PLoS ONE: Entydig Påvisning af Multiple TP53 genmutationer i AAN-associerede urothelial Kræft i Belgien Brug Laser Capture Microdissection

Abstrakt

I Balkan og Taiwan, forholdet mellem udsættelse for aristolochiasyre og risiko for urothelial neoplasmer blev udledt af A T genetiske kendetegn i

TP53

gen fra maligne celler. Denne undersøgelse havde til formål at karakterisere

TP53

mutational spektrum i urothelial kræftformer i træk til aristolochiasyre nefropati i Belgien. Serielle frosne tumorsnit fra kvindelige patienter (n = 5) udsat for aristolochiasyre under vægttab regime blev alternativt anvendes enten til p53 immunofarvning eller laser mikrodissektion. Vævsområder med mindst 60% p53-positive kerner blev udvalgt til microdissecting dele efter disses p53-positive matchende områder. Alle områder syntes at være carcinoma in situ. Efter DNA-ekstraktion blev mutationer i

TP53

hot spot region (exon 5-8) identificeret ved hjælp af nested-PCR og sekventering. Falske-negative kontroller bestod i microdissecting frisk frosset tumorvæv både fra en patient med en Li-Fraumeni syndrom, som bar en p53 forfatningsmæssig mutation, og fra

Kras

muterede adenokarcinomer. For at udelukke falske positive resultater potentielt genereret af mikrodissektion og nested-PCR, en phenacetin-associeret urothelial carcinom og normale friske Urinleder væv (n = 4) blev bearbejdet med høj lasereffekt. Ingen uventede resultater bliver identificeret, blev molekylær analyse forfølges på maligne væv, viser mindst en mutation i alle (seks forskellige mutationer i to) patienter, med 13/16 exon (nonsens, 2; missense, 11) og 3/16 intron ( én splejsningssted) mutationer. De blev fordelt som overgange (n = 7) eller transversioner (n = 9), med en lige forekomst af A T og G T (3/16 hver). Mens de nuværende resultater er på linje med A T udbredelse tidligere rapporteret i studier Balkan og Taiwan, de også vise, at flere mutationer i

TP53

hot spot-regionen og en høj frekvens af G T transversion vises som en supplerende signatur afspejler toksicitet af en kumulativ dosis af aristolochiasyre indtages i en kort periode

Henvisning:. Aydin S, Dekairelle aF, Ambroise J, Durant JF, Heusterspreute M, Guiot Y, et al. (2014) Entydig Påvisning af Multiple

TP53

genmutationer i AAN-Associated urothelial Kræft i Belgien Brug Laser Capture mikrodissektion. PLoS ONE 9 (9): e106301. doi: 10,1371 /journal.pone.0106301

Redaktør: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Juni 2, 2014, Accepteret: 29 juli 2014; Udgivet: 3 September, 2014

Copyright: © 2014 Aydin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer. Den etiske erklæring blev introduceret under det belgiske registreringsnummer B40320095694

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

aristolochiasyre nefropati (AAN) blev først rapporteret i begyndelsen af ​​1990’erne i belgiske patienter, der har foretaget et vægttab regime forurenet med aristolochiasyre (AA) [1], [2] . AAN er karakteriseret ved en hurtigt progredierende interstitiel nefropati med tubulær proteinuria og glukosuri, tidlig alvorlig anæmi, omfattende hypocellular interstitiel fibrose aftager fra den ydre til den indre kortikale labyrint, og en hurtig udvikling af urinveje transitional cell carcinomer i 40-46% af den patienter inden for 2-6 år efter ophør af eksponering [3] – [6]. AAN er nu anerkendt som en ødelæggende sygdom, der forekommer over hele verden med så mange som 100 millioner mennesker blive udsat for fare for AA eksponering [7]. Mens den mekanisme af AA nefrotoksicitet stadig at blive grundigt udforsket, er det kræftfremkaldende aktivitet i øjeblikket tilskrives genotoksicitet AL (aristolactam) -DNA addukter kendetegnet ved en høj frekvens af A T transversion i

TP53

tumorsuppressorgen AA-associerede tumorer. Dette er veldokumenteret i dyreforsøg [8], [9], og selvom ikke konsekvent, hos patienter med kliniske og histopatologiske ligheder med de originale belgiske AAN sager [10] – [14]. Betragtninger AL-DNA addukter demonstrerer AA eksponering er veldokumenteret i nyre væv fra den belgiske kohorte [6], [15], [16], tilstedeværelsen af ​​A T transversion vidne årsagssammenhængen mellem eksponering og malignitet havde endnu til at være undersøgt. Formålet med det foreliggende arbejde var derfor at karakterisere

TP53

mutational spektrum i frosne prøver af maligne urothelial væv fra belgiske AAN patienter ved hjælp grundigt validerede genotypebestemmelsesmetoder.

Patienter og metoder

Etik Statement

i 2001 blev en undersøgelse om genetisk polymorfi af enzymer involveret i metabolismen af ​​aristolochiasyre blandt belgiske AAN patienter godkendt af Prof JM Maloteaux, formand for det medicinske fakultet og Sundhedsvidenskab Research Ethics Udvalget af Université Catholique de Louvain (Belgien). Efter Etiske Komité godkendelse, blev skriftligt informeret samtykke fra hver patient fra den belgiske AAN serien. Disse undersøgelsesdata forblev utrykt.

I 2009 en ændring af pilotundersøgelsen defineret specielt den nuværende

TP53

forskning, som blev udført på vævsprøver fra 5 AAN patienter rapporteret i denne undersøgelse, og blev accepteret som sådan af Research Ethics Committee for Université Catholique de Louvain (Belgien) som en fortsættelse af undersøgelsen startede i 2001. Vævsprøver fra patienter 1-5, som alle var en del af den oprindelige undersøgelse (2001), blev anonymiseret før analyse.

Blodprøver var en del af en tidligere undersøgelse (godkendelse henvisning UCL etiske komité nr. 2003/05/03/08) [17]. Adenocarcinom og kirurgisk ureteric prøver blev indsamlet fra AA-relateret patienter som en del af deres medicinske behandling og blev anonymiseret før analyse. Efter skriftlige oplysninger blev adenocarcinom væv opbevaret i UCL Biologisk bibliotek (https://www.centreducancer.be/fr/show/index/section/8/page/34). Ikke AA-relaterede ureteric prøver taget fra nephroureterectomies fjernet på tidspunktet for nyretransplantation blev anvendt som kontroller i denne undersøgelse med en kodificering efter patologisk analyse i overensstemmelse med de belgiske love om væv banking (2008).

snap -Frozen granulosa-celle tumor eksemplar fra Li-Fraumeni patient blev opnået fra UCL biologiske bibliotek (samme som ovenfor). Efter skriftligt samtykke fra forældrene, blev denne prøve anonymiseret før brug.

Forrige rapporterede data omfatter AL-DNA addukter identificeret i nyrevæv fra patienter 1, 3, 4 [15], [16], [18 ] og

TP53

gen sekventering udført i en blære TCC fra patient 1 [10].

AAN patienter

Fem AAN patienter henvist til Cliniques Universitaires Saint-Luc (Bruxelles, Belgien) blev undersøgt (tabel 1). Alle var kvinder med en gennemsnitsalder på 42,8 år (interval: 27 til 53) ved præsentationen. En patient var en ryger. Ingen havde en historie med analgetisk misbrug eller typiske træk ved analgetisk nefropati. De har alle gennemgik bilateral nephroureterectomy enten på tidspunktet for nyretransplantation eller efterfølgende for øvre urinveje maligniteter. Desuden, én patient gennemgik også transurethrale resektioner af tilbagevendende overgangsperiode celle carcinom (TCC) af blæren og i sidste ende cystektomi. Diagnosen AAN var baseret på følgende kriterier: AA indtagelse gennem et vægttab regime phytochemically demonstreret som forurenede (patienter 1, 2, 3 og 5), en typisk renal histologi af interstitiel fibrose (alle fem patienter), identifikation af AL -DNA addukter i nyrevæv (patienter 1, 3 og 4) og udvikling af øvre urinveje malignitet (alle fem patienter) [15], [16], [18]. I patient 4, indtagelse af AA kunne dog aldrig formelt bevist, da hun hævdede at have deltaget i vægttab klinik før regime forurenet med AA (såkaldt “formel 2”) blev indført [1]. Ikke desto mindre er alle fem patienter opfylde de nyligt foreslåede kriterier for en bestemt diagnose af AAN [19] i den aktuelle sag serien. Omend mangler

TP53

mutation status, er det værd at bemærke, at patient 1 er n ° 3 i referencerne 4, 5, 15 og 16, patient 2 er nr 7 i henvisning 5, patient 3 er nr 4 i referencerne 15 og 16, n ° 5 i henvisning 5, og patient 4 er nr 2 i henvisning 20 og nummer nr 8 i henvisning 18 mens patient 5 er endnu ikke blevet rapporteret.

Kirurgisk prøver

Væv fra fem pelvi-ureterectomies og en enkelt cystektomi blev udvalgt på grundlag af tilgængeligheden af ​​frosne materiale. Carcinoma

in situ

(CIS) og papillær TCC blev diagnosticeret i overensstemmelse hermed til WHO klassifikationen 2004 urothelial tumorer [21], [22]. Ensidige multifokale CiS udviklet i højre øvre urinveje (bækken, øvre, mellem og nedre ureter) i to patienter (patient 1 og 5). Mens Urinleder CiS invaderet fokalt lamina propria i patient 1, udviklede hun også blære papillær TCC. Bilaterale multifokale CiS udviklet i de øvre urinveje af de 3 resterende patienter. Forsinkelse mellem slutningen af ​​eksponering og kirurgi gennemsnit 44,75 måneder (range 15-96) hos patienter 1, 2, 3, 5 og var utilgængelig i patient 4. I de tidligere fire patienter, ensidig og bilaterale TCC blev diagnosticeret i gennemsnit 61 måneder ( range: 27-96) og 41 måneder (spændvidde: 18-64) efter afslutningen af ​​kendt eksponering henholdsvis

p53 immunhistokemisk (IHC)

CiS blev identificeret ved lysmikroskopi på hæmatoxylin eosin. farvede sektioner fra frosne pelvi-ureteric prøver. Ud af serielle frosne sektioner (7 um tykt), profiljern n ° 1, n ° 3, og n ° 5 blev anvendt til p53 immunhistokemisk (IHC) og holdes natten over ved 37 ° C, hvorimod sektioner n ° 2, n ° 4 og n ° 6 blev anvendt til laser mikrodissektion. De sidstnævnte tre sektioner blev anbragt på biokemisk indifferente polyethylennaphtalat (PEN) membran dækket objektglas og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse. For p53 IHC, sektionerne holdt ved 37 ° C blev efterfølgende fikseret i formaldehyd 4% i 3 timer. Endogen peroxidase blev blokeret med 0,3% hydrogenperoxid i deioniseret vand i 30 min. Objektglassene blev inkuberet ved 97 ° C i 75 min og skyllet i en opløsning indeholdende deioniseret vand og triton 0,05%. Snittene blev derefter dækket i 30 minutter med 10% normalt gedeserum (NGS) indeholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), fortyndet i tris-triton. De blev inkuberet natten over ved stuetemperatur med anti-p53 monoklonalt museantistof DO-7 (Biocarta, Europe GmbH) ved en fortynding på 1:1000. Efter vask med Tris-triton 0,05% blev objektglassene inkuberet ved stuetemperatur i 75 min med en klar-til brug anti-muse EnVision-Peroxidase-system (Dako, Glostrup, Danmark) ifølge producentens protokol og modfarvet med hæmatoxylin. En normal gedeserum blev anvendt som negativ kontrol.

Overekspression af p53 blev defineret som nuklear farvning uanset IHC intensitet. Omfattende p53 farvning af IHC har tidligere været anbefalet at forbedre mutationen opdagelse på

TP53

[23]. I overensstemmelse hermed blev kun vævsområder indeholdende mere end 60% af positive kerner udvalgt til mikrodissektion. Præcis matcher områder fra endnu uforarbejdede serielle sektioner (n ° 2, n ° 4 og n ° 6) undergik mikrodissektion så detaljeret nedenfor.

capture Laser microdissection

Efter toluidinblåt farvning, hver ikke fastgjort frosne væv område, som netop matchede interesseområdet defineret i henhold til p53 IHC dias blev isoleret ved hjælp af et PALM microLaser-system (Bernried, Tyskland) udstyret med en pulserende UV kvælstof laser (bølgelængde: 337 nm; Pulse energi 270 μJ, puls varighed 3nsec , pulsfrekvens 1-30 /sek) og PALM Robot Software Version 2.2. Systemet blev koblet til en Axiovert 200 mikroskop og en plan Neofluar 20 × (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Mikrodissekterede foci blev slynget ind i et mikrorør hætte og nedfrosset ved -20 ° C indtil DNA-ekstraktion (figur 1).

A-G TCC område med mere end 60% p53 farvede kerner ved IHC modfarvet med hæmatoxylin fra frosne sektion af ureter (A). For laser capture mikrodissektion blev en toluidinblåt farvede område i et repræsentativt frossen sektion matchede (B), skåret (C) og slynget (D) i hatten på et mikrorør (E). 3′-5’dideoxy sekventering elektroferogram af segmentet af p53 viser vildtypesekvensen (F, pil) og A T transversion (G, pil), der fører til missense mutation E286V i exon 8.

DNA-ekstraktion

I hver hætte, 10 pi af en opløsning indeholdende EDTA 0,001 M (pH 8), Tris-HCI 0,02 M (pH 8), 0,5% Tween 20, proteinase K (2 mg /ml) og ultrarent vand var inkluderet. Efter blanding og centrifugering blev hvert reaktionsrør overlagt med en dråbe mineralolie for at forhindre fordampning og inkuberes natten over ved 55 ° C med kontinuerlig omrøring (600 rpm). Ultrarent vand (5 pi) blev derefter tilsat til reaktionsrøret at øge det endelige rumfang af opløsningen. Efter centrifugering blev opløsningen opvarmet til 99 ° C i 10 minutter for at inaktivere proteinase K. Endelig ekstrakten blev overført til en anden mikrorør.

Nested-PCR

Exon 5 til 8, svarer til p53 DNA-bindende domæne, et såkaldt “hot spot” for

TP53

genmutationer [24], blev amplificeret ved nested-PCR. For første PCR runde, blev 3 pi af DNA ekstraheret fra hver mikrodissekeret prøve tilsat til en endelig 50 pi PCR-blanding, herunder 2,25 mM MgCl

2, 0,2 U /pl Taq Gold polymerase (Ampli Taq Gold, Applied Biosystems, Roche) , 0,2 mM dNTP og 12:02 /gl primere (Eurogentec, Liège, Belgien) (tabel 2). En indledende inkubering ved 95 ° C i 4 min blev efterfulgt af 25 cykler (95 ° C i 30 sek, 60 ° C bortset fra exon 7, hvor annealing temperatur var 55 ° C i 30 sek og 72 ° C i 1 min) og en endelig forlængelse i 7 minutter ved 72 ° C. Den anden PCR runde blev udført med 2,5 pi af den første PCR-produkt under anvendelse af de samme betingelser som for den første runde, bortset fra at 1,5 mM MgCl

2 og 0,4 U /pi Taq Gold polymerase blev anvendt til exon 6. ultrarent vand blev anvendt som negativ kontrol henviser DNA ekstraheret fra ubeslægtede blodprøver blev anvendt som kontrol til

TP53

amplifikation.

Sekvensanalyse

Amplificerede produkter blev oprenset ved anvendelse MSB Spin PCRapace kit (STRATEC Molecular GmbH, Berlin, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Sekvensanalyse blev udført på et automatiseret ABI 377 A apparat (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved anvendelse af Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit fra samme fabrikant og efter dennes instrukser.

TP53

henvisning sekvens fra Genbank var NC_000017.10.

Vurdering af potentiale

TP53

-artifactual ændringer i vævsprøver

(a) at vurdere evne til nuværende microdissection procedure til at identificere DNA-mutationer, fire kolorektale adenocarcinomer tidligere undersøgt for

KRAS Salg mutation ved rutinemæssig klinisk prøvning FFPE (formalin-fikserede paraffin-embedded) vævsprøver blev udvalgt. To af dem bar en mutation og to var vildtype. Disse fire prøver blev valgt, fordi en snap-frossen modstykke blev holdt opbevaret ved -70 ° C i Cancer Menneskelig Bio-bank af Université Catholique de Louvain (https://www.uclouvain.be/416846.html). Laser mikrodissektion og DNA-ekstraktion af snap-frosne adenocarcinom prøver blev udført ved anvendelse af den ovenfor beskrevne procedure og resultaterne af

KRAS Salg afprøvning blev sammenlignet. Desuden blev en snap frosne granulosa-celle tumor eksemplar fra en 15-årig ung pige med en Li-Fraumeni syndrom analyseres ved hjælp af samme mikrodissektion procedure. Mens den forfatningsmæssige mutation allerede var blevet identificeret af FASAY (funktionel analyse af separerede alleler i gær) i

TP53

mRNA udvundet fra perifere mononukleære celler fra patienten [25], tumor prøve blev undersøgt for at yderligere at bekræfte evne til aktuelle mikrodissektion procedure til at identificere korrekt dette

TP53

mutation i frosne snit af tumoren.

(b) Hvorvidt snap-frosne vævssnit kunne blive påvirket af en laser-induceret effekt er ikke kendt, og dette endog blive forværret af yderligere forstyrrende faktorer såsom en skadelig virkning af fiksering, farvning og /eller indlejrede-PCR-procedurer. For at udelukke en sådan teknologisk bias, blev kirurgisk ureter prøver opsamlet efter nephroureterectomies (n = 4) taget fra nyre transplanterede patienter til terminal uræmi skyldes polycystisk nyresygdom (n = 2), kronisk idiopatisk interstitiel nefritis absolut relateret til AA indtagelse (n = 1 ) og diabetisk glomerulosklerose (n = 1). Disse prøver blev straks indlejret i Tissue-Tek og snap-frosset, og urothelial områder blev behandlet samtidigt på tre forskellige måder. Mikrodissektion blev udført under to forskellige intensiteter (lav betyde UV-energi: 68, og høj gennemsnitlig UV-energi: 69,4) og efterfølgende behandlet som rapporteret her for AAN-patient prøver. Til sammenligning yderligere serielle sektioner fra den samme ureter prøve undergik en simpel slide skrabe som udføres i

Kras

rutinemæssige mutation test på FFPE vævsprøver. DNA ekstraktion, amplifikation og

TP53

sekventering blev udført i overensstemmelse med den i denne artikel metode.

(c) Som ekstra kontrol af AA-relateret

TP53

artefakt ændringer potentielt fremkaldt af den aktuelle analyse, en phenacetin-induceret urothelial karcinom, som efter sigende karakteriseret ved fravær af a T transversioner i

TP53

gen [26] blev fjernet fra den nedre urinleder af en 64 år gammel kvinde, indlejret i Tissue-Tek, snap-frosne i flydende nitrogen-afkølet 2-methylbutan (isopentan) og opbevaret ved -70 ° C. IHC, mikrodissektion, DNA-ekstraktion og

TP53

sekventering blev udført i overensstemmelse med de metoder, der er beskrevet ovenfor.

Vurdering af detektionsgrænse for Sanger sekventering

For detektionsgrænsen undersøgelse , DNA blev ekstraheret fra to hoved og hals pladecellekræft cellelinier (SC173 og SC263, venligt leveres af AC Begg, Holland Cancer Institute, Holland) bærer forskellige

TP53

mutationer og fra en vildtype

TP53

HNSCC cellelinje (HN30, venligst stillet til rådighed af M. Flinterman, afdeling for Oral Medicin og Patologi, Kings College London, The Rain Institute, UK). Karakterisering af

TP53

status er tidligere udført i vores laboratorium ved hjælp FASAY analyse [25]. SC173 bærer en missense mutation i exon 5: R175H (CGC CAC). SC263 præsenterer en forbindelse heterozygot ændring involverer en nonsense mutation R306X i exon 8 (CGA TGA) og en 32-bp sletning i exon 7 (del 704-735) (CTMA laboratorium data). DNA fra både

TP53

muterede celler blev serielt fortyndet og tilsat i vildtype-DNA at have 50 til 1,25% mutant med vildtype-DNA-forhold. Forstærkning og sekventering analyse blev udført som beskrevet ovenfor.

Sammenlignende statistisk analyse af antallet og typen af ​​mutationer i nuværende og tidligere data

En Poisson regression model blev bygget til at sammenligne forekomsten og typen ( A T og G T) af

TP53

mutationer i p53 bindingssted mellem strøm (n = 5) og tidligere [BEN (n = 11 og n = 97) og taiwanske (n = 151)] klinisk serie [11], [12], [14], og at sammenligne resultaterne af denne analyse med dem fra patienter med urothelial maligniteter (blære, ureter, øvre urinveje og nyrebækken) (n = 1111) som rapporteret i

TP53

IARC database [27]. Det er værd at bemærke, at data i forbindelse med AA eksponering blev kasseret fra

TP53

IARC database resultater.

Resultater

Vurdering af potentiel kunstig

TP53

ændringer i vævsprøver

Brug af mikrodissektion procedure muliggjorde en korrekt identifikation af kendte DNA-mutationer karakteriseret ved tidligere rutinemæssige test. Med hensyn til identifikation af

Kras

mutationer på snap-frosne adenokarcinomer, var resultaterne strengt identiske med dem, der tidligere er opnået på FFPE prøver (dvs. identifikation af G12S og G12D mutationer i

Kras

muterede væv og vildtype status i de to andre tumorer). Vedrørende identifikation af en forfatningsmæssig g.13380 G A, p.R248Q mutation identificeret ved FASAY assay i perifere blodceller af en patient med Li-Fraumeni syndrom, denne mutation blev også fundet i maligne celler fra Granulosa celle tumor ved hjælp af dna-ekstraktion, mikrodissektions, nested-PCR og sekventering procedurer, som anvendes i nærværende undersøgelse.

Omvendt ingen kunstig

TP53

ændringer blev fundet i de forskellige kontroller, der gennemføres for at teste forekomsten af ​​

TP53

DNA-induceret skade relateret til DNA-ekstraktion, mikrodissektion, nested-PCR og sekventering procedurer. Ingen mutationer blev fundet i tre ud af fire ureter prøver anvendt til at teste en

TP53

iatrogen skade. Den eneste undtagelse var ureter prøve fra en type 2 diabetespatient med en G En overgang (g.12455, p.R156H) i exon 5 i

TP53

gen efter mikrodissektion under højt laser magt. Ingen mutationer blev fundet i p53 DNA-bindende domæne (exon 5 til 8), når man analyserer DNA ekstraheret fra en phenacetin-induceret urothelial karcinom.

Vurdering af detektionsgrænse for Sanger sekventering

Grænsen af detektion for Sanger sekventering blev identificeret på 6,25% af mutant til vildtype DNA-forhold med både

TP53

muteret cellelinjer, uanset mutation eller sletning vurderet. På dette DNA-forhold, den heterozygote A /G top med serielle DNA fortyndinger fra SC173 /HN30 blandede DNA’er var stadig synlig som også var heterozygot T og C peak kombineret med en 32-bp deletion i exon 7 med serielle DNA fortyndinger fra SC263 /HN30 blandede DNA.

Morfologi

Alle p53 positive områder svarede til papillær TCC eller under kreditinstitutter indeholder anaplastisk og dysplastiske celler (tabel 1). Intra-urotelial og lamina propria inflammation, hyperplasi og reaktiv atypia var fraværende. I patient 2 blev neoplastiske og dysplastiske celler klamrer sig til basalmembranen (klamrer CIS).

TP53 genmutationer

Herunder to tidligere rapporterede resultater [10], i alt 16 helt anden exon (n = 13) eller intron (n = 3) mutationer af

TP53

genet blev fundet i maligne urothelial væv fra den belgiske AAN kohorten (tabel 1). I patient 1 blev fundet to mutationer i samme exon (exon 7) en enkelt mutation blev fundet i patient 2 (exon 5) og 3 (intron 7). Patienter 4 og 5 nærede 5 forskellige exon og 1 intron mutationer. Blandt de 13 exoniske mutationer, to var nonsens (patienter 2 og 5) og 11 missense mutationer (patient 1, 4 og 5). De var placeret i exon 5 (3 mutationer), exon 6 (3 mutationer), exon 7 (3 mutationer) eller exon 8 (4 mutationer). En af de tre introniske mutationer (g.12627 A T, patient 5) var placeret på AG acceptor splejsning site. Globalt mutationer berørte A:T par (7/16) og G:C par (9/16). Der var et næsten lige stort antal overgange (7/16) og transversioner (9/16). Overgange (7/16) forekom faktisk med en tilsvarende frekvens på A:T par (3/16) og G:C par (4/16). A G, G A og C T (2/16) forekom med en lignende frekvens som T C (1/16). Tilsvarende blev transversioner (9/16) findes på A:T par (4/16) og G:C par (5/16) fordelt som følger: A T (3/16), G T (3/16 ), G C (2/16) og A C (1/16)

Sammenlignende statistisk analyse af antallet og typen af ​​mutationer i nuværende og tidligere data

Poisson regressionsmodel. viste en stærkt signifikant (p 0,001) relativ stigning i

TP53

mutation prævalens i p53 hotspot codoner fra den aktuelle kliniske serie sammenlignet med IARC database resultater (tabel 3). I modsætning hertil blev en signifikant relativ nedgang fundet både i BEN (n = 97) [12] og de taiwanske (n = 151) [14] klinisk serie sammenlignet med IARC og aktuelle kliniske data (tabel 3). En ikke-signifikant (p 0,05) relativt fald /stigning blev fundet i BEN (n = 11) [11] sammenlignet med IARC og aktuelle kliniske data (tabel 3)

Med hensyn til antallet af. a T transversion per patient, en betydelig relativ stigning blev fundet i den aktuelle, både BEN [11], [12], og de taiwanske [14] klinisk serie, sammenlignet med IARC database resultater (tabel 4). Ikke-signifikant (p 0,05). Resultater blev opnået, når tidligere AAN og nuværende klinisk serie blev sammenlignet (tabel 4)

Sammenlignet med IARC database resultater, en signifikant 5,85 stigning i G T prævalens blev fundet i den aktuelle kliniske serie (tabel 5). Ingen G T transversion blev fundet i begge BEN serien. Med hensyn til den taiwanske serie, der var en ikke-signifikant relative fald i G . T prævalens sammenlignet med IARC data sådan nedgang var stærkt signifikant sammenlignet med de nuværende resultater (tabel 5)

Diskussion

Dette er den første rapport fra mutations spektrum af

TP53

tumorsuppressorgen i en række belgiske patienter (n = 5) med dokumenteret AAN og efterfølgende udvikling af TCC i de øvre urinveje sammen med blære involvering i en af ​​dem. Fire af dem havde fulgt AA-forurenet vægttab kost og en nægtet udsættelse for AA, mens præsentere et typisk renal histologi af interstitiel fibrose [20] med AL-DNA addukter [18].

udelukkende Brug frosne prøver blev en absolut forudsætning for at tillade tilstrækkelig sammenligning med indberettede data. Bortset fra fem ud af 11 patienter, for hvem formalin-fikseret paraffin indlejrede væv blev anvendt [11], alle større

TP53

genetiske undersøgelser i sager præsenterer med AA-induceret genotoksicitet og urothelial maligniteter blev faktisk ført ved hjælp af friske frosne væv [11], [12], [14]. Omvendt var målet at undgå den velkendte skadelige virkning af formalin fiksering med hensyn til DNA-kvalitet og karakterisering af væv mutationsstatus [28]. For at bevise, at

TP53

mutationer skyldtes ikke de teknologiske artefakter, når du bruger frosne sektion, blev en særlig vægt på grundige valideringsprocedurer. Den nuværende

TP53

afprøvning omfatter flere efterfølgende trin (dvs. laser capture microdissection af tumorceller efter Toluidinblåtfarvning, DNA-ekstraktion, nested-PCR-amplifikation og sekventering). Denne metode gav ikke falsk-negative resultater. Det gav faktisk en korrekt identifikation af kendte

Kras

onkogene mutationer i adenokarcinomer. Det gav også en korrekt identifikation af en tidligere karakteriseret

TP53

forfatningsmæssige mutation forbundet med en Li-Fraumeni syndrom. Denne mutation blev fundet i tumorceller mens den tidligere karakterisering blev udført af en funktionel analyse på perifere mononukleære celler.

Ligeledes den nuværende procedure ikke skaber falsk-positive resultater, når man analyserer normale ureter prøver indsamlet efter nephroureterectomy i patienter med AA-relateret sygdomme eller en phenacetin-induceret karcinom, og under nuværende konventionelle genotype som guld standard. Dette gjaldt også ved udførelse laser capture microdissection med høj intensitet. Den eneste mutation fandt var en enkelt G En overgang (g.12455, p.R156H) i vævsprøven fra en type 2 diabetespatient uden nogen historie neoplasi. Af interesse, er der ingen signifikant forskel i forekomsten af ​​G En overgang mellem befolkningen og type 2 diabetes patienter [29]. Som vurderet af serielle fortyndinger af

TP53

muteret DNA, detektionsgrænse den nuværende genotype procedure var 6,25% af mutant til vildtype-forholdet.

Af interesse, alle patienter fra den nuværende serie var kvinder, og hver af dem præsenteres mindst en

TP53

mutation i deres maligne urothelial væv mens en mere afbalanceret mand /kvinde-forholdet blev fundet (53% /47%) i tidligere undersøgelser [11], [14] . I tidligere undersøgelser, den rapporterede forekomst af patienter med

TP53

hotspot mutation varierede fra 100% (11/11 BEN patienter) [11] til 37% (36/97 BEN tumorer) [12] eller 47% ( 71/151) taiwanske AA-patienter [14]. I betragtning af at kun en enkelt patient blev rapporteret med en femdobbelt mutation i IARC databasen, det aktuelle observation, at 40% (2/5) af patienterne nærede multiple

TP53

mutationer, hver med seks særskilte mutationer (fem exon og en intron mutationer, hvoraf én splejsningsstedmutation i patient 5) var en slående og meget usædvanligt fund. Det er også interessant at bemærke, at denne femdobbelt mutation også blev fundet i BEN serien [12], som er en af ​​de hidtil største rapporterede menneskelige serie af AA relaterede

TP53

mutationer. Sammenlignet med data fra ikke AA-relaterede urothelial kræftformer i IARC-databasen (n = 1111), og fra den taiwanske serie (n = 151), viste den nuværende serie den højeste relative øgede forekomst af mutation og G T transversion i

TP53

hotspot region. Uanset den nuværende eller tidligere AA-serie, forekomsten af ​​A T transversion var signifikant og konsekvent højere end i IARC-databasen [27]. Vores fund bekræfter, at antallet og profilen af ​​

TP53

mutationer per patient er meget usædvanligt, hvilket sandsynligvis skyldes en pludselig meget giftigt eksponering. Hvorvidt disse multiple mutationer fremkom på forskellige maligne kloner ikke blev vurderet. Men antallet af forskellige tumor områder i forbindelse med dette komplekse mutations spektrum sikkert afspejler bredt inden-tumor heterogenitet med poly- eller multiclonal maligne urothelial celler.

Ser i detaljer med den type hotspot mutation i denne undersøgelse, punkt mutationer ved A:T par var så hyppigt som dem, G:C par (7/16 versus 9/16, henholdsvis). De var domineret af transversioner med A T og G T tegner hver for 18,7% (3/16) af alle

TP53

mutationer. Interessant, A T transversion i human AA-relaterede urotelial tumor blev først rapporteret i en britisk patient [30], men A T transversion blev derefter ofte fundet i p53 hotspot regionen fra urothelial karcinom forbundet med Balkan endemiske nefropati (BEN) [ ,,,0],11], [12], samt i Taiwan [14]. I alle disse undersøgelser blev befolkningen udsat for AA i mange år, med tal så højt som 66% (33/50) til 72% (13/18) og 55% (46/84) af alle

TP53

mutationer hhv. I den nuværende serie, en tumor med flere

TP53

mutationer husede to A T transversioner, en funktion også almindeligt rapporteret i BEN og taiwanske serie [11], [12], [14].