PLoS ONE: NF-KB inducerende kinase, en Central Signaling Del af den ikke-kanoniske Pathway af NF-KB, Bidrager til Kræft i æggestokkene Progression

Abstrakt

Kræft i æggestokkene er en af ​​de førende årsager til kvindelig død og udvikling af nye terapeutiske metoder er tvingende nødvendig. Nuklear faktor-KB (NF-KB) konstitutivt aktiveret i flere typer cancer, herunder ovariecancer og er kendt for at støtte overlevelsen af ​​cancerceller. Imidlertid molekylære mekanismer for vedvarende aktivering af NF-KB i ovariecancer forbliver stort set ukendt. Vi rapporterer her, at NF-KB i tillæg til den tidligere rapporterede kanoniske aktivering, er aktiveret via den noncanonical vej hos ovariecancerceller. RNA-interferens-medieret inaktivering af NF-KB inducerende kinase (NIK), et centralt regulator af den noncanonical pathway, reducerede NF-κB2 /p52 DNA-bindingsaktivitet og NF-KB-afhængigt reportergen-ekspression samt NF-KB målgen udtryk. Især blev forankring-afhængige og -uafhængige cellevækst svækket i NIK-udtømte celler. Udtømning af NIK undertrykte også tumordannelse i nøgne mus xenograft assay. Disse resultater indikerer, at NIK spiller en central rolle i konstitutiv NF-KB-aktivering og progression af ovariecancerceller og foreslå, at NIK repræsenterer et attraktivt terapeutisk mål for ovariecancer

Henvisning:. Uno M, Saitoh Y, Mochida K, Tsuruyama E, Kiyono T, Imoto I, et al. (2014) NF-KB inducerende kinase, en Central Signaling Del af den ikke-kanoniske Pathway af NF-KB, Bidrager til Kræft i æggestokkene Progression. PLoS ONE 9 (2): e88347. doi: 10,1371 /journal.pone.0088347

Redaktør: Javier S. Castresana, Navarra Universitet, Spanien

Modtaget: August 30, 2013; Accepteret: 12 Januar 2014; Udgivet: 12 februar 2014

Copyright: © 2014 Uno et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af et tilskud-in-støtte til videnskabelig forskning om innovative områder fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan til S.Yamaoka (22.117.004). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epitelovariecancer er en af ​​de mest dødelige gynækologiske maligniteter og dens overlevelse er meget lavere end andre kræftformer, der påvirker kvinder. Da den kræft i æggestokkene oprindeligt udviser subtile og uspecifikke symptomer, de fleste af de patienter til stede med fremskreden sygdom, så aggressiv kirurgisk behandling i kombination med kemoterapi er stadig standarden for pleje. Selvom fremskridt inden kemoterapi forbedret overlevelse æggestokkene kræftpatienter, de ofte ikke reagerer på indledende kemoterapi eller tilbagefald efter at opnå en gunstig reaktion [1]. Derfor er nye terapeutiske metoder påkrævede for at opnå bedre behandlingsresultater.

NF-KB er en transkriptionsfaktor involveret i forskellige biologiske processer, såsom immunrespons, inflammation, cancer og celledød [2]. I pattedyrceller, er NF-KB bestående af homo- og heterodimerer af fem medlemmer, NF-κB1 (P50 og dens forløber p105), NF-κB2 (P52 og dens forløber P100), RelA (p65), RelB og c-Rel . I hvilende celler er aktiviteten af ​​NF-KB stramt reguleret af dens interaktion med inhibitoriske IKB-proteiner. Precursorproteinet p105 undergår konstitutiv forarbejdning af det cellulære proteasomet, som eliminerer IKB-lignende C-terminale område at generere p50. I modsætning hertil p52 produktion kræver IKB kinase (IKK) -induceret phosphorylering og proteasom-medieret forarbejdning af p100. NF-KB-signalering medieres af to veje kaldes de kanoniske og noncanonical veje. Aktivering af den kanoniske pathway hovedsageligt udløst af cytokin stimuli, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF) og interleukin-1β, efterfulgt af aktivering af IKK-komplekset, som består af to proteinkinaser IKKα og IKKβ og et regulatorisk protein NF-KB afgørende modulator (NEMO også navngivet IKKγ). Aktiveret IKK-induceret phosphorylering af kBa medfører, at bestemmelsen polyubiquitination og proteasomalaktivitet nedbrydning efterfulgt af translokation af p50-RelA heterodimer til kernen og induktion af målgenekspression. Den noncanonical NF-KB-vejen aktiveres via bestemte TNF receptor familiemedlemmer, såsom B-celle-aktiverende faktor (BAFF) receptor, CD40 og lymfotoksin-beta-receptor, der binder til TNF-receptor-associeret faktor (TRAF) 2 eller TRAF3. Noncanonical NF-KB-aktivering er blevet rapporteret til at stole på forhøjet udtryk for NF-KB-inducerende kinase (NIK), hvilket opnås på to måder, enten ved nedskrivning af K48 polyubiquitination af NIK eller ved forøget mRNA-ekspression. I ustimulerede celler, TRAF3 links NIK til et multi-subunit E3 ubiquitin ligase kompleks sammensat af TRAF2 og cellulær inhibitor af apoptose 1 og 2 (cIAP1 og cIAP2), hvilket fører til K48 polyubiquitination og proteasomalaktivitet nedbrydning af NIK opretholder således NIK ekspression på et lavt niveau. Som respons på stimulering med cytokiner, såsom BAFF eller CD40-ligand, er TRAF3 rekrutteret til receptoren og undergår ubiquitinering-medieret proteasomalaktivitet nedbrydning. Dette resulterer i stabilisering og akkumulering af nyligt syntetiserede NIK, mens disse stimuli ikke øger den

NIK

mRNA-niveau [3], [4]. I hæmatopoietiske kræftceller såsom myelomatose og voksen T-celle leukæmi samt lunge kræftceller, enten stabilisering af NIK protein gennem forringet negativ regulering af TRAF3 /TRAF2 /CIAP kompleks eller afvigende ekspression af

NIK

mRNA er blevet rapporteret [5], [6], [7], [8]. Under alle omstændigheder, akkumulering af NIK resulterer i aktivering af IKK-komplekset, som igen phosphorylerer p100 fører til forarbejdning til p52 og nuklear translokation af p52 /RelB heterodimer. I modsætning til aktiveringen af ​​den kanoniske pathway, går noncanonical NF-KB-aktivering ikke kræve associering NEMO med IKK-komplekset og er relativt persistent [9].

Tidligere rapporter viste konstitutiv aktivering af NF-KB og dens bidrag til manifestation af malign fænotype i flere typer af kræft. NF-KB-aktivering resulterer i forhøjet ekspression af gener relateret til cellecyklusprogression, overlevelse og invasion af cancerceller. For eksempel overekspression af cyclin D1, en vigtig regulator af cellecyklussen, fremmer cancercelleproliferation, mens dereguleret ekspression af B-celle-lymfom-xl beskytter cancerceller fra apoptose. Desuden matrix metallopeptidase 9 (MMP-9) og vaskulær endotelvækstfaktor fremmer tumorinvasion og angiogenese [10]. Som for ovariecancer, inhibering af IKKβ aktivitet, enten ved et lille molekyle kinase inhibitor eller af RNAi-medieret gen-nedregulering, blev rapporteret at undertrykke proliferation og invasion af æggestokkene cancercellelinier [11]. Blokade af NF-KB-signalering ved ekspression af en dominerende negativ form for kBa ændret tumorigenese af æggestokkene kræft cellelinjer [12]. Desuden blev akkumulering af nuklear RelA i ovarietumorer rapporteret at associere med dårlig prognose [13]. Ikke desto mindre har mekanismerne bag den vedvarende NF-KB-aktivering i ovariecancerceller forblev stort set ukendt. Rattan et al. viste, at ekspressionen af ​​transkription elongeringsfaktor A-like 7, en suppressor af RelA-afhængig gentranskription, er ofte nedreguleres i ovariecancerceller [14]. Vi har for nylig rapporteret forhøjede udtryk for NIK og dets rolle i onkogene egenskaber af voksen T-celle leukæmi og lungekræft celler, hvor

NIK

mRNA blev udtrykkes afvigende [7], [8]. I den foreliggende undersøgelse, vi demonstrerer vigtige roller for NIK i spredning

in vitro

tumorgenicitet af æggestokkene cancerceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Eksperimenter med primære kræft i æggestokkene prøver blev godkendt af den etiske komité i Tokyo Medicinsk og Dental University og skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle patienter. Alle eksperimenter dyr blev udført med godkendelse af Animal studienævnet i Tokyo Medicinsk og Dental University (Permit nr 0120286A), og var i overensstemmelse med alle relevante retningslinjer og love.

Cell kultur og delprøver

Fire humane ovarie cancer cellelinjer, RMG-i, RMUG-S, RMUG-L og MUB blev opnået fra den japanske Indsamling af Research Bioressourcer Cell Bank (Tokyo, Japan) og 2 æggestokkene kræft cellelinjer, OMC-3 og JHOC- 5, var fra Riken Cell Bank of Japan (Tsukuba, Japan) [15]. RMG-I, RMUG-S, RMUG-L og OMC-3 blev dyrket i Hams F-12-medium suppleret med 10% FBS. JHOC-5 blev dyrket i 01:01 blanding af Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) og Hams F12 indeholdende 0,1 mM ikke-essentielle aminosyrer suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). MCAS blev dyrket i Eagles minimale essentielle medium indeholdende 20% FBS. Alle de andre ovarian cancer cellelinjer blev beskrevet andetsteds [16], [17], [18]. Humane embryonale nyre-cellelinier, HEK293 og HEK293T blev dyrket i DMEM indeholdende 10% FBS. HOSE1C er en immortaliseret human ovarie overflade epitelcellelinie etableret fra primære humane ovarie overfladeepitelet (slange) celler efter infektion med retrovirus, som udtrykker mutant Cdk4, cyclinD1 og human telomerase-revers transkriptase [19]. HOSE1C celler blev dyrket i 01:01 blanding af DMEM og Hams F12 suppleret med 10% FBS. Alle anvendte medier blev suppleret med 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycinsulfat. Primære ovariecancer prøver blev opnået fra 12 patienter i en tilknyttet hospital i Tokyo Medicinsk og Dental University. Den mediane alder af patienterne var 56,5 år, der spænder fra 27 til 80 år. Af de 12 ovariecancer, 5 var histologisk serøs karcinom, 4 var klare celle karcinom, 2 var endometrioide karcinom og 1 var yalk sac tumor.

Udarbejdelse af celleekstrakter

Til tilberedning af engros- celleekstrakter blev celler høstet og lyseret i RIPA-buffer [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethan-HCl (pH 7,5), 137 mM NaCl, 1% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS] . Til udsugning af cytoplasmatiske og nukleare proteiner blev celler først lyseret i hypotonisk puffer [20 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) (pH 7,8), 0,15 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,15 mM ethyleneglycoltetracetic syre , 10 mM KCI] og inkuberet på is i 10 minutter. NP-40 blev tilsat til en slutkoncentration på 1%, og cellesuspensionerne blev centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 minutter. Supernatanterne blev anvendt som cytoplasmatiske ekstrakter. Pelleterne blev vasket tre gange med isotonisk puffer [20 mM HEPES (pH 7,8), 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA og 25% glycerol] og resuspenderes i nuklear ekstraktionspuffer [20 mM HEPES (pH 7,8), 400 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 25% glycerol og 1 mM dithiothreitol (DTT)]. Efter 30 minutters inkubering ved 4 ° C med konstant omrøring blev suspensionen centrifugeret ved 14.000 rpm i 2 minutter. Supernatanterne blev udvundet og anvendt som kerneekstrakter. Ripa, hypotoniske og nukleare udvinding buffere blev suppleret med 1 pg /ml aprotinin, 1 pg /ml leupeptin, 0,57 mM phenylmethanesulfonylfluoride, 100 uM natriumvanadat, og 20 mM β-glycerophosphat. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved Bradford-assay.

Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

Fem ug af nukleare ekstrakter blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur i bindingsbuffer [10 mM HEPES ( pH 7,8), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 2,5% glycerol og 0,5 ug poly (dl-dC)] med 0,5 ng

32P-mærket NF-KB-specifikke probe afledt af H -2Kb promotor eller

32P-mærket Oct-1 sonde [20], [21]. For super-shift assays blev kerneekstrakter præinkuberet med specifikke antistoffer eller antiserum i 1 time på is før inkubering med den mærkede probe. Følgende antistoffer eller antiserum blev anvendt til præinkubation: antistof mod p50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, # sc-7178 X), oprenset kanin-IgG (Cedarlane Laboratories, Hornby, Canada) og anti-p52-serum ( Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA, 06-413). Præ-immune serum, anti-RelA og anti-RelB antisera blev venligst leveret af Drs. N.R. Ris (NCI, MA) og A. Israel (Institut Pasteur, Paris). For kompetitivt bindingsassay blev kerneproteiner inkuberet med 100 gange molært overskud koldt oligonukleotid før tilsætning af mærkede probe. De protein-DNA-komplekser blev separeret på en polyacrylamidgel indeholdende 2,5% glycerol efterfulgt af autoradiografi.

NF-KB-DNA-bindingsaktivitet

Bindingen af ​​p52 eller RelB til NF-KB bindingssekvens blev kvantificeret med Transam ™ NF-KB Family Kit (Active Motif, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt 5 ug af nukleare ekstrakter blev tilsat til en plade med 96 brønde præcoatet med oligonukleotidet indeholdende NF-KB konsensussekvens. Den aktiverede P52 eller RelB stede i ekstrakterne binding til dette nukleotid blev opdaget af sekundære antistoffer konjugeret til HRP.

Immunoblotting

Hele-celle (30 ug), cytoplasmatisk (30 ug) og nuklear (10 ug) lysater blev opløst ved SDS-PAGE og analyseret ved immunblotting. Følgende antistoffer blev anvendt: anti-NF-κB2 P52 (C-5) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-7386) til detektion af p52 og dets precursor P100; anti-NIK (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, # 4994); anti-RelB (C-19) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-226); anti-phospho-p100 (Ser866 /870) (cellesignalering, # 4810); anti-phospho-kBa (Ser32 /36) (5A5) (Cell Signaling, # 5205); anti-kBa (C-21) (Santa Cruz Biotechnology, # sc-371); anti-phospho-IKKα (Ser180) /IKKβ (Ser181) (Cell Signaling, # 2681), anti-IKKα (H-744, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7218), anti-IKKα /β (H-470, Santa Cruz Biotechnology, # sc-7607), anti-TRAF2 (C90-481) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA, 558.890); anti-TRAF3 (H-122) (Santa Cruz Biotechnology, SC-1828); anti-cIAP1 (R anti-lamin A /C (4C11) (cellesignalering, # 4774); anti-α-tubulin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, T9026). Til påvisning af endogent NIK-proteinet blev celler behandlet med 0,1% DMSO eller 20 uM MG132 (peptid INSTITUTE, Osaka, Japan) i 6 timer og cytoplasmatiske ekstrakter blev underkastet immunoblotanalyse.

realtid revers transkription -PCR (RT-PCR) analyse

Real-time RT-PCR-analyse blev udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [7]. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra cellelinjer og æggestokkræft væv under anvendelse ISOGEN (Nippon Gene, Tokyo, Japan) ifølge producentens instruktioner. De mRNA niveauer af

NIK

,

cyclin D1

MMP-9

blev kvantificeret ved hjælp StepOnePlus real-time RT-PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Et hundrede ng af total RNA blev underkastet kvantitativ RT-PCR under anvendelse TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit (Applied Biosystems). Revers transkription blev udført ved 48 ° C i 30 minutter og Taq-DNA-polymerase blev aktiveret ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 amplifikationscykler af denaturering ved 95 ° C i 15 sekunder og annealing og forlængelse ved 60 ° C i 1 minut . MRNA-niveauerne blev normaliseret til 18S ribosomale RNA-niveauer målt ved real-time RT-PCR under anvendelse 100 pg totalt RNA. Ekspression af MIR-31 blev undersøgt under anvendelse TaqMan® Micro RNA Assays (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. MIR-31 niveauer blev normaliseret med RNU48 ekspressionsniveauerne.

lentivira

Lentivirale vektorer stand til at udtrykke shRNA målretning

NIK

(PCS-puro-Niki-1 og pc’er -puro-niki-2) blev beskrevet tidligere [7]. Målretningssekvensen specifik for

grønt fluorescerende protein

(GFP) 5′-ACCCGCGCCGAGGTGAAG-3 ‘blev indsat umiddelbart nedstrøms for H1 promotoren af ​​pSuperRetoro vektoren (Oligoengine, Seattle, WA, USA), genererer PSR-GFPi . The shRNA ekspressionskassetten blev overført til lentiviral vektor, pcs-puro-PRE, der bærer puromycin resistensgenet udtrykkes under kontrol af phosphoglyceratkinase-promotoren [7]. Det resulterende plasmid blev navngivet pcs-puro-GFPi. Til produktion af lentivirus stand til at udtrykke shRNA blev HEK293T celler cotransficeret med pc’er-puro-GFPi (shCtl), pcs-puro-Niki-1 (shnik-1) eller pc’er-puro-Niki-2 (shnik-2) sammen med pCMV-ΔR8.2 emballage konstruktion og pHCMV-VSV-G (slags gaver fra Dr. ISY Chen) ved hjælp FuGENE6 (Promega, Madison, WI, USA). Kultursupernatanter blev opsamlet og filtreret 56 timer efter transfektion. RMG-I og JHOC-5-celler blev inficeret med disse lentivira i 12 timer i nærvær af 10 ug /ml polybren. Inficerede celler blev selekteret i nærvær af 4 ug /ml puromycin (Sigma-Aldrich) 24 timer efter infektion.

NF-KB reportergenassay

RMG-I og JHOC-5-celler var inficeret med lentivirus vektorer, der bærer enten en NF-KB-responsive promotor-drevet Firefly

luciferase

gen (CS-KB-R2.2) eller forlængelsen faktor (EF) -1α promotor-drevet

Renilla luciferase

genet (pCERp) [8], [22]. Resulterende cellepools blev efterfølgende inficeret med lentivirus stand til at udtrykke hver shRNA. Efter selektion med 4 ug /ml puromycin i 3 dage blev celler høstet og luciferaseaktiviteter blev målt under anvendelse Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). NF-KB-afhængige Firefly luciferaseaktivitet blev normaliseret med EF-1α promotor-drevet afhængig

Renilla

luciferaseaktivitet.

Cell-cyklus analyse

Celler blev fikseret i 70% ethanol og inkuberet med 0,5 mg /ml RNase i 45 minutter og derefter farvet med 30 pg /ml propidiumiodid i 30 minutter ved stuetemperatur. DNA-indholdet i celler blev målt under anvendelse af FACS Calibur-system (BD Biosciences) og analyseret CellQuest software (BD Biosciences).

Blød agar-assay

RMG-I celler, der udtrykker shCtl eller shnik-1 var podet i F-12-medium indeholdende 0,33% agar. Efter 4 ugers inkubation blev kolonier større end 60 um i diameter, blev talt for at vurdere forankringsuafhængig cellevækst.

Mus xenograft tumor model

BALB /cAJcl-nu /nu-mus (CLEA Japan , Tokyo, Japan) blev opretholdt under SPF-tilstand på Experimental Animal center i Tokyo Medicinsk og Dental University. RMG-I celler, der udtrykker shCtl eller shnik-1 blev suspenderet i serumfrit medium. Athymiske mus (5-6 uger gamle) blev inokuleret subkutant i postauricular region med 5 × 10

6 celler. Tumorvolumen blev registreret hver uge. Den største langsgående diameter (længde) og den største tværgående diameter (bredde) blev målt med en passer. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af følgende formel: tumor volumen = længde × bredde

2/2. Alle mus blev aflivet 3 uger efter inokulering, og vægten af ​​hver tumor blev målt.

Statistik

Data er præsenteret som gennemsnit ± SD eller som repræsentative billeder af mindst tre uafhængige forsøg. Den statistiske analyse blev udført ved anvendelse af to-halet t-test. For patienten analysen og musemodellen blev signifikante forskelle mellem grupper bestemt ved Mann-Whitney U test. En

P

værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Noncanonical NF-KB-aktivering i æggestokkene kræftceller

For at undersøge, hvordan NF. -κB er konstitutivt aktiveret i æggestokkene kræftceller, vi først undersøgt NF-KB-DNA bindende aktivitet af EMSA. Ovariecancerceller viste markant forhøjede NF-KB-DNA-bindingsaktivitet sammenlignet med HEK293-celler vides at have en basal NF-KB-aktivitet. HOSE1C, en udødeliggjort ovarie overflade epitelcellelinie viste en NF-KB-bindingsaktivitet så lav som HEK293-celler og blev anvendt som en kontrol i de følgende undersøgelser (figur 1A). Bindingen til det radioaktivt mærkede probe blev effektivt konkurrerede med en overskydende mængde af kold probe, viser specificiteten af ​​bindingen (figur 1B). Selvom den vedvarende aktivering af NF-KB er blevet rapporteret i ovariecancer, har NF-KB-DNA-bindende komplekser er involveret i disse celler forblev ukendt. Super-ændring-assays viste, at ikke blot NFKB1 /p50 og RelA, men også NFKB2 /p52 og RelB var involveret i NF-KB-DNA-bindende komplekser i RMG-I og JHOC-5-celler (Figur 1B). Immunoblottings viste disse cellelinjer udtrykte et specifikt phosphorylerede former af IKKα, IKKβ og kBa (figur 1C). Phosphorylering af IKKβ og kBa var mere intens i JHOC-5 og MUB celler, mens IKKα var overvejende phosphoryleret i RMG-I og OMC-3 celler, hvilket tyder fortrinsret aktivering af de kanoniske og noncanonical veje i hver celle linjer. Det faktum, at ekspressionen af ​​NFKB2 /p100 høj grad afhænger af NF-KB-aktivering via den kanoniske vej kan til dels forklare den rigelige udtryk for NFKB2 /P100 og dets phosphoryleret form såvel som P52 i JHOC-5 celler. Den phosphorylerede form af p100 blev påvist i æggestokkene cancercellelinier undtagen RMUG-S, men ikke i kontrol 293 eller HOSE1C celler. Tilstedeværelsen af ​​RelA og RelB i kernen korreleres med resultaterne af EMSA (figur 1D). Disse resultater indikerer, at både den kanoniske og /eller noncanoncal NF-KB pathways differentielt aktiveres i ovariecancerceller.

(A) Fem mikrogram kerneekstrakter fra de anførte cellelinjer blev underkastet EMSA med

32P-mærket oligonukleotider indeholdende en NF-KB bindende sekvens eller Oct-1-bindende sekvens som prober. (B) For kompetitivt assay nukleare prøver blev præinkuberet med 100 gange molært overskud koldt oligonukleotid før tilsætning af mærkede probe (venstre panel). DNA-bindende NF-KB komponenter i de angivne cellelinjer blev bestemt ved super-shift EMSA (højre panel). Nukleare ekstrakter (5 ug) fra de angivne cellelinier blev præinkuberet i 30 minutter med renset muse-IgG, anti-p50 eller anti-c-Rel antistoffer, præimmun (PI), anti-p52, anti-RelA eller anti-RelB sera, og derefter underkastet EMSA med NF-KB-specifik probe. (C og D) Nukleare (10 ug), cytoplasmatisk (30 ug) eller hel-celle (30 ug) ekstrakter blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af immunoblottings med de angivne antistoffer.

NIK spiller en central rolle i konstitutive NF-KB-aktivering i æggestokkene cancerceller

Forhøjet udtryk for NFKB2 /P52 fik os til at undersøge NIK udtryk i æggestokkene cancerceller. Kvantitativ RT-PCR-analyse afslørede, at kontrol HOSE1C celler viste større CT forskel end de 28 æggestokkene kræft cellelinjer testet, blandt hvilke 17 cellelinjer udtrykte 4- til 16 gange mere

NIK

mRNA end kontrol HOSE1C celler (figur 2A). En nylig rapport vist, at tabet af microRNA MIR-31 målretning

NIK

ligger til grund konstitutiv aktivering af NF-KB i voksne T-celle-leukæmiceller [23]. Vi evaluerede derfor MIR-31 ekspression i ovariecancerceller ved kvantitativ RT-PCR. Fire ud af seks kræft cellelinjer havde mindre end 1/8 af miR-31 RNA i HOSE1C celler selvom korrelation mellem

NIK

og miR-31-RNA-ekspression ikke var signifikant (figur 2B og 2C). Vigtigere, kvantitativ RT-PCR-analyse af kræft i æggestokkene væv afslørede en median på 2,4 gange stigning i

NIK

mRNA-ekspression sammenlignet med normale ovariale væv (Figur 2D). Desværre fik miR-31-ekspression i kræft i æggestokkene væv ikke væsentligt forskellige fra dem i normale æggestokkene væv eller statistisk korreleret med

NIK

mRNA-ekspression (figur 2E og 2F). Således visse tilfælde af

NIK

mRNA ophobning kan ikke alene forklares ved reduceret miR-31-ekspression og foreslår tidligere afsløret mekanisme (r) af

NIK

mRNA overekspression.

( A og D) Totalt RNA blev ekstraheret fra de angivne cellelinjer eller kræft i æggestokkene væv og udsat for real-time RT-PCR til kvantificering

NIK

mRNA-ekspression. (A) ACt opgøres som forskellen mellem Ct-værdi på

NIK

mRNA og udvandede 18S rRNA. Enkelte Stjernerne betegner signifikant fald (

P

0,05) i ACt værdi i forhold til HOSE1C celler. (D)

NIK

mRNA niveauer blev normaliseret til 18S RNA. Relativ

NIK

mRNA-niveauer er vist med fold forøgelse i mRNA overflod i forhold til gennemsnittet af normale ovarier (arbitrært sat til 1). (B og E) Totalt RNA anvendes i panel A og D blev underkastet real-time RT-PCR for MIR-31 kvantificering. (B) Den ACt opgøres som forskellen mellem Ct værdien af ​​miR-31, og at den interne kontrol RNU48. Enkelte asterisk angiver signifikant stigning (

P

0,05) i ACt værdi i forhold til HOSE1C celler. (E) De miR-31 niveauer blev normaliseret til de tilsvarende RNU48 niveauer. Relative MIR-31 niveauer er vist med fold stigning i MIR-31 overflod i forhold til gennemsnittet af normale ovarier (arbitrært sat til 1). (C, F) Pearson korrelationskoefficient R

2 mellem NIK mRNA og miR-31 niveauer blev beregnet. (G) Tredive mikrogram lysater blev underkastet SDS-PAGE efterfulgt af immunoblottings med de angivne antistoffer. Til påvisning af endogent NIK blev celler behandlet med MG132 (20 uM) eller DMSO i 6 timer før tilberedningen af ​​cytoplasmatiske ekstrakter. N. S., ikke signifikant.

Ekspression af NIK protein er stramt reguleret af polyubiquitination og proteasom-medieret nedbrydning og generelt holdes ikke kan påvises ved immunoblotting uden at hæmme dets hurtige nedbrydning. Ekspressionen af ​​TRAF2, 3 og cIAP1 i æggestokkene kræftcellelinjer, der negativt regulerer NIK-ekspression forblev sammenlignelig med kontrolceller (fig S1). Som vi var ude af stand til at detektere NIK-proteinet ved simpel immunblotting eller immunpræcipitation-koblet immunoblotting under anvendelse cytoplasmatiske lysater fra disse celle, behandlede vi cellerne med en proteasominhibitor MG132 før proteinekstraktion. Den NIK-proteinet var let påviselige i ovariecancerceller i nærvær af MG132, men ikke i kontrol HOSE1C eller HEK293-celler (figur 2G), hvilket indikerer forøget produktion af NIK-proteinet i ovariecancerceller. Disse data kollektivt indikerer, at NIK afvigende udtrykkes på pretranslational niveau i æggestokkene cancerceller.

Tidligere rapporter viste, at dårlig prognose for patienter med ovariecancer korrelerer med overekspression af pro-MMP-9 og cyklin D1 [24], [25], hvis ekspression vides at blive reguleret af NF-KB. Kvantitativ RT-PCR-analyser viste, at

MMP-9

mRNA-niveauer af de fleste ovarian cancer cellelinjer var højere end for kontrol HOSE1C celler.

MMP-9

mRNA niveauer i hver cellelinje ikke korrelerer med

NIK

mRNA niveauer (figur 3A). Niveauer af

cyclinD1

mRNA i alle de testede æggestokkene kræftceller oversteg HEK293 celler, mens HOSE1C celler rigeligt udtrykt

cyclinD1

mRNA skyldes tvungen udtryk for denne gen for immortalisering. I kræft i æggestokkene væv,

MMP-9

mRNA-ekspression var betydeligt opreguleret og

cyclin D1

mRNA niveauer tendens til at stige i ovariecancer væv selvom disse mRNA-ekspression i hver prøve ikke korrelerer med

NIK

mRNA-ekspression (figur 3B).

Total RNA udvundet fra de angivne cellelinjer (A) eller kræft i æggestokkene væv (B) blev udsat for real-time RT-PCR til kvantificering

MMP-9

eller

cyclin D1

mRNA-ekspression. (A) ACt opgøres som forskellen mellem Ct-værdi på

MMP-9

eller

cyclin D1

mRNA og udvandede 18S rRNA. Enkelte Stjernerne betegner signifikant forskel (

P

0,05) i ACt værdi i forhold til HOSE1C celler (

MMP-9

) eller HEK293 celler (

cyclin D1

). (B) De mRNA niveauer blev normaliseret til 18S RNA. Relative mRNA-niveauer er vist med fold forøgelse i mRNA overflod i forhold til gennemsnittet af normale ovarier (arbitrært sat til 1). Pearson korrelationskoefficient R

2 mellem

MMP-9

eller

cyclin D1

NIK

mRNA niveauer blev vist. Relative mRNA-niveauer beregnes ved fold stigning i mRNA overflod i forhold til den for HOSE1C celler (

MMP-9

) eller HEK293 celler (

cyclin D1

).

For at undersøge, hvordan NIK regulerer NF-KB-afhængig gentranskription i æggestokkene kræft cellelinjer, vi etableret en NF-KB-reporter celle system ved lentivirus transduktion. RMG-I og JHOC-5-celler blev inficeret med lentivirus vektorer bærer en Firefly

luciferase

transkriptionsenhed under kontrol af NF-KB-afhængig promotor eller

Renilla luciferase

transkriptionsenhed under kontrol af konstitutive elongeringsfaktor 1α-afledt promotor som en intern kontrol. Etablerede celle puljer blev efterfølgende inficeret med lentivirus stand til at udtrykke enten shRNA målretning

NIK

eller

GFP

og udsat for luciferaseassays. Udtømning af NIK blev verificeret ved kvantitativ RT-PCR og immunoblotting under tilstedeværelse af MG132 (figur 4A). NIK depletion reduceret p52-ekspression og NF-KB-afhængigt reportergen-ekspression i RMG-I og JHOC-5-celler (figur 4B og 4C). Ekspression af et andet shRNA målretning

NIK

mRNA resulterede i lignende undertrykkelse af NF-KB-afhængig transskription, at udelukke muligheden for forbi mål effekter (figur S2A, B).

(A) RMG- I og JHOC-5 celler blev inficeret med lentivirus vektorer, der udtrykker shRNA målretning

NIK

(shnik-1) eller

GFP

(shCtl). Totalt RNA blev ekstraheret fra disse celler og underkastet real-time RT-PCR til kvantificering

NIK

mRNA-ekspression.

NIK

mRNA niveauer blev normaliseret til 18S RNA. Relativ

NIK

mRNA-niveauer er vist med fold forøgelse i mRNA overflod i forhold til gennemsnittet af shCtl (arbitrært sat til 1). Enkelte Stjernerne betegner signifikant fald (

P

0,05) sammenlignet med shCtl celler. Parallelt blev celler behandlet med MG132 (20 uM) i 6 timer før tilberedningen af ​​cytoplasmatiske ekstrakter. Cytoplasmatiske ekstrakter (30 ug) blev underkastet immunoblotanalyse med de angivne antistoffer. (B) RMG-I og JHOC-5-celler inficeret med et lentivirus vektor, der bærer en NF-KB-afhængige Firefly luciferase ekspressionskassetten og at bære et EF-1α-promotor-afhængig

Renilla

luciferase ekspressionskassette. Etablerede celle puljer blev inficeret med lentivirus vektorer, der udtrykker shRNA målretning

NIK

(shnik-1) eller

GFP

(shCtl). Cellerne blev selekteret med puromycin (4 ug /ml) i 72 timer og underkastes den dobbelte luciferase assay, i hvilket Firefly luciferaseaktivitet blev normaliseret med

Renilla

luciferaseaktivitet. Relative luciferaseaktiviteter er udtrykt som lysenhed sammenlignet med kontrollen (shCtl). Yang et al.