PLoS ONE: En Rac1 /Cdc42 GTPase-Specific lille molekyle Inhibitor Undertrykker Vækst af primære humane prostatakræft Xenografter og forlænger overlevelse i Mice

Abstrakt

dereguleret Rho GTPaser Rac1 og Cdc42 er opdaget i forskellige tumorer, herunder prostata og Rac proteinekspression øger i prostatacancer. RAC og cdc42 veje fremmer ukontrolleret spredning, invasion og metastatiske egenskaber af humane kræftceller. Vi syntetiserede den hidtil ukendte forbindelse AZA1 baseret på strukturel information af den kendte Rac1 inhibitor NSC23766. I den aktuelle undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​hæmning af disse veje, ad AZA1 på prostata tumorigenicitet ved at udføre prækliniske undersøgelser under anvendelse af en xenotransplantat musemodel af prostatacancer. I androgen-uafhængige prostatacancerceller, AZA1 hæmmede både Rac1 og Cdc42 men ikke RhoA GTPase aktivitet på en dosisafhængig måde og blokeret cellulær migration og proliferation. Cyclin D1 udtryk faldt betydeligt efter Rac1 /Cdc42 hæmning i prostata kræftceller. AZA1 behandling også nedreguleret PAK og AKT-aktivitet i prostata kræftceller, der er forbundet med induktion af den pro-apoptotiske funktion BAD ved undertrykkelse af serin-112-phosphorylering. Daglig systemisk administration af AZA1 i 2 uger reducerede væksten af ​​humane 22Rv1 prostata tumorxenotransplantater hos mus og forbedret overlevelse tumorbærende dyr betydeligt. Disse data antyder en rolle AZA1 til blokering Rac1 /Cdc42-afhængig cellecyklusprogression, kræft cellemigration og forøgelse af cancerceller apoptose involverer nedregulering af AKT og PAK signalvejen i prostatacancerceller. Vi foreslår derfor, at en lille-molekyle-hæmmer rettet mod Rac1 /Cdc42 Rho GTPase signalveje kan anvendes som en ny behandling til patienter med fremskreden prostatacancer

Henvisning:. Zins K, Lucas T, Reichl P, Abraham D, Aharinejad S (2013) En Rac1 /Cdc42 GTPase-Specific lille molekyle Inhibitor Undertrykker vækst af primære humane prostatakræft Xenografter og forlænger overlevelse i mus. PLoS ONE 8 (9): e74924. doi: 10,1371 /journal.pone.0074924

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: April 15, 2013; Accepteret: August 7, 2013; Udgivet: 11 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Zins et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. PRIZE projekt nummer: Z080347; Austria Wirtschaftsservice Ges.m.b.H (AWS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den hyppigste årsag til kræft og anden hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald blandt mænd [1]. Selvom screening for prostatacancer er forbedret, vil 10-20% af patienterne blive diagnosticeret med lokalt fremskreden eller metastatisk sygdom, mens andre vil fremskridt trods kirurgi, stråling og androgen-deprivation terapi [2], [3]. Derfor fremskreden prostatacancer er fortsat en betydelig sundhedspleje problem, og identifikation af nye målrettede behandlinger med fokus på molekylære signalveje er afgørende for at forbedre terapeutisk intervention.

Rho GTPaser såsom Rac, Cdc42 og RhoA signalerer proteiner, der regulerer cytoskelet organisation, cellecyklusprogression, celle overlevelse og migration direkte bidrager til tumorvækst og progression [4]. Cdc42 desuden spiller en stor rolle i kontrollen af ​​cellemigrering [5]. Rho GTPaser findes enten som inaktive, BNP-bundne former eller aktive, GTP-bundne former, der bestemmer de cellulære funktioner i Rho GTPaser [6]. Rho GTPase aktivitet kan påvirkes af forskellen aktivering af Rho GTPase regulere signalveje eller varierende mængder af Rho GTPase regulatoriske molekyler såsom Rho GTPase-aktiverende guanin nukleotid exchange faktorer (GEFs) [4]. Deregulerede Rho GTPaser er opdaget i forskellige proliferative maligniteter, herunder prostatatumorer [4] og Rac proteinekspression forøges betydeligt i prostatacancer [7].

Rho GTPaser regulerer cellecyklussen ved aktivering af c-Jun N terminale kinase (JNK) og p38 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), hvilket fører til opregulering af cyclin D1 [8], [9], [10]. Den Rac1 signaleringsvej spiller også en væsentlig rolle i celleoverlevelse involverer v-akt murine thymoma viral onkogen homolog 1 (AKT) kinase [11]. AKT igen phosphorylerer BCL2-associeret agonist af celledød (BAD) [12], et proapoptotiske medlem af Bcl-2-familien, neutralisere de proapoptotiske virkninger af BAD [13]. p21 protein (Cdc42 /Rac) -aktiverede kinase 1 (PAK1) er en yderligere vigtig nedstrøms effektor af Cdc42 og Rac1 [14], [15] i kontrollen af ​​programmeret celledød [16].

Siden seneste undersøgelser har impliceret aberrerende Rac1 og Cdc42 aktivitet i human cancer er disse Rho GTPaser blevet foreslået som anticancer mål [17], [18]. Rac1 var en af ​​de første mål i rationelt lægemiddeldesign tilgange og en småmolekyle-inhibitor (NSC23766), som interfererer med interaktionen af ​​Rac1 med flere GEFs blev identificeret, kun påvirkes minimalt Cdc42 aktivitet [19].

Vi var interesseret i at udvikle mere potente, hidtil ukendte, kemisk modificeret små molekyler til at inhibere Rho GTPase aktivitet for mulig klinisk anvendelse i cancerbehandling ved anvendelse af Rac1 inhibitoren NSC23766 som en hovedstruktur for forbindelsen design [19]. Vi rapporterer nu identifikationen og biologiske aktivitet AZA1, en hidtil ukendt dobbelt Rac1 og Cdc42 inhiberende forbindelse, som hæmmer prostatakræft vækst effektivt i en human prostatacancer xenograftmodel. Salg

Materialer og metoder Salg

Cellelinjer

Humant androgen-uafhængige prostatacancerceller 22Rv1 (CRL-2505), PC-3 (CRL-1435) og DU 145 (HTB-81) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, PAA, Pasching, Østrig) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, PAA), 0,1 M ikke-essentielle aminosyrer, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellelinier blev testet for ægthed ved hjælp af STR-PCR (PowerPlex 16 HS System, Promega, Madison, WI).

Compound generation

På baggrund af den tilgængelige strukturelle og funktionelle oplysninger om Rac1-GEF interaktion af Rac1 inhibitorforbindelse NSC23766 [19] og anvendelse af en virtuel screening-strategi under anvendelse af ZINC databasen [20], genereret vi 21 kemisk forskellige potentielle Rac-inhiberende forbindelse formler, som derefter blev syntetiseret af SPECS (Delft, Holland). Efterfølgende blev alle syntetiserede forbindelser testet

in vitro

ved opløselighed undersøgelse, aktivering analyser og mitokondrie toksicitet assays (WST-1) som vist nedenfor.

Rac1, cdc42 og RhoA aktivering analyser

prostatacancerceller blev podet i plader med 6 brønde og sultet i 24 timer. Celler blev inkuberet med lille molekyle inhibitor AZA1 20 uM i 60 minutter og derefter stimuleret med 50 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF; R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

AZA1 behandling hæmmer Rac1 og Cdc42 aktivitet i prostatacancerceller

En

in vitro

skærm af småmolekylære inhibitorer baseret på modifikationer af NSC23766 at identificere dobbelt inhiberende forbindelse identificerede aktivitet strukturen N * 2 *, N * 4 * bis- (2-methyl-1H-indol-5-yl ) -pyrimidin-2,4-diamin (AZA1) (figur 1) for at have en stærk inhibitorisk aktivitet (Text S1, tabel S1, fig S1 og S2). Indledningsvis blev Rac1 aktivering i 22Rv1 prostata cellelysater efter stimulering med EGF gennemgås i screeningseksperimenter. Aktivering af receptoren EGF (EGF-R) spiller en central rolle i proliferation og invasion af prostatakræft og udgør derfor en patologisk relevant faktor for analyse af vækst prostatakræft i 22Rv1 modellen [24]. Aktiviteten af ​​Rac1 var opreguleret i tredobbelte efter stimulering af 22Rv1 prostatacancerceller med EGF i sammenligning med ubehandlede celler. Den mest effektive Rac1 inhibitor identificeret var AZA1 (tabel S1). Behandling af 22Rv1 human prostatacancer celler med 5, 10 eller 20 uM AZA1 i 60 minutter dosisafhængigt reduceret Rac1 aktivitet signifikant med 45% (p 0,022), 70,4% (p 0,004) og 85,7% (p 0,002), , sammenlignet med 20 uM NSC23766 (figur 2A venstre panel). AZA1 (20 uM) også signifikant nedreguleret Rac1 aktivitet i DU 145 og PC-3-prostata-cellelinier med 86,8% (p 0,006) og 89,9% (p 0,001), (figur 2A højre panel). Desuden AZA1 behandling af 22Rv1 ved 2, 5, 10 eller 20 uM undertrykkes Cdc42 aktivitet med 54%, (p 0,02), 65,4% (p 0,01), 81,6% (p 0,002) og 90,3% (p 0,001), henholdsvis (figur 2B venstre panel). AZA1 (20 uM) også signifikant nedreguleret Cdc42 aktivitet i DU 145 og PC-3-prostata-cellelinier med 71,1% (p 0,0015) og 86% (p 0,007), (figur 2B højre panel). I modsætning hertil AZA1 behandling (20 uM) forårsagede ingen undertrykkelse af RhoA-aktivitet (figur 2C). Disse resultater indikerer, at AZA1 specifikt og væsentligt nedregulerer Rac1 og Cdc42 aktivitet i 22Rv1, DU 145 og PC-3 humane prostata-cellelinjer.

(N * 2 *, N * 4 * bis- ( 2-methyl-1H-indol-5-yl) -pyrimidin-2,4-diamin).

A, Rac1 B, Cdc42 og C, RhoA aktivering i 22Rv1, DU145 og PC3 prostatacancer celler efter inkubation (60 min) med forskellige koncentrationer af sammensatte AZA1 og stimulering med 50 ng /ml EGF. Hjælp af tre uafhængige forsøg er vist. * Signifikant forskellig fra EGF.

AZA1 blokerer spredning af humane prostata kræftceller

Vi derefter analyseret virkningerne af AZA1 på cellulær proliferation og apoptose i målceller. Behandling af ikke-stimulerede 22Rv1 celler med AZA1 dosisafhængigt signifikant reduceret cellulær proliferation efter 72 timers inkubation med 2, 5 eller 10 uM (p 0,001) AZA1 sammenlignet med kontrolceller (figur 3A, venstre felt). For at analysere, om AZA1 også kan reducere celleproliferation i EGF stimulerede celler, vi behandlede EGF-stimulerede prostatacancerceller med AZA1. Behandling med 50 ng /ml EGF øgede 22Rv1 (p 0,05, figur 3A, højre panel), og steg svagt DU 145 og PC-3 (figur S3) celleproliferation. AZA1 behandling dosisafhængigt, reducerede signifikant cellulær proliferation efter 72 timers inkubation med 2, 5 eller 10 uM (p 0,001) AZA1 sammenlignet med EGF-stimuleret og ubehandlet 22Rv1 (figur 3A, højre panel), DU 145 og PC-3 celler (Figur S3).

A, Relativ massefylde af kræftceller op til 72 timer efter behandling med 2, 5, og 10 uM sammensatte AZA1 i ustimuleret (venstre panel) eller EGF-stimuleret (højre panel) kræft celler blev målt ved anvendelse af WST-1 celleproliferationsassay. AZA1 undertrykker 22Rv1 prostatacancer celleproliferation i både ikke-stimulerede og EGF-stimuleret cancerceller i en dosisafhængig måde. Hjælp af tre uafhængige forsøg er vist. *, Signifikant forskellig fra kontrol (venstre felt) og fra kontrol- og EGF-stimulerede celler (højre panel); +, Signifikant forskellige fra kontrol (højre panel) ;. B, Repræsentant flowcytometri histogrammer viser cellepopulationer i sub- G

0 /G

1, G

0 /G

1, S og G

2 /

M faser. 22Rv1 celler blev inkuberet med 10 pM AZA1 i 24 timer. Kontrolceller modtog ingen behandling. Cellulære DNA indhold blev analyseret ved flowcytometri efter farvning med propidiumiodid. C, cyklin D1-ekspression. Repræsentative flowcytometrianalyse og kvantificering af fluorescensintensiteten i 22Rv1 celler behandlet med 10 pM AZA1 i 60 minutter (rød histogram) sammenlignet med ubehandlede celler (fed line) og isotypekontroller (tynd linje). Forbindelse behandling reducerede cyclin D1-niveauer. *, Signifikant forskellige vs. kontrol.

Næste vi analyserede cellecyklusfordeling efter AZA1 behandling. 22Rv1 celler blev adskilt i sub G

0 /G

1, G

0 /G

1, S og G

2 /M faser. Den sub G

0 /G

1 befolkning blev anvendt til at estimere apoptose. Figur 3B viser et repræsentativt sæt af data fra ubehandlede og AZA1-behandlede 22Rv1 celler. 22Rv1 celler behandlet med 10 pM AZA1 i 24 timer viste en stigning i sub G

0 /G

1 fase fra 1,47% til 26,9% (± 2,78; P 0,05) og et fald i G

2 /M faser fra 32.25% til 20.30% (± 3,56; p 0,05) i celler behandlet med 10 pM AZA1, hvilket tyder inhibering af cellulær proliferation og en stigning i antallet af apoptotiske begivenheder. Vi derefter testet effekten af ​​AZA1 på cellecyklussen regulatoriske protein cyclin D1. I cellelysater behandlet med 10 pM AZA1 i 60 min, cyklin D1 fluorescensintensitet faldt signifikant med 22% ± 4,2% (p 0,001) sammenlignet med ubehandlede kontroller repræsentativt vist i figur 3C. Disse resultater indikerer en rolle for AZA1 at blokere Rac1 og Cdc42-afhængige cellecyklus begivenheder i 22Rv1 prostatacancerceller og induktion af apoptose.

AZA1 hæmmer kræft celle migration

Aktiv migrering af tumorceller er en forudsætning for tumorudvikling og metastase og rapporter viser, at EGF-induceret kræft cellemigration kan inhiberes ved undertrykkelse af Cdc42 /Rac1 signalveje [25]. Således har vi undersøgt effekten af ​​AZA1 for migration af EGF-stimuleret 22Rv1, DU 145 og PC-3 celler i Transwell analyser. EGF-stimulering signifikant øget cancer cellemigrering i 22Rv1 (figur 4A), DU 145 og PC-3 (fig S4A) celler (p 0,001). Behandling af celler med 2 pM AZA1 i 24 timer signifikant reduceret kræft cellemigration ved 59,6 ± 12% (22Rv1 celler; p 0,001; Figur 4A), 56,8 ± 18,8% (DU 145-celler; p 0,001; Figur S4A) og 57,3 ± 16,1% (PC-3 celler; p 0,001; Figur S4A). sammenlignet med EGF-stimuleret cancerceller

A, Repræsentative billeder af migrerede prostata cancer celler fra en

in vitro

migration assay er vist. 22Rv1 prostatacancerceller blev stimuleret med 50 ng /ml EGF og behandlet med 2, 5 eller 10 uM AZA1 for 24 timer og migrerede kræftceller kvantificerede senere i

in vitro

migration assays. Data blev indsamlet fra fem individuelle træk synsfelter (40x) fra tredobbelte Boyden kamre. * Signifikant forskellig fra kontrol; +, Signifikant forskellige fra kontrol- og EGF-stimulerede celler. B, Effekt af AZA1 behandling på lamellipodia og filopodia formation. 22Rv1 prostatacancerceller blev udpladet på cellekultur-kamre, stimuleret med 50 ng /ml EGF og inkuberet med 5 og 10 um AZA1 i 24 timer. Paraformaldehyd fikserede celler blev farvet med Atto-488 phalloidin (F-actin, grøn) for at detektere polymeriseret actin cytoskeleton, filopodia og lamellipodia og modfarvet med DAPI (blå) og fotograferet (forstørrelse, x1000). Arrow head indikerer filopodia, pil angiver lamellipodia. Antallet af filopodia og lamellipodia per celle blev beregnet ud fra 25 celler i hver gruppe. AZA1 fører til ændringer i cellulær morfologi og undertrykker filopodia og lamellipodia formation. *, Signifikant forskellig fra kontrol; +, Signifikant forskellig fra kontrol og EGF-stimulerede celler; ‡, signifikant forskellig fra EGF-stimulerede celler. Co, kontrol. C, Effekt af AZA1 på actin dynamik. Udtryk af F-actin og G-actin i 22Rv1, DU 145 og PC-3 celler analyseret ved immunblotting (F-actin /G-actin-forhold). Bjælker repræsenterer F /G-actin middelværdi ± SD. *, Signifikant forskellig fra kontrol af den respektive cellelinje; +, Signifikant forskellig fra kontrol og EGF-stimulerede celler fra den respektive cellelinje.

Behandling med 2 pM AZA1 også reduceret migration cancercelle i alle tre cellelinier i sammenligning med kontrolceller uden EGF-stimulering ved 40,2 ± 12,1% (22Rv1 celler; p 0,01, figur 4A), 20,2 ± 8,9% (DU 145-celler; p 0,04; fig S4A), og 24,9 ± 16,1% (PC-3-celler; p 0,05; fig S4A), sammenlignet med EGF-stimuleret cancerceller

Behandling af celler med 5 uM og 10 uM AZA1 yderligere reduceret migration ved 72,1% og 79,1% (p. 0,001) i 22Rv1 celler ved 72,4% og 91,4% (p 0,001) i DU 145-celler, og ved 60,9% og 74,7% (p 0,001) i PC-3-celler, sammenlignet med EGF-stimulerede celler (figur 4A og figur S4A). Disse resultater indikerer en rolle for AZA1 at blokere Rac1 og Cdc42-afhængig migration af 22Rv1, DU 145 og PC-3 prostatacancerceller.

AZA1 reducerer lamellipodia og filopodia dannelse og mindsker F /G-actin forhold

Cdc42 og Rac1 er også afgørende i dannelsen af ​​filopodia og lamellipodia, som er vigtige i invasionen af ​​kræftceller [26]. Vi undersøgte derfor effekten af ​​AZA1 på cellemorfologi hjælp phalloidin farvning af 22Rv1, DU 145 og PC-3 celler, der specifikt pletter polymeriseret aktincytoskelettet. Morfologisk er antallet af 22Rv1 lamellipodia og filopodia steg betydeligt på EGF-stimulering (p 0,04, figur 4B). Behandling med AZA1 ved 5 og 10 uM resulterede i signifikant reduceret lamellipodia (p 0,01) og filopodia (p 0,01) dannelse i 22Rv1 prostatacancerceller efter 24 timer sammenlignet med EGF-stimulerede celler (figur 4B)

I DU 145 celler, mens talrige filopodia er observeret, at stigningen efter EGF-stimulering, næsten ingen lamellipodia er synlige. Svarende til effekten på 22Rv1 celler, behandling med AZA1 ved 5 og 10 uM resulterede i dramatisk reduceret filopodia dannelse i DU 145 prostatacancerceller efter 24 timer i forhold til EGF-stimulerede celler (Figur s4b, øvre tre paneler). I PC-3 celler, både lamellipodia og filopodia dannelse forekom i kontrol og EGF-stimulerede celler. Efter behandling med AZA1 (5 og 10 uM), lamellipodia var næsten upåviselig og celler udviklet en mere afrundet morfologi. Filopodia var stadig observeret efter 5 pM AZA1 behandling, selv om der blev reduceret med 10 pM AZA1 (Figur s4b, lavere tre paneler).

Derfor AZA1 hæmmede lamellipodia og filopodia dannelse i prostata kræftceller, viser forskellige grader af undertrykkelse afhængigt af cancer celletype. Disse data indikerer en direkte regulerende effekt af Rac1 /Cdc42 aktivitet på lamellipodia og filopodia udvidelse i alle testede cellelinjer, der kan blive påvirket af AZA1 behandling. Tilsammen udgør disse data viser en særlig rolle for AZA1 hæmme Rac1 /Cdc42-medieret celle morfologi.

Næste vi undersøgte F- og G-actin indhold i prostata kræftceller til at afgøre, om AZA1 kan påvirke dynamisk actin omlejring . AZA1 reducerede lamellipodia og filopodia dannelse og reduceret kræft celle migration. Da Cdc42 og Rac er kendt for at spille vigtige roller i actin omlejring, hvilket er en forudsætning i disse processer [28], vurderede vi virkningen af ​​Rac1 /Cdc42-inhibering på forholdet mellem Rac1 og Cdc42 aktivitet og dynamiske reorganisering af det actin skelet. Immunblotting-analyser af F- og G-actin fraktioner viste, at den relative ekspression niveauet af F-actin /G-actin var signifikant højere i EGF-stimuleret 22Rv1, DU 145 og PC-3 prostatacancerceller sammenlignet med kontrolceller (p 0,05, figur 4C). Behandling med AZA1 ved 2, 5 og 10 uM reducerede signifikant den relative ekspression forholdet F- til G-actin i alle tre cellelinier efter 24 timer sammenlignet med EGF-stimulerede cancerceller (p 0,01; figur 4C) og kontrolceller ( p 0,05;.. Figur 4C)

Disse resultater indikerer, at lamellipodia og filopodia dannelse i prostata kræftceller er forbundet med reorganiseringen af ​​actinfilamenter og at denne proces er påvirket af AZA1 behandling

AZA1 nedregulerer PAK signalvejen

gruppe i p21-aktiverede kinaser (PAK) er vigtige effektorer af de små GTPaser Rac og cdc42, som regulerer celle migration, overlevelse og spredning [27], [29]. PAK også regulerer Rac-medieret lamellipodia forlængelse, migration og invasion af cancerceller [27]. At analysere signalveje, der kunne mediere virkningerne af AZA1 medieret Rac1 /Cdc42-inhibering, undersøgte vi aktiviteten af ​​den nedstrøms effektor PAK ved at evaluere PAK phosphorylering i EGF-stimuleret cancerceller efter AZA1 behandling. Dataene viser, at PAK1 /2 phosphorylering i serin 144/141, som opretholder den katalytiske aktivitet af Paks [30], blev dosisafhængigt signifikant reduceret med 46,9 ± 19,1% (2 uM), 55,5 ± 18,4% (5 uM) og 85 ± 14,3% (10 uM) (p 0,04) på ​​AZA1 behandling i 22Rv1 celler sammenlignet EGF-stimulerede celler (figur 5). Tilsvarende PAK1 /2 phosphorylering i serin 144/141 blev også dosisafhængigt og væsentligt reduceret op til 52,4 ± 15,1% (p 0,05) og 48,1 ± 11,5% (p 0,04) henholdsvis den AZA1 behandling af EGF-stimuleret DU 145 og PC-3-celler (Figur S5), hvilket indikerer, at Rac1 /cdc42 hæmning blokerer PAK1 signalvejen i disse prostata kræftceller. Pak1 proteinniveauer blev ikke påvirket af AZA1 behandling (data ikke vist). Disse resultater tyder på, at AZA1 påvirker celle motilitet og actin omlægning i prostata kræftceller ved at undertrykke Rac1 og Cdc42 aktivitet via PAK1 /2 phosphorylering.

Analyse af PAK, AKT og BAD-phosphorylering i EGF-stimuleret 22Rv1 prostatacancerceller efter AZA1 behandling. Repræsentative Western blot billeder og kvantificering af immunblots farvet med phospho-PAK1 /2 (pPAK), phospho-AKT (Pakt) og phospho-BAD (pBAD) antistoffer før og efter behandling med 2, 5 og 10 uM AZA1 i 24 timer. Rac1 /Cdc42 blokade reducerer fosforylering af PAK1, AKT og BAD i 22Rv1 prostatacancerceller i forhold til kontrolgruppen (hjælp af 3 uafhængige forsøg). *, Signifikant forskellig fra ustimulerede og ubehandlede kontroller; +, Signifikant forskellig fra EGF-stimuleret kontrol; ‡, signifikant forskellig fra ustimulerede, ubehandlet kontrol og kontrol EGF-stimuleret. SP, specifikke protein; LC, lastning kontrol.

AZA1 nedregulerer AKT signalvejen og reducerer BAD fosforylering

For at identificere yderligere nedstrøms Rac1 /cdc42 kandidater ramt af AZA1 behandling, vi analyserede AKT og MAPK’er aktivitet under anvendelse phospho-specifikke antistoffer. AKT og ERK aktiviteter er blevet reduceret ved reduktion af PAK1 ekspression fører til nedsat celleproliferation, migration /invasion og overlevelse i tyktarmskræft [28]. Desuden har AKT signalvej vist sig at være involveret i prostatakræft progression og overgang til androgen-uafhængig sygdom [31].

Vi fandt, at Rac1 /Cdc42 hæmning af AZA1 i 24 timer medførte en markant dosisafhængig inhibering af phospho-AKT niveauer ved 20,8% (2 uM), 39,3% (5 uM) og 62,5% (10 uM) (p 0,05) efter AZA1 behandling af EGF-stimulerede 22Rv1 celler (figur 5). I modsætning hertil AZA1 behandling forårsagede ingen ændringer i phosphorylering af potentielle Rac1 effektorer ERK, JNK eller p38 (data ikke vist), hvilket indikerer, at aktivering af disse MAPK pathways ikke påvirkes af Rac1 og Cdc42-inhibering i 22Rv1 prostatacancerceller.