PLoS ONE: Fænotypisk karakterisering af prostatakræft LNCaP celler dyrket inden for et biologisk fremstillet Microenvironment

Abstrakt

Biofysiske og biokemiske egenskaber af mikromiljø regulere cellulære reaktioner såsom vækst, differentiering, morfogenese og migration i normale og kræftceller. Siden todimensionale (2D) kulturer mangler de væsentlige karakteristika ved den indfødte cellulære mikromiljø, har tre-dimensionelle (3D) kulturer er udviklet til bedre efterligne den naturlige ekstracellulære matrix. Til dato har 3D dyrkningssystemer påberåbt meste på collagen og Matrigel ™ hydrogeler, der kun levner begrænset kontrol over matrix stivhed, proteolytisk nedbrydelighed, og liganddensitet. I modsætning hertil bioengineered hydrogeler tillade os at selvstændigt tune og systematisk undersøge indflydelsen af ​​disse parametre på cellevækst og differentiering. I denne undersøgelse polyethylenglycol (PEG) hydrogeler, funktionaliseret med arginin-glycin-asparaginsyre (RGD) motiver, fælles cellebindende motiver i ekstracellulære matrixproteiner, og matrixmetalloproteinase (MMP) spaltningssteder, blev karakteriseret med hensyn til deres stivhed, diffusive egenskaber og evne til at understøtte væksten af ​​androgenafhængige LNCaP-prostatacancerceller. Vi fandt, at de mekaniske egenskaber moduleres vækstkinetikken af ​​LNCaP-celler i PEG-hydrogel. Ved kultur perioder på 28 dage, LNCaP-celler undergik morfogene ændringer, danner tumor-lignende strukturer i 3D kultur, med hypoksisk og apoptotiske kerner. Vi yderligere i forhold protein- og gen-ekspressionsniveauer mellem 3D og 2D kulturer efter stimulering med det syntetiske androgen R1881. Interessant, kinetikken for R1881 stimulerede androgen receptor (AR) nuklear translokation afveg mellem 2D- og 3D-kulturer, når observeres ved immunfluorescensfarvning. Desuden afslørede microarray undersøgelser, at ændringer i ekspressionsniveauer af androgen responsive gener upon R1881 behandling adskilte sig meget mellem 2D- og 3D-kulturer. Tilsammen dyrkning LNCaP-celler i de afstemmelige PEG-hydrogeler afslører forskelle i de cellulære reaktioner på androgen stimulation mellem 2D- og 3D-miljøer. Derfor foreslår vi, at den præsenterede 3D kultur-systemet er et effektivt redskab til high throughput prostatakræft test af lægemidler, der rekapitulerer tumor mikromiljø

Henvisning:. Sieh S, Taubenberger AV, Rizzi SC, Sadowski M, Lehman ML, Rockstroh A, et al. (2012) fænotypisk karakterisering af prostatakræft LNCaP celler dyrket i en biologisk fremstillet mikromiljø. PLoS ONE 7 (9): e40217. doi: 10,1371 /journal.pone.0040217

Redaktør: Elizabeth Wilson, University of North Carolina i Chapel Hill, USA

Modtaget: November 17, 2011; Accepteret: 6 juni 2012; Udgivet: September 5, 2012 |

Copyright: © Sieh et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Queensland University of Technology opstart tilskud til stol Prof. DW Hutmacher, Prostata Cancer Foundation of Australia, Australian canadiske Prostata Cancer Research Alliance, Australian prostatakræft Research Centre-Queensland og NHMRC tilskud. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (CaP) er en af ​​de mest udbredte maligne sygdomme blandt mænd i de vestlige lande. Den 5-årige overlevelsesrate for mænd diagnosticeret med lokaliseret CaP nærmer sig 100%; henviser til, at prognosen forværres hurtigt på CaP progression til fremskreden og metastatisk sygdom [1] – [2]. Trods avancement i påvisningsmetoder og behandlinger, CaP fortsat en væsentlig årsag til kræft død hos mænd. Derfor er det vigtigt at få en større forståelse af progression fra lokaliseret til avanceret CaP brug af relevante fysiologiske systemer. Ligesom mange andre kræftceller, har CaP celler blevet grundigt undersøgt i to dimensionelle (2D) kulturer, hvorigennem en betydelig grundlæggende forståelse af cancer biologi er blevet opnået. Men i native væv, celler indlejret i ekstracellulær matrix (ECM), der sørger ikke kun arkitektonisk støtte, men også kemiske og mekaniske signaler til celler [3] – [4]. For nylig, vigtigheden af ​​de mekaniske egenskaber af tumormikromiljøet er blevet mere og mere anerkendt. Generelt cancervævet og dens stroma er stivere end ikke maligne væv som følge af abnorm aflejring og remodellering af ECM’en i stroma [5] – [7].

In vitro Salg undersøgelser og få

in vivo Salg undersøgelser har vist, at stivheden af ​​den omgivende matrix kan øge cancercellevækst, modulere cellesignalering og lette celleinvasion [8] – [11]. I betragtning af den afgørende rolle, matrix stivhed, kunstige geometriske begrænsninger og den høje stivhed pålagt celler på 2D vævskultur plast kan påvirke tumorvækst, vedhæftning, cellepolaritet, morfologi, migration og proteolyse mekanismer [12] -. [15]

i de senere år har talrige undersøgelser vist, at studere tumorer i 3D bedre gengiver

in vivo

vækst egenskaber og resistens mod kemoterapeutiske midler end en 2D tilgang [16] – [18]. De mest almindeligt anvendte 3D matrix modeller er animalsk afledt rekonstitueret basalmembran ekstrakt, Matrigel ™ [17], [19] – [20], og rotte hale collagen type I matricer [21] – [24]. Selv om disse naturligt afledte matricer har ECM-lignende biologiske egenskaber, deres iboende egenskaber begrænser fleksibiliteten i at justere matrix stivhed uden samtidig at påvirke andre matrix egenskaber såsom proteolytisk nedbrydelighed og ligand tæthed. Desuden Matrigel ™ viser batch-til-batch variationer, der nedsætter reproducerbarhed af eksperimenter og sammenlignelige datasæt mellem forskellige laboratorier. For at forenkle de ellers komplekse cellulære interaktioner mellem de multiple komponenter, som forekommer i naturligt afledte matricer, er der en voksende interesse i anvendelse af matricer manipuleret med særlige biologiske og biokemiske træk ved naturlig ECM [25] – [28]. Disse biomimetiske matricer tillade en mere systematisk undersøgelse af virkningen af ​​visse komponenter eller egenskaber tumor mikromiljø på kræftceller. Derfor har nye tilgange i biomateriale videnskab fokuseret på udviklingen af ​​syntetiske matricer, såsom hyaluronon-afledt eller alginat matricer til dyrkning cancerceller [25] – [28]. Et andet eksempel er PEG-baserede hydrogeler, der er inerte sig med hensyn til at udløse celle signalveje, men kan udstyres med biokemiske (fx proteolytisk nedbrydning sites) og biologiske funktionaliteter (fx RGD motiver i en kontrolleret måde) [29]. Fordelagtigt kan stivheden af ​​sådanne hydrogeler nøjagtigt indstillede, uafhængigt af deres proteolytiske følsomhed og celle liganddensitet.

Tidligere har vi og andre brugte MMP-følsomme PEG-baserede hydrogeler, hvori RGD motiver er inkorporeret ved en defineret tæthed [13], [30] – [32]. RGD motiver tilvejebringe bindingssteder for celler via integriner, og MMP spaltningssekvenser tillader celler at nedbryde matricen, som skaber plads til celleproliferation og migration. Til dette formål har en grundig fænotypisk karakterisering af Cap celler dyrket inden for denne biomimetisk ECM ikke blevet rapporteret. I denne undersøgelse var det et mål at etablere og validere et 3D dyrkningssystem for LNCaP-celler, der tillader modellering af den tidlige fase avaskulære tumordannelse. For at gøre dette, undersøgte vi effekten af ​​hydrogel stivhed på cellevækst. Derefter undersøgte vi morfologi, genekspression og proteinsyntese af LNCaP-celler dyrket i 3D hydrogeler sammenlignet med konventionelle 2D kulturer. Vi anvendte også denne 3D kultursystem at undersøge virkningerne af det syntetiske androgen, R1881, på AR signalering i forhold til 2D kulturer [33] – [34]

Vores resultater giver indsigt i den rolle, mikromiljøet. ved modulering af cellulære og molekylære adfærd af kræftceller. Desuden afslører vi forskelle i cellulære reaktioner på androgener mellem 2D- og 3D-kulturer. Denne model er et springbræt for udviklingen af ​​3D-dyrkningssystemer replikere

in vivo

tumor mikromiljø, der giver mulighed for etablering af effektive værktøjer til bedre at forstå CaP biologi, især som reaktion på androgener.

Resultater

Mekaniske og diffusive egenskaber biomimetiske hydrogeler er afhængige af indholdet PEG

for at efterligne den tidlige fase af CaP tumor dannelse i 3D, vi satte os for at kultur LNCaP celler i biomimetiske PEG hydrogeler. PEG prækursorer konjugeret med MMP spaltningssteder og RGD motiver blev inkorporeret i hydrogel netværket til at give væsentlige biomimetiske træk ved den naturlige ECM (figur 1A). Eftersom mekaniske egenskaber af hydrogelen er kendt for at påvirke vækst, morfologi og invasiv fænotype af cancerceller [5], [10], [35], vi først sigter mod at optimere hydrogel stivhed til celledyrkning. Cellefri PEG-hydrogeler med varierende stivhed blev fremstillet ved at justere PEG-indhold til 1,5, 2, 2,5% (vægt /volumen). Stivheden af ​​hydrogelen blev bestemt ved unconfined kompression afprøves med en microtester (figur 1B, venstre) og atomic force mikroskopi (AFM) indrykning målinger (figur 1C, venstre), der blev omdannet til en stress-strain kurve (figur 1B, midten) .

(A) En skematisk viser fremstilling af biomimetiske hydrogeler. LNCaP-celler blev blandet med PEG forstadier indeholdende MMP spaltningssteder og RGD-peptider forud for FXIII-katalyseret polymerisation. (B) Global stivhed cellefrie hydrogeler med forskellig PEG-indhold (vægt /volumen) blev målt ved anvendelse af en microtester. Et repræsentativt stress-strain kurve konstateret for et 2% PEG gel. Den (elastiske) Youngs modul, E, blev beregnet ud fra hældningen af ​​linien monteret på stress-strain kurve ved 9-12% belastning (i midten). En Scatter plot, der viser den Youngs moduli målt for forskellige PEG-hydrogeler (højre). Medianer er angivet med de røde bjælker. (C) Lokalt stivhed cellefrie hydrogeler med forskellige PEG-indhold (vægt /volumen) blev målt ved anvendelse atomic force mikroskopi (AFM). En pyramideformet AFM cantilever blev anvendt til at udføre indrykning målinger. En repræsentativ kraft versus tip-prøve-adskillelse kurve er vist nedenfor AFM skematisk. Den røde linje repræsenterer fit bruges til at tilnærme tilgang kurve med en Hertz indrykning model. Youngs moduli målt for en 2% PEG-hydrogel er normalfordelt i området fra 4 kPa (midten). Scatter plot viser de median Youngs moduli målt for forskellige hydrogeler (højre). Røde søjler repræsenterer medianerne. Både microtester og AFM indrykning målinger giver lignende Youngs moduli og viser en lineær stigning i stivhed med PEG-indhold. (D) Kassegrafer viser diffusionskoefficienter, D målt for fødevarer farvestof E133 (794 Da) og FITC-BSA (66 kDa) i cellefrie hydrogeler ved forskellige PEG-indhold. Værdier af D for E133 er en størrelsesorden større end for FITC-BSA. Mindst tre prøver blev målt fra tre uafhængige forsøg.

Mens microtestor sonder de globale elastiske egenskaber af de PEG-hydrogeler, AFM indrykning målinger gav oplysninger om deres lokale stivhed distribution (figur 1C). Begge metoder afslørede en lineær forøgelse i elasticitetsmoduler med forøgelse af PEG-indhold og angivet lignende elasticitetsmoduler på mellem ca. 0,8 kiloPascal (kPa) til 10 kPa under 1,5% og 2,5% PEG-hydrogeler, henholdsvis (figur 1B og 1C, højre) . AFM målinger afslørede en homogen fordeling af lokal Youngs modulus, E over probet hydrogeler (figur 1C, midten). Når de 2,0% hydrogeler blev testet under anvendelse af microtester før og efter mere end 4 ugers dyrkning, fandt vi ingen væsentlige ændringer i den overordnede matrix stivhed (2,5-4,2 kPa), hvilket var i overensstemmelse med variationen i de testede 2% hydrogeler ( Figur S1). Som tidligere rapporteret i 3D cellekulturer inden lignende matricer [5], [10], [35], betyder det, at disse biomimetiske PEG-baserede hydrogel kun er lokalt nedbrydes af de indlejrede celler, mens den samlede stivhed ikke påvirkes i den analyserede vækstperioden.

Ændringer i PEG-indhold forventes at ændre porestørrelsen af ​​PEG-hydrogeler [36], som kan påvirke overførslen af ​​små molekyler, såsom syntetisk androgen R1881, og også vækstfaktorer til stede i medium i vores eksperimenter. Til estimering af diffusion af R1881, målte vi diffusionskoefficienten D, af fødevaren farvestof E133 (792 Da), som har en højere molekylvægt end R1881 (284 Da). Vi fandt, at de medianværdier for diffusion faldt med stigende PEG-indhold (Figur 1D) fra 2,99 ± 0,06 × 10

-6 cm

2 /s for 1,5% PEG-hydrogeler til 1,9 ± 0,13 × 10

– 6 cm

2 /s for 2,5% PEG hydrogeler. For at teste hvis vigtige vækstfaktorer, såsom fibroblast-vækstfaktor, vaskulær endotelvækstfaktor og blodplade-afledt vækstfaktor (20-50 kilodalton, kDa) kan også trænge ind i hydrogelen, undersøgte vi diffusionen fluoresceinisothiocyanat-konjugeret bovint serumalbumin (FITC -BSA) (66 kDa), som har en højere molekylvægt end disse vækstfaktorer. Diffusionskoefficient FITC-BSA blev lavere sammenlignet med E133 og faldt med stigende PEG-indhold (figur 1D). U-værdier for 1,5-2,5% PEG hydrogeler (1,5-3,0 × 10

-7 cm

2 /s) er inden for samme størrelsesorden (6 × 10

-7 cm

2 /s) rapporteret af Ramanujan

et al Hotel (2002) og Erikson

et al

(2008) måling diffusion af BSA i de blødere kollagengeler [37] -.. [38]. Når PEG-hydrogeler blev inkuberet med FITC-BSA i 24 timer, observerede vi udstrakte udbredelse af FITC-BSA (fig S2). Fra disse resultater kan vi konkludere, at selv om overførsel af R1881 og vækstfaktorer kan bremses i geler med højere PEG-indhold, porestørrelse alle geler er tilstrækkelig stor til at give indlejrede celler med opløselige faktorer fra dyrkningsmediet.

proliferation af LNCaP-celler i biomimetiske hydrogeler er påvirket af PEG-indhold og stivhed af hydrogeler Salg

Dernæst at vurdere virkningen af ​​matrix stivhed på celleproliferation, dyrkede vi LNCaP-celler i 1,5, 2,0 og 2,5% hydrogeler over 28 dage (figur 2A, top panel, til højre). Monolagskulturer (fordoblingstid, Td = 27 timer) voksede eksponentielt op til dag 5 og begyndte at plateau derefter (figur 2A, øverste panel, til venstre). Tværtimod celler prolifererede langsommere i 1,5% (Td = 54 timer) og 2% (Td = 58,5 timer) PEG-hydrogeler. Eksponentiel vækst fandt sted mellem dag 7 og 14 i 3D kulturer (figur 2A, øverste panel, højre). LNCaP-celler fortsatte med at proliferere mindst op til 28 dage i de 2,0% hydrogeler, mens der gælder celleantal opnåedes efter 14 dage i de 1,5% hydrogeler. De højere vækstrater i blødere 1,5% hydrogel forhold til 2,0% hydrogel kan skyldes den lavere spænding, der udøves på cellerne af det omgivende blødere hydrogel [39] – [40]. Den S-formet vækstkurve vi observerer er sammenlignelig med den observerede vækst i LNCaP xenografter med tegn på langsomt voksende på det tidlige stadium, eksponentiel vækst i den mellemliggende fase og bremse væksten på det senere tidspunkt [41] – [46]. På den anden side blev der ikke fundet væksten i 2,5% hydrogeler som bekræftet af de levende døde farvning (figur 2A, bundpanel) afslører tilstedeværelsen af ​​overvejende ikke-levedygtige celler i 2,5% hydrogel på dag 24. Bright felt billeder viste, at celler var i stand til at danne kolonier i 1,5 og 2,0%, men ikke i 2,5% hydrogeler.

(A) Vækstkurver for LNCaP-celler over 7 dage for 2D-kulturer (venstre) og 28 dage til 3D-kulturer ( højre) i normale vækstmedier målt ved total DNA indhold (gennemsnit ± SE). I 2D kulturer celler formere meget hurtigere nå konfluens indenfor 7 dage (øverste panel, til venstre). Vækstprofilen af ​​celler er afhængig af de mekaniske egenskaber af de gensplejsede PEG matricer, hvor væksten er højest i 1,5% efterfulgt af celler dyrket i 2% hydrogeler (øverste panel, højre). Nr celleproliferation er påvist i de stivere hydrogeler (2,5%). Levende døde undersøgelse blev udført ved anvendelse fluoresceindiacetat-propidiumiodidfarvning på dag 24 i LNCaP-celler dyrket i forskellige PEG-indhold (nederste panel). Den levende døde farvning afslører, at de fleste celler er levedygtige (grøn) i både 1,5 og 2,0% hydrogeler men ikke levedygtigt (rød) i 2,5% hydrogeler. Billeder blev taget med CLSM (10 ×, 0,4 NA). Bright felt billeder bekræfter også, at celler i 2,5% hydrogeler ikke danne kolonier som observeret i 1,5% og 2,0% hydrogeler på dag 28. (B) (øverste panel) en repræsentant CLSM 3D fremskrivninger af LNCaP kolonier mærket med Phalloidin (actin, rød ) /DAPI (kerner, blå) fra dag 7 til dag 28 (20 ×, 1,0 NA). Kolonier er mere afrundet på dag 7 og dag 14, men bliver uregelmæssige aggregater fra dag 21 og frem. Box plots af koloni størrelse og form faktor analyseret fra seks CLSM billeder (nederste panel) viser betydelig stigning i sfæroid størrelse og fald i formfaktoren (p 0,001) på dag 28 i forhold til dag detekteres 7 kulturer. (C) Et repræsentativt histologi sektion af dag 28 kulturer afslører dannelsen af ​​invasive Fingre «(pil) gennemtrænger omgivende hydrogel (venstre). H endvidere er AR signalvejen spiller en vigtig rolle i tumorudvikling og er vigtige i hele progression [56] – [57]. Af denne grund er androgenafhængige LNCaP-celler er meget udbredt i 2D kulturer til undersøgelse af androgen receptor (AR) signalering, som aktiveres ved androgener og analoger, såsom R1881. For at udvide vores viden om LNCaP reaktion på R1881 i 2D kultur baserede eksperimenter undersøgte vi effekten af ​​R1881 på CaP markør til udtryk i 3D kulturer (Figur 4). Immunfluorescensfarvning viste translokation af AR i cellekernen i både 2D og 3D-kulturer efter 7 timer af 1 nM R1881 behandling (figur 4A). Det er velkendt i 2D kultur, der engang AR binder til R1881, transporteres det til kernen, hvor det initierer transskription af målgener, såsom prostataspecifikt antigen /Kallikrein 3 (PSA) [58]. Vores foreløbige undersøgelse viste, at AR target gener, såsom PSA, blev induceret på højere niveauer efter forlænget R1881 behandling (efter 36 timer) i både 2D og 3D kulturer (Figur S5A). Derfor valgte vi til denne undersøgelse en 48 h R1881 behandling for begge kulturer. Interessant nok 2D- og 3D-kulturer reagerede på 48 timer R1881 behandling, som vist ved en stigning i mRNA og protein niveauer af PSA, lokalisering af AR i cellekerne blev påvist i mindre grad i 3D-kulturer sammenlignet med 2D kulturer. Imidlertid blev hverken lokalisering eller intensiteten af ​​den luminale epitel markør, Cytokeratin 8 (Ck8) påvirket af R1881 behandling i 2D eller 3D kulturer.

(A) Immunofluorescerende farvninger af LNCaP celler efter 7 timer behandling med R1881 show co -localization af AR og cellekernen i både 2D (dag 6) og 3D (dag 28) kulturer (øverste panel). Tilsvarende AR lokalisering i begge kulturer er vist i gråtonebilleder (nederste panel). (B) De cellefænotyper af 2D (dag 6, venstre felt) og 3D (dag 28, højre panel) kulturer dyrket i androgen forarmet medier eller R1881 suppleret medie (48 h) blev sammenlignet ved immunfluorescerende farvninger. Proteiner af interesse er i grønt, actin i rødt og kerne i blåt. I 2D kulturer, er AR lokaliseret i kernen og PSA i cytoplasmaet upon R1881 stimulering. Uden behandling, AR forbliver i cytoplasmaet og PSA ikke påvises. Den luminale epitel markering, er Ck8 påvist i begge kulturer uanset behandling tilstand. I 2D kulturer, Ck8 klart pletter de endeløse fibre, mens i 3D, er Ck8 lokaliseret på cellens grænse. I 3D-kulturer, er ekstranukleære AR lokalisering observeret i både ikke behandlede og R1881 behandlet multicellulære aggregater. PSA produceres også rigeligt i R1881 behandlede 3D kulturer, men kun på et meget lavt niveau, når den ikke behandles. Forstørrede områder af hver specifik farvning og dyrkningsbetingelser (hvide bokse) er vist nedenfor de tilsvarende billeder. CLSM billeder blev taget ved 60 x forstørrelse (1,4 NA) for A og 40 x forstørrelse (1,25 NA) for B. skalapanelerne:. (A) 30 um, (B) 75 um og 25 um (forstørrede regioner)

for at undersøge effekten af ​​R1881 på niveauer af proteiner, vi fokuseret på ekspression af AR, PSA og Ck8 ved at udføre Western blot-analyse. Efter R1881 behandling blev PSA og Ck8 niveauer styrkes i 2D og 3D kulturer i forhold til ikke-behandlede ethanol kontrol, selv om forhøjelse af Ck8 protein ved R1881 ikke var tilsyneladende i immunfluorescensfarvning i 2D og 3D kulturer, som kan tilskrives en manglende følsomhed (af antistoffet anvendt) (figur 5A, B). Interessant i behandlede 2D kulturer blev AR proteinniveauer forhøjet sammenlignet med ikke-behandlede kontroller, der indikerer stabilisering af ligand bundet AR og /eller en stigning i AR produktion [59] – [60]. I modsætning hertil blev der påvist væsentlige ændringer i 3D kulturer. Tilsammen antyder dette en differentieret regulering af AR proteinekspression i 2D og 3D kulturer som reaktion på R1881. Virkningen af ​​R1881 på mRNA-niveauer i 2D og 3D-kulturer blev yderligere undersøgt ved kvantitativ Real Time-polymerasekædereaktion (QRT-PCR). I overensstemmelse med den øgede protein niveauer, PSA og Ck8 mRNA-niveauer steg i begge kulturer (figur 5C). Svarende til western blot analyse blev AR mRNA-niveau ikke signifikant påvirket af R1881 behandling i 3D kulturer, men faktisk viste en faldende tendens, når behandlingen blev forlænget (Figur S5B). Trods højere AR udtryk i 2D kulturer i forhold til 3D-kulturer, PSA udtryk var ens mellem kulturer, som vist i figur 5C. Interessant nok i ikke behandlede kulturer, baseline PSA mRNA-niveauet var signifikant højere i 3D forhold til 2D kulturer. AR og PSA mRNA-niveauer i LNCaP tumorxenoplantater fra intakt Ikke obese diabetiske /svær kombineret ImmunoDefficiency (NOD /SCID) mus (Figur S5C) var sammenlignelig med R1881 stimulerede 3D-kulturer, men ikke de 2D kulturer. Således er vores resultater viser, at vores 3D kulturer bedre afspejler

in vivo

tumorer.

(A) En repræsentant Western blot afslører en øget grad af alle de undersøgte proteiner i 2D kulturer, når de behandles med R1881 sammenligning med den ikke behandlede (ethanol kontroller), mens i 3D-kulturer, kun PSA og Ck8 er signifikant forhøjet. (B) Signal-forhold af proteiner i forhold til a-tubulin fra Western blots af R1881 behandlede og ethanol kontrolgrupper (-R1881) er præsenteret som gennemsnit ± SE. Protein- kvantificeringer understøtter ændringerne vist i immunblots ovenfor. (C) QRT-PCR repræsenterer ekspression af LNCaP cellemarkører (gennemsnit ± SE) hvor PSA og Ck8 er opreguleret på mRNA-niveauet ved behandling i både 2D og 3D-kulturer sammenlignet med ikke behandlede 2D eller 3D-grupper. AR er kun forhøjet i 2D kulturer. Signifikant forskel (p 0,05) mellem behandlede og ikke-behandlede prøver inden lignende grupper (enten 2D eller 3D kulturer) er angivet ved (*) og mellem lignende behandling af forskellige grupper er angivet med (Δ). Tredobbelte prøver blev analyseret fra mindst tre uafhængige forsøg.

androgen respons LNCaP celler i 3D-kulturer er ændret i forhold til 2D kulturer under en R1881 frataget tilstand

På baggrund af ovenstående forskelle i PSA og AR udtryk og AR lokalisering mellem 2D- og 3D LNCaP cellekulturer, vi udførte microarray analyse omfattende vurdering transkriptionelle forskelle mellem 2D og 3D LNCaP cellekulturer under androgen berøvet og R1881 behandlede betingelser, der fokuserer på androgen-responsive gener. Vi fandt differentiel regulering af 4157 (1896 op, 2261 ned) og 3306 (1304 op 2002 ned) androgen-responsive gener i R1881-behandlede 2D og 3D LNCaP cellekultur hhv. Den R1881-behandlede 2D (2D + R1881) og 3D (3D + R1881) kulturer delt 2862 almindeligt regulerede androgen-responsive gener (1165 op- og 1697 nedreguleres gener) sammenlignet med de respektive ethanol kontroller (figur 6A). Interessant nok blev det gange ændring i ekspressionsniveauet af 898 (31%) af disse gener væsentligt reduceret i 3D + R1881 sammenlignet med 2D + R1881. Dette var særlig tydeligt i op-regulerede gener, som vist i scatter plots (fig. 6A), hvilket tyder på en androgen respons i fravær af androgener, når de LNCaP-celler blev dyrket i 3D kultur. Sammenligning af 3D og 2D ethanol kontroller (3D + EtOHvs2D + EtOH) viste, at 1469 androgen-responsive gener differentielt blev udtrykt (figur 6B). Dette tyder stærkt på, at faldet fold ændring af androgen regulerede gener som reaktion på R1881 i 3D kultur i forhold til 2D + R1881 var forårsaget af en kraftig forskydning i basislinjen ekspressionsniveauet af androgenet regulerede gener (Fig. 6B).