse

Predicted blev opnået miR-18a målgener hjælp miRwalk, som samler data fra flere forudsigelse programmer (DIANAmT, Miranda, miRDB, miRWalk, PICTAR5 , PITA, RNA22, og Targetscan) [27]. Gener er fælles for tre eller flere forudsigelse programmer blev analyseret under anvendelse Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) for at identificere gener involveret i proliferation og cellecykluskontrol, og udtrykkes i colorektale celler.

plasmidkonstruktioner

cdc42

3’UTR (NM_001791.3) blev amplificeret ved anvendelse af følgende primere: 5’CTCTCCAGAGCCCTTTCTGC3 «(fremad) og 5’CAAAGAATTGAGACATGAGAAAGC3« (tilbage), ved hjælp af

PFU

DNA-polymerase (Promega) og oligo dT primet cDNA. 3’UTR blev klonet ind i pGEM-T Easy-vektoren (Promega) og derefter subklonet ind i psiCHECK-2-vektoren (Promega) under anvendelse af

Notl

restriktionssteder, og sekventeret. psiCHECK-2 indeholder Renilla luciferase som en primær reportergen, og ildflueluciferase som en intra-plasmid transfektion normalisering reporter.

cdc42

3’UTR blev klonet ind i det multiple kloning region placeret nedstrøms for Renilla translationsstopkodon, med binding af miRNA til 3’UTR forudsiges at resultere i spaltning og efterfølgende nedbrydning af mRNA fusion transkript. Nedsat Renilla luciferaseaktivitet blev anvendt som en indikator af miRNA aktivitet.

mutagenese

mutagenese blev udført ved anvendelse af QuikChange Lightning steddirigeret mutagenese Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ), i henhold til producentens anvisninger, for at slette miR-18a frø sekvens bindingssteder i

cdc42

3’UTR. Primere for første målområde af

cdc42

3’UTR (position 822-844 af NM_001791.3) var: 5’CACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGTGAAATGCACCAAATGAATTGAGTT3 ‘(fremad) og 5’AACTCAATTCATTTGGTGCATTTCACAATACTTTTCTTCATTTATCAGTG3 «(omvendt). Primere til det andet mål stedet for

cdc42

3’UTR (position 1295-1317 af NM_001791.3) var: 5’AAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCCCAAACCTAATTCTTGTAGATG3 “(frem) og 5’CATCTACAAGAATTAGGTTTGGGGGAAAGATTACCTCAACATTTTT3« (omvendt). Plasmider blev forberedt med kun det første sted muteret, kun den anden hjemmeside muteret, eller begge steder muteret.

Luciferaseassayreagens

Efter samtidig transfektion med psiCHECK-2 plasmidkonstruktioner og miRNA efterligner, luciferase aktivitet blev målt efter 24 timer, ved anvendelse af Dual-luciferase (Promega) ifølge producentens instruktioner. Renilla luciferaseaktivitet blev normaliseret til Firefly luciferase aktivitet for det samme plasmid.

Statistisk analyse

Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (SEM) af mindst tre biologiske replikater, med grafer fremstillet ved anvendelse af GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af t-test, med en P-værdi. 0,05 betragtet som signifikant

Resultater

miR-18a har lavere samlet udtryk i forhold til andre miR-17-92 klynge medlemmer i kolorektale celler

Humane væv bank prøver blev anvendt til at undersøge miR-18a niveauer i CRC og normal kolorektal slimhinde, i forhold til niveauet i andre miR-17-92 klynge miRNA. miR-17-92 klynge miRNA niveauer blev kvantificeret i begyndelsen (Dukes A) og avancerede (Dukes C) CRC prøver, og tilsvarende normale kolorektal slimhinde. miR-17-92 miRNA blev forhøjet i CRC prøver (Dukes A: miR-17 P = 0,01, miR-18a P = 0,01, miR-19a P = 0,005, miR-20a P = 0,002, miR-19b P = 0,009, miR-92a P = 0,07; Dukes C: miR-17 P = 0,0003, miR-18a P = 0,0005, miR-19a P = 0,0009, miR-20a P 0,0001, miR-19b P = 0,001, miR-92a P = 0,0007) sammenlignet med den matchede normalt væv, og havde højere ekspression i Dukes C prøver (figur 1A og 1B). miR-18a havde lavere samlet udtryk i forhold til andre miR-17-92 klynge medlemmer, både i Dukes A og C prøver, og i den matchede normale væv (figur 1A og 1B).

(A) miR -17-92 klynge miRNA niveauer i Dukes A og tilstødende normale vævsprøver (B) miR-17-92 klynge miRNA niveauer i Dukes C og tilstødende normale vævsprøver. Middelværdien ± SEM for 30 patienter er vist og ekspression normaliseres til RNU6B. * P. 0,05

miR-18a modulerer kolorektal cancer cellevækst og død

Transfektion af HCT116 CRC celler med miR-18a efterligner førte til reduceret spredning over en 48 timers periode sammenlignet med NC mimiske transficerede celler (P 0,0001) (figur 2A). Der blev observeret en lignende antiproliferativ virkning for MIR-18a i en yderligere CRC cellelinie LIM1215 (P = 0,0009) (figur 2B). Transfektion af HCT116 celler med et miR-18a LNA miRNA-inhibitor havde den modsatte effekt, med øget spredning over en 48 timers periode i forhold til NC inhibitor transfekterede celler (P = 0,03) (Figur 2C). HCT116-celler transficeret med MIR-18a efterligner vises en nedsat evne til at migrere over en 24 timers periode, sammenlignet med NC mimiske transficerede celler (P = 0,004) (figur 2D).

Cell indeks målinger under anvendelse af xCELLigence RTCA DP instrument. (A) spredning af NC og miR-18a efterligner transficeret HCT116 celler i løbet af 48 timer. (B) spredning af NC og miR-18a efterligner transficerede LIM1215 celler i løbet af 48 timer. (C) spredning af NC og miR-18a-hæmmer transficerede HCT116 celler i løbet af 48 timer. (D) Migration af NC og miR-18a efterligne transficeret HCT116 celler end 24 timer. Middelværdien ± SEM for 6 cellekultur replikater er vist for hver. * P. 0,05

Transfektion med miR-18a efterligner syntes også at ændre celle morfologi. Real-time billeder taget i løbet af 48 timer afslørede, at HCT116 celler transficeret med miR-18a efterligner var mere afrundet og mindre klæbende, med et reduceret niveau af sammenløb (P 0,001) (figur 3A og 3B). Tilsætning af miR-19a og b efterligner stort set vendt denne effekt. Celler transficeret med MIR-19a og b foruden MIR-18a var tættere i udseende til NC efterligne transficerede celler, med en mere udvidet morfologi, samt gennem tilsvarende Confluence niveauer i løbet af 48 timer (P = 0,20); Confluence niveauer signifikant forøget i disse celler sammenlignet med celler transficeret med MIR-18a efterligner alene (P 0,001) (figur 3A og 3B). Immunfluorescerende analyse af actin komponent cytoskelettet hjælp Alexa Fluor 488 Phalloidin understregede også den ændrede cellemorfologi i miR-18a efterligner transfekterede HCT116 celler, herunder en mere afrundet udseende med reduceret intercellulær adhæsion (figur 3C).

real-time celle billeder med Incucyte instrument. (A) Repræsentative billeder af NC, MIR-18a mimic, og MIR-18a, 19a og b efterligner transficerede celler ved 48 timer efter transfektion. (B) Confluence kvantificeret fra realtid billeder af NC, MIR-18a mimic, og MIR-18a, 19a og b efterligner transficerede celler ved 48 timer. Middelværdien ± SEM for 6 cellekultur replikater, er vist. * P 0,05. (C) Repræsentative billeder (20 ×) af Alexa Fluor 488 Phalloidin fluorescerende farvning af actincytoskelettet af NC og miR-18a efterligne transficerede celler ved 48 timer efter transfektion.

For at måle apoptose, en caspase 3/7 endpoint blev udført 24 timer efter transfektion af HCT116 celler. Transfektion med MIR-18a efterligner øget apoptose sammenlignet med NC efterligner transficerede celler (P = 0,04), hvorimod cotransfektion med MIR-19a og b efterligner reduceret apoptose sammenlignet med MIR-18a efterligner alene, til et niveau svarende til NC efterligner transficeret celler (P = 0,16) (figur 4A). Transfektion med MIR-19a og b efterligner alene havde ingen virkning på apoptose. Tilsætning af MIR-18a efterligner også forbedret virkningen af ​​et kendt pro-apoptotisk middel. HDAC-inhibitorer, såsom butyrat, er tidligere blevet vist at inducere apoptose i CRC-celler [28] – [30]. Celler transficeret med MIR-18a efterligner sammen med 2,5 mM butyrat behandling havde højere niveauer af apoptose ved 24 timer sammenlignet med NC mimiske transficerede celler også behandlet med butyrat (P = 0,001) (figur 4A). Igen, transfektion af miR-19a og b efterligner med miR-18a efterligner reducerede denne effekt, sammenlignet med de miR-18a efterligner alene (p = 0,03), selv om apoptose var stadig højere end med NC efterligner (P = 0,03) ( Figur 4A). Virkningen af ​​MIR-18a på apoptose blev yderligere undersøgt i realtid, under anvendelse af Incucyte system og en fluorescerende caspase 3/7 assay at opnå billeder af celler, der undergår apoptose. Når HCT116 cell billeder taget 24 timer efter butyrat behandling blev kvantificeret, var væsentligt flere fluorescerende celler med MIR-18a mimic transfektion sammenlignet med NC mimic transfektion i celler uden lægemiddelbehandling (P 0,001), og i celler behandlet med 2,5 mM butyrat (P 0,001) (figur 4B og 4D). En lignende virkning blev observeret i LIM 1215 celler, med forskelle i fluorescerende celletal mellem MIR-18a efterligning og NC mimic transfektion nå signifikans 48 timer efter butyrat behandling (P = 0,03 i celler uden lægemiddelbehandling, P = 0,02 i celler behandlet med 2,5 mM butyrat) (figur 4C).

(A) Caspase 3/7 luminescerende assay i NC, mIR-18a mimic, mIR-19a og b mimic, og mIR-18a, 19a og b mimic transficeret HCT116-celler 24 timer efter butyrat tilsætning. Middelværdien ± SEM af 3 cellekultur replikater, er vist. * P 0,05. (B og D) Kvantificering og repræsentative realtid fluorescerende celle billeder med Incucyte instrument viser apoptose i NC og MIR-18a mimiske transficerede HCT116-celler 24 timer efter butyrat tilsætning. Middelværdien ± SEM af 3 cellekultur replikater er vist i B. (C) Kvantificering af realtid fluorescerende celle billeder med Incucyte instrument viser apoptose i NC og MIR-18a mimiske transficerede LIM1215 celler ved 48 timer efter butyrat tilsætning. Middelværdien ± SEM af 3 cellekultur replikater, er vist. (E) Flowcytometrianalyse af NC, MIR-18a mimic, og MIR-18a, 19a og b efterligner transficerede HCT116-celler ved 48 timer efter transfektion; hver graf repræsenterer 3 cellekultur replikater.

Flowcytometri blev udført 48 timer efter transfektion af HCT116 celler, og viste også en ophobning af celler undergår celledød eller apoptose i Mir-18a mimic transficerede celler (Figur 4E). MIR-18a efterligner blev vist at inducere G1 /S-fase cellecyklusstandsnings. Tilsætning af MIR-19a og b efterligner resulterede i nedsat celledød og cellecyklusstop end med MIR-18a mimic alene (figur 4E).

Ekspression af cellecykluskontrol gen cdc42 er faldet med MIR-18a og steget med miR-19a og b

i betragtning af de resultater, der miR-18a reducerer proliferation og migration, aendrer cellemorfologi, øger apoptose, og inducerer cellecyklusstop, forudsagde miR-18a mål blev identificeret som er involveret i disse cellulære processer. Blandt MIR-18a forudsagte mål var celledelingscyklussen 42 (

cdc42

), som blev forudsagt af multiple mål forudsigelse programmer. Cdc42 er medlem af Rho-familien af ​​GTPaser, en underfamilie af Ras-superfamilien af ​​små GTPaser [31]. Ved aktivering, cdc42 er i stand til at binde en bred vifte af effektor proteiner og iværksætte mange nedstrøms signalveje, herunder dem, der er involveret i cytoskeletal remodeling, cellecyklusprogression, celleproliferation, overlevelse og migration [32] – [37]. Der findes flere transcript varianter af

cdc42

, som koder en kanonisk isoform til stede i de fleste væv (isoform 1), og en hjerne-specifik isoform (isoform 2). Det 3’UTR af udskrifter for den kanoniske isoform indeholder to forudsagt miR-18a bindingssteder, mens den alternative 3’UTR af udskrift for hjernen isoformen indeholder to forskellige forudsagt miR-18a bindingssteder. Med henblik på denne undersøgelse i kolorektale celler,

cdc42

isoform 1 blev undersøgt.

Transfektion af HCT116 CRC celler med miR-18a efterligner reducerede transkriptniveauer af

cdc42

sammenlignet med NC mimiske transficerede celler efter 48 timer, når der detekteres af real-time RT-PCR (P 0,0001) (figur 5A). Overraskende co-transfektion af miR-19a og b efterligner sammen med miR-18a efterligner produceret den modsatte virkning, med øget

cdc42

mRNA-niveauer, der var væsentligt højere end både NC mimiske celler (P = 0,0006) og miR-18a efterligne transficerede celler (P 0,0001) (Figur 5A). Transfektion med en MIR-18a-inhibitor forøgede transkriptniveauer af

cdc42

sammenlignet med NC mimiske transficerede celler efter 48 timer, når der detekteres af real-time RT-PCR (P 0,005). (Figur 5B)

(A)

cdc42

mRNA-niveauer i NC, miR-18a mimik, og miR-18a, 19a og b efterligner transfekterede celler ved 48 timer efter transfektion (B)

cdc42

mRNA-niveauer i NC og mIR-18a inhibitor transficerede celler ved 48 timer efter transfektion. Middelværdien ± SEM for 6 cellekultur replikater er vist for hver og ekspression er normaliseret til ACTB. * P 0,05. (C og D) Western blot af cdc42 proteinniveauer i NC, MIR-18a mimic, og MIR-18a, 19a og b efterligner transficerede celler ved 48 timer efter transfektion. Densitometri graf viser middelværdien ± SEM af 3 cellekultur replikater for hver og ekspression er normaliseret til GAPDH * P. 0,05

Western blot-analyse viste cdc42 proteinniveauer blev også signifikant reduceret i MIR-18a efterligne transficerede celler sammenlignet med NC efterligne transficerede celler, efter 48 h (P = 0,02) (figur 5C og 5D). Co-transfektion af MIR-19a og b efterligner med MIR-18a efterligner forøgede proteinniveauer sammenlignet med MIR-18a efterligner alene (p = 0,008), med niveauer tættere på NC efterligne transficerede celler (P 0,05) (figur 5C og 5D).

miR-18a direkte er rettet mod 3’UTR af cdc42

Et luciferaseanalyse system blev anvendt til at bestemme, at miR-18a direkte er rettet mod

cdc42

3 ‘UTR. Dual-luciferase reporter plasmider blev konstrueret med en intakt

cdc42

3’UTR, eller med

cdc42

3’UTRs muteret ved den første, anden eller begge forudsagt miR-18a bindingssteder (figur 6A). HCT116-celler blev transficeret med hvert plasmid, sammenholdt med MIR-18a eller NC efterligner, og Firefly og Renilla luciferaseaktivitet blev målt ved 24 timer. Et fald i normaliseret Renilla luciferaseaktivitet blev anvendt som indikator for MIR-18a binding og undertrykkelse.