PLoS ONE: Anvendelse af Holistisk væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri Based Urinary Metabolomics for prostatakræft Detection og Biomarkør Discovery

Abstrakt

Menneskelige udviser store variationer i deres metaboliske profiler på grund af forskelle i genetisk faktorer, kost og levevis. Derfor for at detektere metaboliske forskelle mellem individer robuste analysemetoder er nødvendige. En protokol blev fremstillet baseret på anvendelse af Liquid schromatografi højopløsningsmassespektrometri (LC-HRMS) i kombination med ortogonal Hydrofil Interaction (HILIC) og Omvendt fase (RP) væskekromatografi metoder til analyse af urin metabolomet, som derefter blev vurderet som et diagnostisk værktøj for prostatakræft (en almindelig, men meget heterogen tilstand). LC-HRMS metode viste sig at være robust og udstillet fremragende gentagelsesnøjagtighed for retentionstider ( ± 1%), og masse nøjagtighed ( ± 1 ppm). Baseret på normaliserede data (mod kreatinin niveauer, osmolalitet eller MS samlet anvendeligt signaler /MSTUS) kombineret med overvåget multivariat analyse ved hjælp Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis (OPLS-DA), var vi i stand til at skelne urinprøver fra mænd med eller uden prostata kræft med R2Y (cum) 0,9. Desuden bruger modtageren operator egenskaber (ROC) test, arealet under kurven (AUC) for kombinationen af ​​de fire bedst karakteriserede biomarkør forbindelser var 0,896. De fire biomarkør Forbindelserne viste sig også at adskille sig væsentligt (P 0,05) mellem en uafhængig patient kohorte og kontroller. Det er første gang en sådan grundig test er blevet anvendt på denne type model. Hvis valideret, de etablerede protokol giver en robust tilgang med en potentielt bred anvendelse til metabolit profilering af menneskelige kropsvæsker i sundhed og sygdom

Henvisning:. Zhang T, Watson GD, Wang L, Abbas M, Murdoch L, Bashford L, et al. (2013) Anvendelse af Holistisk væskekromatografi-højopløsningsmassespektrometri Based Urinary Metabolomics for prostatakræft Detection og Biomarkør Discovery. PLoS ONE 8 (6): e65880. doi: 10,1371 /journal.pone.0065880

Redaktør: Irina U. Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Januar 30, 2013; Accepteret: April 29, 2013; Udgivet: 18 juni 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende Scottish Life Sciences Alliance for støtte til massespektrometri udstyr. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den mest udbredte cancer hos den mandlige befolkning i de vestlige lande. Prostatakræft er meget heterogen med meget varierende kliniske resultater: indolent sygdom tendens til ikke at gøre fremskridt selv i mange år, mens aggressiv (høj kvalitet) sygdom ofte skrider hurtigt at resultere i metastaser som uundgåeligt resulterer i for tidlig død. Derudover er der en betydelig begrænsning i specificitet med gældende praksis ved anvendelse af specifikt antigen (PSA) måling serum prostata som et diagnostisk værktøj. Der er derfor et presserende behov for bedre diagnostiske og prognostiske tests for prostatakræft.

Evolving beviser peger til indgangen med alsidige metaboliske veje i brændstofpåfyldning carcinogenese [1] derfor detaljeret analyse af tumor-associerede metabolomet kan afslører hidtil ukendte biomarkører [2], [3]. Analyse af urin, plasma og /eller vævsprøver kan udføres med kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi og /eller massespektrometri (MS) kombineret med separationsteknikker, såsom væskekromatografi (LC) og /eller gaschromatografi (GC). Sreekumar

et al

. udført irrelevante metabolomiske profilering for prostatakræft ved hjælp af LC /GC-MS på tværs af tre forskellige typer af kliniske prøver (urin, plasma og væv). Over 1.000 funktioner blev påvist på tværs af de analyserede prøver [4]. En seks-metabolit profil blev foreslået at betyde høj risiko for cancer progression og yderligere isotopfortyndings GC-MS-analyse identificeret sarcosin som en potentiel urin biomarkør for aggressiv prostatakræft. Skuffende, sarcosin som en (urin eller plasma) biomarkør i prostatakræft er ikke blevet støttet af flere uafhængige undersøgelser efterfølgende [5] – [15]. Desuden har kun en håndfuld af disse undersøgelser har forsøgt at udføre målrettede metabolit profilering [6], [16], [17]. I disse efterfølgende studier, -MS brugen af ​​GC-MS eller differential mobilitet analyse (DMA), forudsat endnu mere begrænset dækning af metabolitter i forhold til den undersøgelse, som Sreekumar

et al

[4]. Derfor er der et reelt behov for at udvikle en robust metodisk og analytisk platform for at lette den fremtidige indsats i den globale profilering af metabolomet i prostatakræft biomarkør opdagelse [18].

Urin har nogle fordele for metabolomics studier, da det har en høj tæthed af metabolitter, lavt indhold af protein, opsamles ikke-invasivt og kræver minimal prøveforberedelse før analyse. For nylig er anvendelsen af ​​høj opløsning (HR) MS baseret urin metabolomics vundet popularitet i studiet af kræft diagnose og biomarkør opdagelse, især i kombination med forskellige LC teknikker. HRMS viser højere dækning af metabolitten profil end andre metoder, og evnen til at identificere potentielle biomarkør forbindelser [19] – [24]. Indførelsen af ​​hydrofile Interaction Liquid Chromatography (HILIC), hvor ophobningen mekanisme er vinkelret på den af ​​omvendt fase (RP) Liquid Chromatography, tilbyder en egnet adskillelse platform for de mange højt polære metabolitter i urinen [25]. I en nylig undersøgelse af blære og nyre kræft biomarkører [22], kombineret multivariat analyse (MVA) og Orthogonal Partial Least Square-Discriminant Analysis (OPLS-DA) af samlede data fra RP og HILIC LC-HRMS viste 100% nøjagtighed i adskillelse af kræft og raske korrekt.

data normalisering betragtes som en vigtig, men unstandardised skridt i human urin analyse [26]. Principal Component Analysis (PCA) score plots kan gøres helt anderledes simpelthen afhængig af den normalisering, der anvendes, og værdien af ​​kandidat biomarkører kan afkræftes ved at vælge en “forkert” intern komponent som reference. Signalet /niveau af kreatinin og total ion strøm (TIC) er almindeligt anvendt som normaliseringsfaktorer i LC-HRMS baseret urin metabolit profilering undersøgelser [4], [20], [22], [24]. Warrack

et al

indført en ny normalisering strategi baseret på MS Total Nyttige Signaler (MSTUS) som havde opmuntrende korrelation til de data baseret på normalisering til urin osmolalitet og anbefalede anvendelse af mindst to forskellige normalisering metoder til at sikre statistisk signifikant ændringer i metabolit profil [27].

en protokol med en kombination af GC-MS og LC-MS til at udføre metaboliske profilering af plasma og serum blev for nylig beskrevet [28]. I modsætning urin er det ikke nødvendigt at normalisere dataene til blod-afledte prøver i metabolomics undersøgelser. Selv er også blevet rapporteret omfattende protokoller bruger GC-MS og LC-MS at profilere urin metabolomet [29], [30] ingen af ​​dem har diskuteret eller sammenlignet normalisering metoder til nogen stor udstrækning. Desuden er metabolitten dækning ved GC-MS nødvendigvis begrænset til flygtige komponenter. Kombinationen af ​​to ortogonale LC metoder til metabolomiske profilering kun har været anvendt i perioden siden beskrevet i referencerne 28 og 30. Bygning på vores tidligere arbejde protokoller [25], har vi yderligere optimeret vores metode og analyse pipeline, og profileret urinprøver fra patienter med prostatacancer og kontrol urinen ved LC-HRMS under anvendelse ortogonale separationsmetoder. Effekten af ​​tre forskellige normalisering metoder i dataanalyse blev demonstreret. Ved at bruge resultaterne af kliniske forsøg den kræsne evne af metabolomiske profilering af urin i forhold prostatakræft blev vurderet ved hjælp af både OPLS-DA modeller og specifikke biomarkører. Undersøgelsen blev styret af standarderne for Indberetning af Diagnostic nøjagtighed (stard) kriterier [31], og evalueringen checkliste kan findes i (File S1).

Materialer og metoder

Kemikalier og materialer

HPLC-kvalitet acetonitril (ACN) blev købt fra Fisher Scientific, UK. HPLC-kvalitet vand blev fremstillet ved en Direct-Q3 ultrarent vand System fra Millipore, UK. AnalaR kvalitet myresyre (98%) blev opnået fra BDH-Merck, UK. Ammoniumcarbonat og ammoniumacetat blev købt fra Sigma-Aldrich, UK.

prøvetagning

Alle prøver undersøgt blev opnået med passende skriftlig tilladelse fra patienter. Indsamlingen af ​​prøver blev godkendt af institutionelle etik Review Board (Joint Den kinesiske University of Hong Kong – Ny Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee). Nærmere oplysninger om patient-relaterede kliniske oplysninger, herunder parametre prostatakræft er beskrevet i tabel 1.

prøveforberedelse

De urinprøver blev opbevaret ved -30 ° C og optøet ved stuetemperatur før forberedelse til LC-MS-analyse. Til analyse under anvendelse HILIC betingelser blev 200 pi urin grundigt blandet med 800 pi acetonitril, efterfulgt af centrifugering ved 3000 omdrejninger i minuttet (RPM) i 5 minutter; 800 pi supernatant blev derefter overført til en LC hætteglas. For RP betingelser 200 pi urin blev fortyndet med 800 pi vand i en LC hætteglas. Den samleprøve blev udarbejdet ved at samle 100 ul urin fra hver prøve, som derefter blev behandlet som ovenfor.

Måling af kreatinin og osmolalitet

50 ul fortyndede prøver og tilberedte kreatinin standardløsninger blev grundigt blandet med 100 pi kreatinin påvisningsreagens (Enzo Life Sciences, UK) i en 96-brønds plade, og absorbansen blev aflæst ved 490 nm ved anvendelse af en Spectra Max M5 fra Molecular Devices. Koncentrationerne af kreatinin i testprøverne blev beregnet ved anvendelse af en 7-punkts kalibreringskurve, hvor hvert punkt blev målt i to eksemplarer. Efter kalibrering med standardopløsninger (Vitech Scientific Ltd., UK), frysepunktssænkning måling for hver prøve blev udført med et osmometer (Advanced Micro, Model 3300) for at bestemme osmolaliteten.

LC-MS datafangst

prøver blev tilfældigt placeret i autosampleren bakken og LC-MS forsøg blev udført på et Accela 600 HPLC-system kombineret med en Exactive (Orbitrap) massespektrometer fra Thermo Fisher Scientific (Bremen, Tyskland). En ZIC-file søjle (150 x 4,6 mm, 5 um) og også en ACE C18-AR-søjle (150 x 4,6 mm, 5 um) (Hichrom, Reading UK) blev ansat til HILIC og RP separationer hhv. De mobile faser, der anvendes i HILIC betingelser var 20 mM ammoniumcarbonat (pH 9,2) og ren ACN Under RP betingelser 0,1% vol /vol myresyre i vand og 0,1% v /v myresyre blev anvendt som mobile faser. De HILIC og RP LC Elueringsgradienten profiler og parameterindstillinger MS blev beskrevet i vores tidligere undersøgelse [25]. Den selektive MS

2 fragmentering af potentielle biomarkører blev udført ved hjælp af Collision dissociation (CID) ved 35 V og med en Surveyor HPLC-system kombineret med en LTQ-Orbitrap massespektrometer fra Thermo Fisher Scientific (Bremen, Tyskland).

LC-MS databehandling af MZMine 2.10 [32]

Den rå data blev opdelt i en enkelt ESI positiv og negativ datasæt, og også konverteret til mzML format ved hjælp ProteoWizard. Proceduren og indstillingerne for hvert trin anvendes i MZMine 2.10 er beskrevet i File S2. Her strategi at anvende data for puljede prøver at bortfiltrere tekniske og uafhængige biologiske variationer fra datasættet blev indført. De fem samleprøver blev forberedt sammen med prøveemner og de blev målt som kvalitetskontrol (QC’er) periodisk gennem hele LC-MS eksperiment. En af dem blev injiceret tre gange, og resten blev injiceret kun én gang, derfor 7 sæt af QC-data blev erhvervet til at vurdere systemets stabilitet og til at generere en repeterbarhed filter. De funktioner, der ikke frembyder i alle 7 QC datasæt blev fjernet, fordi de enten blev forårsaget af variationen af ​​præparatet prøven eller ved LC-MS-system under dataindsamlingen. Baseret på denne filtrerede peak liste blev data for de enkelte prøveemner på linje, og alle funktioner, der ikke passer med den samleprøve peak liste blev fjernet. Funktioner i QC datasættet er inkluderet, hvis de er observeret i 75% af prøverne. Endelig blev de funktioner med en relativ standardafvigelse (RSD) for peak område mindre end 25% inden for de QC’er anvendes til yderligere dataanalyse.

Normalisering

For kreatinin eller osmolalitet normalisering metode, toparealet for hver funktion i en prøve blev skaleret til kreatinin koncentration eller osmolalitet af prøven. For MSTUS metode under hver kombination af LC tilstand og ESI-tilstand, blev peak områder af alle funktioner, som forblev gennem de tre filtre blev opsummerede og derefter erstattet af deres procentdele af den samlede værdi.

Multivariat /statistisk analyse

SIMCA-P 13 (Umetrics, Sverige) blev anvendt til at udføre alle MVA. Forud for PCA og OPLS-DA, dataene var middelværdi-centrerede og enhed varians (UV) skaleret. Pareto skalering blev også prøvet, men de modeller, der genereres var domineret af et par funktioner med store normaliserede værdier (fx creatinin og dimer af urinstof). Således betragtning af, at alle funktioner i at søge efter biomarkører er biologisk lige og at det meste af støjen blev fjernet ved filtrene, blev UV skalering anvendes. P-værdier blev beregnet ved de to hale Student

t

test (Microsoft Office 2010). ROC testen blev udført af IBM SPSS Statistics 21.

Resultater og Diskussion

LC-HRMS metode evaluering og validering

målrettede metabolomiske profilering baseret på to ortogonale LC separationsmetoder var udført [33]: en ZIC-file-søjle med en mobil fase pH ved 9,2 til HILIC fremgangsmåde og en ACE C18-AR-søjle med en mobil fase pH på 2,6 til RP-metoden, der er omhandlet i det følgende som “ZIC-file” og ” RP “hhv. For at undersøge komplementariteten af ​​disse to ortogonale LC metoder nogle standard metabolitter blev målt sammen med prøverne under hver LC tilstand. Som vist i vores tidligere undersøgelse alanin og p-alanin kan adskilles under ZIC-file betingelser [25]. Her en klar adskillelse af isomerer sarcosin, som tidligere blev foreslået som prostatakræft markering, alanin og β-alanin blev også opnået under ZIC-file betingelser, men de alle eluerede ved kolonnens dødvolumen under RP betingelser (figur S1 og S2 i File S3). LC-HRMS rådata blev behandlet af MZMine 2,10 som beskrevet i det eksperimentelle afsnit. Tabel 2 viser antallet af funktioner tilbage efter hvert filter og deres procentdele baseret på oprindeligt opdaget funktioner. Den samleprøve gentagelsesnøjagtighed filter fjernet effektivt mere end 75% af de registrerede funktioner, hvoraf de fleste stammer fra LC-HRMS-system støj og baggrundssignaler. Antallet af funktioner blev beskedent faldt gennem 25% mangler filter, som fjernede biologiske forbindelser, som var meget variabel i prøverne. Gennem peak området RSD filter funktioner med store peak område variationer kan fjernes. Sådanne funktioner er generelt på grund af lave MS svar eller dårlige kromatografiske peak former. Ca. 5.200 funktioner i alt overlevede disse tre filtre og blev samlet sammen som en holistisk datasæt for multivariate og statistisk analyse.

Stabiliteten af ​​LC-HRMS system blev verificeret ved at sammenligne de nøjagtige masse (± 3 ppm) og opholdstider (± 0,5 min) af forbindelser, der findes i urinen mod autentiske standarder: 42 og 51 funktioner blev matchet til de standarder under ZIC-file forhold i ESI positive og negative tilstande henholdsvis og 39 og 34 funktioner blev tildelt under RP forhold. Systemet stabilitet blev overvåget med hensyn til variation i retentionstiden, toparealet og masse nøjagtigheden af ​​disse identificerede metabolitter i 7 QC prøverne under hver LC-HRMS tilstand (File S3). Efter MZMine behandling, de fleste standard matchede metabolitter til stede i prøverne viste ekstremt lave RSD til masse nøjagtighed ( 1 ppm) og opholdstid ( 1%). Kun få af dem viste store variationer for topareal ( 25%) på grund af deres lave MS svar; disse blev udelukket af de 25% RSD filter. Efter at have udviklet data filtrering metode disse filtre blev derefter anvendes på dataene fra de 30 patienter og 30 kontrolprøver. De funktioner, der er tilbage efter at anvende filtrene blev derefter videreforarbejdes.

normalisering og multivariat /statistisk analyse

Der er i øjeblikket ingen enighed om normalisering metode (r) i urinen metabolomik studier. Vi anvendte tre uafhængige normaliserings- metoder og de tilsvarende PCA score plots er vist i figur 1. I betragtning af den mangfoldighed i livsstil mellem forsøgspersoner, havde ukontrollerede MVA ikke adskille prøver fra cancerpatienter og kontrolgrupper. Desuden kunne observeres nogen lighed mellem de mønster strukturer, som afspejles af de helt forskellige retninger og afstande (vektorer) baseret på en stikprøve (formet som diamanter) refereres til tre andre prøver (formet som 4-punkts stjerne, 5-punkts stjerne og omvendt trekant) i hvert mønster. Summen af ​​den første og den anden principale komponenter er mindre end 30% for hver model, der afspejler den ringe korrelation mellem variabler (funktioner) i datasættet. Vigtigere er, i alle fire PCA modeller, de 7 QC funktioner (med grønt) er tæt hinanden som en klynge i midten på det mønster, hvilket yderligere bekræfter fremragende systemets stabilitet i hele. Som en overvåget MVA metode, OPLS-DA var i stand til at adskille studiegrupper i henhold til foruddefinerede biologiske kriterier [22], [34]. I denne undersøgelse som den test, der 5 kræft emner, herunder tre på et tidligt tidspunkt (T1N0M0) og 5 kontroller blev taget ud fra hver gruppe .Den OPLS-DA-modeller blev bygget op ved hjælp af de resterende 25 prostatakræft og kontrolprøver som et træningssæt ved hjælp af data normaliseret ved hjælp af de tre forskellige normalisering metoder og un-normaliserede data. Figur 2 viser diskrimination af træningssættet og forudsigelsen af ​​testen sæt opnås ved at anvende OPLC-DA til un-normaliseret data og standardiserede data ved hjælp af tre forskellige metoder. Meget klare adskillelser mellem to grupper blev opnået for uddannelsen sat i modellerne genereret med data efter normalisering til kreatinin og MSTUS. Kun én kræft og en kontrolprøve krydsede over skillelinien i modellen genereret med osmolalitet fremgangsmåde og rådata. Værdien af ​​R2Y (cum), hvilket forklarer den diskriminerende magt OPLS-DA-model, er mere end 0,9 med kreatinin og MSTUS normalisering og 0,8 med osmolalitet normalisering, men mindre end 0,7 med un-normaliserede data. Værdien af ​​Q2Y (cum), der beregnes ved 7-mappe krydsvalidering og i stand til at angive den prædiktive effekt af modellen, er ca. 0,3 for alle de metoder. Selv om denne værdi ikke er så høj som forventet ( 0,5) alle prøver i den test, der var korrekt forudsagt for alle tre normalisering metoder undtagen én i MSTUS baseret model. Det er interessant at bemærke, at i modsætning til PCA modeller de OPLS-DA modeller med forskellige normaliseringsfaktorer viser lignende mønster strukturer og dette endog tilfældet med ikke-normaliserede data. Vektorerne fra den samme prøve til tre andre er ret ens i hver OPLS-DA-model (figur 2). Baseret på ovenstående observationer ser det ud til, at normaliseringen strategi i høj grad påvirker resultatet af den ukontrollerede MVA, men ikke den superviserede. Men ved at fjerne afvigelsen af ​​metabolit koncentration indført ved variation urin volumen, normalisering forbedrer ydeevnen af ​​overvåget MVA,. Værdien af ​​Variable betydning for Projection (VIP) angiver impact factor af den variable til modellen. Generelt en variabel anses vigtige for modellen, hvis dens VIP værdi 1. Samlet 406 unikke funktioner med VIP-værdier 2 blev udvalgt fra alle tre OPLS-DA-modeller. Det blev konstateret, at 76 var almindelige i alle tre modeller, 89 var i to modeller og 241 var fra kun en model (Figur S1 i File S4). Disse fælles træk i tre modeller viste de højeste gennemsnitlige VIP værdier i forhold til dem fælles i to eller kun i én model, og de omfattede 80% af top 10 funktioner i VIP værdi fra hver model og de resterende 20% kunne findes i gruppe, som var almindelige i to modeller. Som anbefalet af Warrack

et al

[27], for at sikre pålideligheden af ​​de biomarkører vi fokuseret på VIP funktioner, som var almindelige i tre normalisering metoder. Denne gruppe omfattede mange funktioner, som viste de samme m /z-værdier under forskellige LC betingelser eller blev påvist i både positive og negative ion tilstande med samme retentionstid. Denne observation tyder på, at disse funktioner kan tildeles enkelte metabolitter, som ville gøre dem mere pålidelige som ægte biomarkører. Uparret Student

t

og ROC tests blev udført for disse funktioner på tværs af alle prøver og de beregnede p-værdier og arealet under kurven (AUC) opnået ved ROC er vist i tabel S1 i File S4. Som forventet dem alle viste høj AUC ( 0,63) og lave P-værdier ( 0,05) og deres forhold mellem kræft og kontrolprøver er også meget ens hinanden under forskellige LC-HRMS betingelser med forskellige normalisering metoder, som understøtter pålideligheden af ​​resultaterne. Nogle andre funktioner kan også betragtes som potentielle biomarkører på grund af betydelige statistiske resultater, selv om de kun var til stede i en enkelt LC-HRMS tilstand. Den diskriminerende evne sarcosin for prostatakræft blev også evalueret (tabel S1 i File S3); i tråd med flere tidligere rapporter, fandt vi ingen signifikant forskel i sarcosin niveauet mellem kræft og kontrolgrupper [6], [8] -. [10], [12], [15]

Cancer emner er mærket med rødt, styrer i blåt og QC’er i grønt. Vektoren fra diamant til 5-punkts stjerne er mærket i sort, til 4-punkts stjerne i grøn og omvendt trekant i lilla. (A-C) Normalisering til kreatinin, MSTUS og osmolalitet hhv. (D) rå data uden normalisering.

Kræft fag er formet som kvadrater og kontroller som cirkler. Uddannelsen sæt er mærket i fyldt røde og den test, der i udhulet blå. De fire udvalgte emner og vektorerne er samme formet og farvet som figur 1.

Identifikation af en potentiel biomarkør panel

Alle funktionerne anvendes i MVA blev ransaget af nøjagtige masse med en 3 ppm tolerance vindue mod en in-house metabolitten bibliotek [25]. 1673 og 1159 funktioner blev formodet identificeret som metabolitter eller relaterede signaler under ZIC-file og RP betingelser hhv. resulterer identifikation i Excel-format kan downloades fra vores hjemmeside: https://www.metabolomics.strath.ac.uk og folk, der ønsker at indsende aksjer rådata velkommen til at kontakte os. De biomarkører i File S4 lykkedes tildelt ægte metabolitter, men nogle af dem med flere isomerer. For at afslutte identiteten af ​​de biomarkører en MS

2 forsøg blev udført. En funktion i tabel S1 i File S4 (145,062 m /z i ESI negativ og 147,076 m /z i ESI positiv mode) blev tildelt formel C

5H

10N

2O

3 med masse error mindre end 1 ppm. Tre isomerer kan tildeles denne formel i HMDB. Disse er glutamin, ureido isosmørsyre og alanylglycine. Som det kan ses i figur 3A det interessant funktion refererer til Peak B i de udtrukne ionchromatogrammer. Af MS

2 analyse Peaks A og C udviste den samme fragmentering mønster, som kan forklares som vist i figur 3B og blev identificeret som glutamin ved sammenligning med en standard MS /MS-spektrum i HMDB. Peak B viste en helt anden fragmentering mønster og svarer til ureido isosmørsyre fra fortolkningen af ​​MS

2 spektre. Ingen standard MS /MS-spektret blev fundet i en hvilken som helst offentlig database. Den fragmentering synes at være styret af ureidogruppe i molekylet (figur 3B). Fraværet af en fri amingruppe reducerer polariteten af ​​molekylet, hvilket forklarer den modsatte eluering for at den for glutamin under de to ortogonale LC betingelserne (figur 3A). Endelig ved at kontrollere de rå data Peak A blev identificeret som værende på grund af en in-source fragment af alfa-N-phenylacetyl-L-glutamin, som er en meget rigelige komponent i human urin. Alanylglycine kunne svare til den lille spids før og efter Peak B under ZIC-file og RP betingelser hhv. Men dens signal på MS niveau 1 var for svag til at opnå pålidelige MS

2 fragmentering. De endelige potentielle biomarkører og deres identitet, herunder MS

2 fragmentering data, er vist i File S5. Flere potentielle biomarkører blev identificeret under ZIC-file betingelser end under RP betingelser. Det var interessant at bemærke, at der var nogle biomarkører identificeret fra mad, f.eks stachydrine og 3-hydroxystachydrine. Deres pålidelighed /autenticitet som biomarkører var naturligt mistænkt.

Ekstraherede ionchromatogrammer under 4 forskellige LC-HRMS betingelser (A) og fortolkningen af ​​deres MS

2 fragmenteringer (B).

fra vores litteraturgennemgang for kræftdiagnose af metabolomics ingen undersøgelser har vurderet diskriminerende evne foreslåede biomarkører i et enkelt papir ved at teste prøver indsamlet helt uafhængigt af den oprindelige undersøgelse. Vi udførte analyser på urinprøver opnået fra 30 patienter yderligere prostatacancer og sammenlignede data mod kontrolprøverne analyserede tidligere. På grundlag af den optimale metode identificeret over disse 60 prøver blev sammenlignet kun under ZIC-file forhold og dataene blev normaliseret mod kreatinin koncentration. I sammenligningen mellem kontrollerne og de uafhængigt indsamlede prostatakræft prøver 14 ud af 33 biomarkører lå under grænsen på 0,05 P-værdi inklusive ureido isosmørsyre som havde næsten identiske statistiske resultater i både ES1 positive og negative tilstande (tabel 3). Nogle af de fødevarer metabolitter viste ikke signifikant forskel mellem kræft og sunde grupper. Fire ud af 14 validerede biomarkører blev identificeret med tillid som ureido isosmørsyre, indolylacryloyglycine, acetylvanilalinine og 2-oxoglutarat som alle er ikke blevet rapporteret i den foregående metabolit profilering undersøgelser for prostatakræft.

Baseret på de samlede 90 individer (60 kræft vs 30 kontroller) den diagnostiske strøm til prostatacancer blev evalueret af en ROC-test for hver af dem såvel som for deres kombinerede effekt. Den maksimale område var UV skaleret og hvis niveauet for biomarkør var højere i kræft gruppen end i raske gruppe, ville det blive behandlet som en positiv indflydelse og lavere som negativ indflydelse. Den genererede AUC værdi for de kombinerede biomarkører var 0,896 og sensitivitet og specificitet blev også forbedret til den bedste cut-off punkt i forhold til andre enlige biomarkører (Figur 4. Den diagnostiske effektivitet kunne forbedres yderligere ved at inkludere flere enlige biomarkører, men på grund af deres formodede identifikation blev de ikke medtaget i kombination. Samlet set brugen af ​​den kombinerede biomarkør panel kan sammenlignes med brugen af ​​PSA-test (AUC på 0,94). med fremtidig raffinement, et sådant panel kan være af klinisk anvendelse enten alene eller i kombination med selve PSA. på grund af begrænsningen af ​​antallet af emner målt i denne undersøgelse, og usikkerheden på betydningen af ​​et par væsentlige biomarkører udvalgt fra over tusind funktioner, yderligere validering af panelet og de særlige biomarkører vil blive udført med flere fag og dataene vil være offentligt tilgængelige på vores hjemmeside:. https://www.metabolomics.strath.ac.uk

de fire identificerede biomarkører er ikke forbundet på en indlysende måde selvom individuelt de har nogle interessant biokemisk baggrund som biomarkører for andre medicinske tilstande. Ureidoisobutyric syre (UIBA) er veletableret som en urin markør af en medfødt fejl metabolisme grundet ureidopropionase mangel hvor dens niveauer er forhøjede [35]. I det foreliggende tilfælde dets niveauer er lavere hos forsøgspersoner med prostatacancer. UIBA er en metabolit af DNA basen thymidin. UIBA er også en DNA nedbrydningsprodukt afledt fra oxidativ beskadigelse af thymidin og sådanne beskadigede baser fjernes fra DNA ved reparation enzymet DNA glycosylase [36] – [38]. Manglende fjerne sådanne rester kan resultere i mutationer, der dannes under replikation på grund af forkert baseparring med den skadede lokalitet. Lavere niveauer af UIBA kan pege på nedsatte excision reparation.

Indoylacroylglycine (IAG) er blevet foreslået som en markør for autisme hos børn. Dens oprindelse er uklar, selv om det er blevet foreslået, at den er fremstillet ved metabolisk omdannelse af tryptophan ved gut mikroflora. Det er imidlertid blevet fastslået, at dets niveauer svinger i human urin efter årstiden og højere niveauer kan vedrøre øget eksponering for UV-lys. I denne forbindelse er det analog med urocansyre som fremstilles af histidin som respons på UV stråling [39].

N-acetylvanilalinine (AVA) er blevet overvåget i urin til påvisning af en sjælden medfødt fejl metabolisme på grund af aromatisk aminosyre decarboxylase (AAD) mangel [40]. I gruppen af ​​biomarkører præsenteret i tabel 3 er der en uidentificeret markør (268,083 m /z, negativ modus), der ligesom AVA er stærkt forhøjet hos patienter med prostatacancer. Denne markør adskiller sig elementært sammensætning med ét iltatom fra AVA tyder det måske være hydroxyleret AVA.

Konklusioner

Den aktuelle undersøgelse har etableret en simpel robust protokol til screening af urin for biomarkører ved hjælp ortogonale LC metoder i forbindelse med HRMS. En dataudtræk protokol baseret på MZmine blev etableret for at fjerne de tekniske og biologisk ikke-relaterede variationer. Anvendelse af den udviklede metode vi med succes gennemført en indledende undersøgelse af urin metabolomics til diagnosticering af prostatakræft og biomarkør opdagelse. I sammenligning med tidligere undersøgelser langt mere omfattende metabolit profilering blev opnået ved at anvende to ortogonale LC metoder kombineret med HRMS, som gav en større mulighed for at afdække flere potentielle biomarkører.