PLoS ONE: Telomerase effektivt forlænges Stærkt Transskriberer Telomerer i Human Cancer Cells

abstrakt

RNA-polymerase II transskriberer de fysiske ender af lineære eukaryote kromosomer i en række af lange ikke-kodende RNA-molekyler, herunder telomere repeat-holdige RNA (TERRA). Siden TERRA opdagelse har fremskridt er sket i karakterisering af TERRA biogenese og regulering; tværtimod dens tilhørende funktioner forbliver undvigende. De fleste af de biologiske roller hidtil foreslået for TERRA er faktisk baseret på

in vitro

forsøg udført ved hjælp af korte TERRA-lignende RNA-oligonukleotider. Især er det blevet foreslået at Terra inhiberer telomeraseaktivitet. Vi har udnyttet to alternative cellulære systemer at teste, om TERRA og /eller telomer transkription indflydelse telomerase-medieret telomer forlængelse i humane cancerceller. I celler, der mangler de to DNA methyltransferaser DNMT1 og DNMT3b, er TERRA transskription og steady state-niveauerne stærkt forøget, mens telomerase er i stand til at aflang telomerer normalt. Tilsvarende kan telomerase effektivt aflange transgene inducerbare telomerer hvis transskription er blevet eksperimentelt augmented. Vores data udfordre den nuværende hypotese, at TERRA fungerer som en generel inhibitor af telomerase og antyder, at telomer længde homeostase opretholdes uafhængigt af TERRA og telomer transskription

Henvisning:. Farnung BO, Brun CM, Arora R, Lorenzi LE, Azzalin CM (2012) Telomerase effektivt forlænges Highly omskriver Telomerer i humane cancerceller. PLoS ONE 7 (4): e35714. doi: 10,1371 /journal.pone.0035714

Redaktør: Arthur J. Lustig, Tulane University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Februar 23, 2012; Accepteret: 20 mar 2012; Udgivet: 27 april, 2012 |

Copyright: © 2012 Farnung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af det Europæiske Forskningsråd (BFTERRA), den schweiziske National Science Foundation (3100A0-120090 og PP00P3-123356) og Fondazione Cariplo (2008-2507). CMB modtog et stipendium fra Boehringer Ingelheim Fonds. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

de fysiske ender af lineære eukaryote kromosomer transskriberes til en række ikke-kodende RNA (ncRNA) arter, der udgør den “telomere transkriptom«. Blandt disse arter, den lange ncRNA TERRA (telomere repeat-holdige RNA) blev først opdaget i pattedyrsceller og successivt beskrevet i ikke-pattedyr eukaryoter, herunder zebrafisk,

Arabidopsis thaliana

, den spirende gær

Saccharomyces cerevisiae

og fission gær

Schizosaccharomyces pombe

[1] – [7]. TERRA molekyler transkriberes fra regionerne umiddelbart før telomerer -Den subtelomeres- mod slutningen af ​​kromosomerne primært af den DNA-afhængige RNA-polymerase II (RNAPII), som bruger telomere C-rige streng som en skabelon. Derfor individuelle TERRA molekyler omfatter en subtelomeric tarmkanalen og G-rige telomere gentagelser (5′-UUAGGG-3 ‘i pattedyr). TERRA forbliver forbundet til telomerer post-transkriptionelt antyder, at TERRA er en konstitutiv bestanddel af telomere heterochromatin [1], [3], [4], [6]. Andre RNA-arter transskriberet fra kromosom ender omfatter ARIA, en C-rige telomert RNA hidtil kun identificeret i fission gær og planter, og to komplementære subtelomeric udskrifter blottet for påviselige telomere gentagelser navngivne ARRET, identificeret i spirende og fission gær, og αARRET, identificeret kun i fission gær [1], [4], [5], [7].

Subtelomeric promotorer driver transkription af TERRA er blevet identificeret i humane celler og omfatter CpG-dinukleotid-rige øer sammensat af strækninger af 29 og 37 bp tandemgentagelser (29-37 gentagelser). 29-37 gentagelser der forud tandemgentaget 61 bp enheder, der er undværlige for promotoraktivitet og hidtil ikke-karakteriseret funktion [8], [9]. CpG dinukleotider inden TERRA initiativtagere er stærkt methyleres i forskellige cancer og primære celler [9]. I humane kolorektal carcinom HCT116 celler slået ud for de to DNA methyltransferase enzymer DNMT1 og DNMT3b (DKO celler), TERRA promotor methylering er helt afskaffet, og RNAPII binding til TERRA initiativtagere og Terra steady state-niveauerne er markant forøget [9]. Således samordnede aktivitet af DNMT1 og 3b begrænser TERRA promotor transkriptionel aktivitet, i det mindste i HCT116-celler. Ligeledes faldt subtelomeric CpG methylering er ledsaget af forøgede TERRA cellulære niveauer i celler afledt af humane patienter med immundefekt, centromerregionen ustabilitet, ansigts anomalier (ICF), en recessiv syndrom stammer fra kimcellelinje mutationer i DNMT3b genet [10]. Mærkeligt, er TERRA overflod reduceret i museceller mangelfulde for DNMT1 og DNMT3a /b, selv om den globale methylering af subtelomeres er kompromitteret, hvilket tyder artsspecifikke mekanismer TERRA regulering medieret af DNMTs [6], [11]. Faktisk TERRA promotorer er stadig at blive kendetegnet ved museceller og det er stadig muligt, at murine TERRA initiativtagere ikke er reguleret gennem CpG methylering.

Mens TERRA biogenese og regulering er blevet grundigt undersøgt, mangel på reproducerbare eksperimentelle værktøjer til ændre TERRA cellulære niveauer regnskab for sparsomme kendskab til TERRA-associerede funktioner. De fleste af de formodede roller hidtil tilskrives TERRA blev udledt fra

in vitro

eksperimenter, hvor korte TERRA-lignende RNA-oligonukleotider blev anvendt. Sådan

in vitro Salg forsøg har antydet, at TERRA kunne regulere telomerlængde homeostase, telomer replikation og telomert DNA kondensation [6], [12] – [14]. Især TERRA-lignende oligonukleotider inhiberede kraftigt telomeraseaktivitet i telomer repeat amplifikationsprotokol (TRAP) og telomerase direkte assays [6], [14]. Derfor antages det almindeligvis, at Terra fungerer som en generel inhibitor af telomerase-medieret telomer forlængelse og et par indirekte

in vivo Salg beviser understøtter tilsyneladende denne antagelse. En knopskydende gær telomer kunstigt tvunget til at transskribere undergik afkortning, mens længden af ​​de resterende telomerer var upåvirket [15]. Gær mutanter med kompromitteret Rat1p RNA exonukleaseaktivitet bære større mængder af TERRA molekyler og kortere telomerer i forhold til vildtype modparter [16]. Endelig telomerer er kortere i celler, der er etableret fra ICF patienter end i celler fra raske donorer [10]. Alligevel er det ikke blevet direkte undersøgt, om telomer forkortning observeret i disse forskellige cellulære systemer virkelig stammer fra telomerase inhibering. Således er den faktiske biologiske relevans af evne TERRA-lignende oligonukleotider til at hæmme telomerase-aktivitet

in vitro

stadig skal vurderes.

For at afgøre, om TERRA og telomer transskription påvirker telomerase-aktivitet

in vivo

, har vi udnyttet to alternative menneskelige cellulære systemer, hvor TERRA transskription augmented. Vi viser, at DKO celler inficeret med retrovirus, der udtrykker den katalytiske subunit af telomerase aflange deres telomerer så effektivt som parentale celler med intakte DNMT aktiviteter. Konsekvent, synes telomerase biokemisk aktivitet ikke at blive påvirket i de samme celler. Vi præsenterer også udviklingen af ​​et cellulært system, hvor transkription af unikke ‘transkriptionelt inducerbare telomerer «(Titler) kan styres efter ønske. Transskription induktion af Titler påvirker ikke deres homeostatiske længde, heller ikke forhindre telomerase-medieret re-forlængelse efter afkortning fremkaldt af telomerase-hæmmere. Tilsammen vores resultater udfordrer den almindeligt accepterede opfattelse, at TERRA er en cellulær inhibitor af telomerase og tigge for at udforske alternative funktioner udøvet af TERRA og telomer transskription. Derudover vores resultater indebærer, at telomer afkortning observeret i systemer, hvor TERRA var afvigende forhøjet [10], [15], [16] sandsynligvis stammer fra kompromitteret telomer integritet frem for telomerase hæmning.

Resultater og Diskussion

TERRA steady state niveauer opretholdes uafhængigt af telomer længde i humane cancerceller

Den foreslåede rolle TERRA hæmme telomerase-aktivitet har foreslået en model, hvor lange telomerer ophobes eller producere mere TERRA, hvilket forhindrer telomerase til yderligere at udvide dem [6], [14], [17]. Korrelative beviser ved hjælp af ikke-isogene pattedyrsceller linjer af forskellig oprindelse synes at understøtte denne hypotese [6]. Tværtimod har nyere arbejde i spirende gær vist, at eksperimentelt induceret over-forlængelse eller afkortning af telomerer ændrer ikke TERRA niveauer og RNAPII belægningsprocent på kromosom ender [18]. Vi har derfor sat op til at teste, om der er sammenhæng mellem TERRA niveauer og telomer længde i isogene humane celler med telomerer af forskellige længder.

Vi stabilt inficeret livmoderhalskræft HeLa-celler med retrovirus, der udtrykker den katalytiske subunit af menneskelig telomerase (hTERT ). Som en kontrol, vi inficerede de samme celler med tom vektor (EV) retrovira eller med retrovira, der udtrykker hTERT C-terminalt fusioneret til et influenza hæmagglutinin epitopmærke (hTERT-HA). hTERT-HA viser normal katalytisk aktivitet

in vitro

men formår ikke at forlænge telomerer

in vivo

, sandsynligvis på grund af nedsat rekruttering til telomerer [19]. Stabilt inficerede populationer blev udvalgt og holdt i kultur i adskillige populationsfordoblinger (PDS). Telomer restriktionsfragment (TRF) analyse af genomisk DNA viste, at på det tidspunkt, hvor forsøg blev udført hTERT infektion havde ført til en væsentlig forlængelse af bulk telomerer: TRFs blev omfattet mellem 2 og 5 kb i EV-inficerede celler og mellem 5 og mere end 15 kb i hTERT-inficerede celler (figur 1A). Som forventet, var hTERT-HA-ekspression ikke ændre telomer længde, selv om det blev udtrykt på niveauer svarende til hTERT (Figur 1A og E). Vi fordøjet derefter genomisk DNA med

Msp

I eller med dens CpG methylering følsomme isoschizomer

Hpa

II og hybridiseret det til radioaktivt mærkede prober svarer til de 29-37 gentagelser findes inden TERRA initiativtagere. Overensstemmelse med, hvad vi tidligere har rapporteret [9], fandt vi, at 29-37 gentagelser i vid udstrækning er methyleret i HeLa-celler. Restriktionsmønsteret detekteret med 29-37 gentagne prober blev ikke ændret i hTERT-udtrykkende celler sammenlignet med ev og hTERT-HA kontrolceller, hvilket indikerer, at telomer forlængelse ikke påvirker methyleringsstadiet Terra promotorer (figur 1b). Northern blot analyse af total RNA ved hjælp telomere sonder afslørede ingen væsentlige ændringer i den samlede TERRA cellulære niveauer i hTERT-inficerede celler i forhold til Everio eller hTERT-HA-inficerede kontroller (Figur 1C). En størrelse skift af TERRA molekyler til højere molekylvægte var tydelig i celler med aflange telomerer, tyder på, at i det mindste i disse cellelinjer telomer længde kunne påvirke længden af ​​TERRA molekyler (Figur 1C). I overensstemmelse med Northern blot analyse, kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) målinger af Terra molekyler transkriberet fra kromosomarmene 10q, 15q og XpYp afslørede ingen statistisk signifikant ændring, Terra steady state-niveauerne upon telomer forlængelse (figur 1D). Vi udførte også analoge eksperimenter i primære humane lungefibroblaster (HLF), og som for HeLa-celler, har telomer forlængelse ikke væsentligt ændrer methylering staten TERRA initiativtagere og cellulære TERRA niveauer (Figur S1).

(A) TRF-analyse af HeLa-celler inficeret med tom vektor (EV), hTERT eller hTERT-HA retrovira. DNA blev fordøjet med

Rsa

I og

Hinf

I restriktionsenzymer og hybridiseret med telomere prober. (B) Den samme DNA som i A blev fordøjet med

Hpa

II (methylering følsom) eller

Msp

I (methylering ufølsom) restriktionsnukleaser og hybridiseret med en probe detekterer 29-37 bp gentagelser af TERRA initiativtagere. (C) Nuclear RNA blev hybridiseret hjælp telomere prober til at opdage alt TERRA og successivt med 18S rRNA sonder til at kontrollere for lastning. Tal i bunden er forholdet mellem TERRA og 18S Signal har udtrykt som fold stigning i forhold EV-inficerede prøver. Molekylære vægte er til venstre i kilobaser. (D) QRT-PCR-analyse af steady state niveauer af TERRA udskrifter oprindelse fra 10Q, 15q og Xp /Yp kromosom ender. Søjler er gennemsnit fra tre uafhængige forsøg udtrykt som fold forøgelse i forhold ev-inficerede prøver. Fejl barer og tal er standardafvigelser og P-værdier henholdsvis. (E) Western blot-analyse af inficerede celler under anvendelse af anti-hTERT (til at registrere alle hTERT-molekyler), anti-HA (til påvisning af hTERT-HA) og anti-PCNA (loading control) antistoffer.

i en supplerende fremgangsmåde, dyrkede vi HeLa-celler i nærvær af telomeraseinhibitor BIBR1532 [20] for ca. 19 uger. BIBR1532 behandling ført til en betydelig afkortning af bulk telomerer: telomer længde var for det meste på mellem 2 og 5 kb i ubehandlede kontrol celler og mellem 1 og 3 kb i BIBR1532-behandlede celler (figur 2A). Behandlede celler fordelt på samme måde som ubehandlede celler indikerer, at telomerer var lange nok til at opretholde normal cellevækst (data ikke vist). Telomer afkortning inducerede ikke nogen væsentlig ændring i methylering tilstand af 29-37 gentagelser eller i alt eller kromosom specifikke TERRA steady state-niveauerne (figur 2B-D). Tilsammen disse forsøg indikerer, at, som det for nylig vist for knopskydende gær [18], telomer længde ændringer påvirker ikke TERRA promotor methylering eller TERRA cellulære niveauer i humane celler. Vi konkluderer, at TERRA transkription ikke reguleres af telomer længde, i det mindste i de celletyper, som vi har analyseret.

(A-D) HeLa-celler blev behandlet med den telomeraseinhibitor BIBR1532 (+ BIBR) i 19 uger eller venstre ubehandlet (-BIBR). Telomerlængde, TERRA promotor methylering og total eller kromosomspecifikke TERRA steady state-niveauerne blev analyseret som i figur 1. Total RNA blev anvendt til alle eksperimenter. For Northern blot-analyse af totalt TERRA (C) beta-actin (ACT) blev anvendt som en normalisering kontrol. Molekylære vægte er til venstre i kilobaser.

DNA methyltransferase-mangelfulde celler har normal telomerase aktivitet

De forhøjede TERRA-niveauer til stede i DKO celler gør dem et passende cellulært system til at teste virkninger udøvet af TERRA på telomeraseaktivitet. Vi stabilt inficeret DKO og HCT116 forældrenes (par) celler med hTERT eller ev retrovirus og udvalgte stabile bestande. Muligvis på grund af den forskellige transkriptionelle tilstand af de to cellelinier, vi gentagne gange vist sig, at over-udtrykte hTERT protein niveauer var mere end to gange højere i par end i DKO-celler (figur 3A). Som det fremgår af QRT-PCR og northern blot, steady state niveauer af TERRA molekyler transskriberet fra 61-29-37 repeat-holdige 10Q og 15Q kromosom ender blev dramatisk forøget i DKO celler (figur 3B og S2A) og, i overensstemmelse med ovenfor beskrevne resultater for HeLa og HLF celler, havde hTERT stabil ekspression ikke ændre TERRA beløb i enten cellelinje (figur 3B). Vi forberedt proteinekstrakter og analyseret telomeraseaktivitet ved hjælp af kvantitative TRAP-assays. Ingen signifikant forskel i telomerase-aktivitet blev målt i ev-inficerede pari og DKO-celler, mens hTERT infektion førte til en betydelig stigning i telomeraseaktivitet i begge cellelinier (figur 3C og D). TRAP-aktivitet var en smule højere i hTERT-inficerede par celler end i hTERT-inficerede DKO-celler og vi tilskriver denne forskel til de lavere mængder af total hTERT proteinet udtrykt i DNMT-deficiente cellelinie (figur 3A, C og D). RNA isoleret fra TRAP ekstrakter indeholdt 10Q og 15Q TERRA molekyler, selv om en stor del af dem (ca. 90 og 80% for par og DKO-celler, henholdsvis) forblev i cellepellets tilbage efter ekstraktion (figur 3E), sandsynligvis fordi størstedelen af TERRA er kromatin forbundet [1], [3], [6]. Alligevel overvejer at 10Q og 15Q TERRA molekyler er ~300 gange mere rigelige i DKO end i par celler (figur 3B), vurderer vi, at DKO TRAP ekstrakter indeholdt ~600 gange flere TERRA molekyler end par uddrag. Afslutningsvis rapporterer vi, at TRAP-aktivitet er den samme i celler med drastisk forskellige TERRA niveauer. Dette er i skarp kontrast til resultaterne

in vitro

med korte TERRA-lignende oligonukleotider [6], [14]. Vi mener, at de korte RNA-oligonukleotider anvendes

in vitro

ikke opfører som naturlige, lange TERRA molekyler, muligvis på grund af deres anvendelse i store, ikke-fysiologiske koncentrationer.

(A) Western blot analyse af hTERT-udtryk i HCT116 parental (par) eller DNMT1 og 3b dobbelt KO (DKO) inficerede celler. Tal i bunden er forholdet mellem hTERT og PCNA (lastning kontrol) signaler, udtrykt som fold stigning i forhold hTERT-inficerede parentale celler. (B) QRT-PCR-analyse af steady state niveauer af TERRA udskrifter oprindelse fra 10Q og 15q kromosom ender udtrykt som fold stigning i forhold EV-inficerede par celler. Barer og fejllinjer er gennemsnit og standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg. (C) Analyse af TRAP amplifikationsprodukter fra de angivne cellelinjer. Tre forskellige mængder af totale proteiner blev anvendt til hver cellelinie og kontrollere for specificitet én prøve blev forbehandlet med RNase A. Kontrol primere amplifikation en intern kontrol (IC) blev indbefattet i alle reaktioner. (D) Kvantificering af telomeraseaktivitet i de angivne prøver under anvendelse QRT-PCR-baserede TRAP-assays. Barer og fejllinjer er gennemsnit og standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg, efter normalisering gennem EV-inficerede forældrenes celleprøver. Tal angiver P-værdier (*: P 0,01). (E) QRT-PCR-baserede kvantificering af 10Q og 15Q TERRA udskrifter i TRAP ekstrakter (ext) eller i cellepellets tilbage efter ekstraktion (PLT). Relative TERRA beløbene er udtrykt som brøkdele af den samlede TERRA molekyler fra pellet plus ekstrakt. Barer og fejllinjer er gennemsnit og standardafvigelser fra tre uafhængige forsøg.

Effektiv telomerase-medieret telomer forlængelse i DKO celler

For at overvåge, hvordan telomerase forlænger telomerer i par og DKO celler vi rede genomisk DNA fra inficerede celler 2, 5 og 9 dage efter infektion. Vi derefter udført TRF-analyse under anvendelse af prober, der specifikt påviser kromosom 10q subtelomeric sekvenser eller telomere repeat prober påvisning bulk-telomerer. Selvom 10Q og bulk TRFs var væsentligt kortere i DKO end i parentale celler, de begge undergik gradvis forlængelse hele det valgte tidsforløb i celler inficeret med hTERT men ikke i EV kontrolceller (figur 4A). Således telomerase er i stand til at aflang telomerer både par og DKO celler, herunder 10Q telomerer, som er stærkt transskriberet i DKO celler (figur 3B og S2A). For at få mere kvantitative data, vi gjort brug af enkelt telomer længde analyse (STELA), en PCR-baseret tilgang, der gør det muligt præcist at måle længden af ​​individuelle telomerer [21]. STELA af 15q telomerer bekræftede, at den gennemsnitlige telomer længde i DKO-celler er lavere end i parentale celler (5,9 kb og 3,8 kb i par og DKO-celler henholdsvis, figur 4B og C). Men som allerede foreslået af TRF-analyse, 15Q telomerer blev effektivt aflang i begge cellelinier inficeret med hTERT retrovirus (figur 4D). Ved kvantitativ analyse af Stela produkter og normalisering gennem befolkningen fordobling (PD) tid beregnet for de to cellelinjer (17,7 t og 29,6 h for par hTERT og DKO hTERT celler, henholdsvis) skønnede vi, at telomerase forlængelse satser var ca. ~204 bp /PD i par celler og ~186 bp /PD i DKO celler (figur 4C og D). Denne lille forskel i telomerase forlængelse satser ikke korrelerer med de enormt øgede niveauer af 15q TERRA i DKO celler (figur 3B) og vil sandsynligvis tilskrives de forskellige hTERT protein niveauer påvist i inficerede par og DKO celler (figur 3A). Trypan blå farvning og fluorescens-cellesortering (FACS) analyse af Annexin V og propidiumiodid-farvede celler viste ikke nogen større forskel i den del af døde eller apoptotiske celler i de forskellige cellelinjer heller ikke vise væsentlige ændringer i fordelingen af celler mellem de forskellige faser af cellecyklussen (fig S2B). Dette indikerer, at den højere PD tid målt for DKO-celler sandsynligvis tilskrives en længere cyklustid af disse celler, et begreb bekræftes af den indlysende forsinkelse i cellecyklusprogression observeret for synkroniserede DKO celler frigivet fra en nocodazol blok (figur S3A).

(A) TRF analyse af pari og DKO celler inficeret med tom vektor (ev) eller hTERT retrovirus. Genomisk DNA blev opsamlet 2, 5 og 9 dage (D) efter infektion, spaltet med

Rsa

I og overført til en nylonmembran. Den samme membran blev først hybridiseret med en probe detektere 10q TRFs og successivt med en probe detektere total telomerer. (B) STELA 15q telomer længde anvendelse af den samme DNA som i A. Marker molekylvægte er på venstre i kilobaser. (C) Box plot repræsentation af 15Q telomer længder. Gennemsnitlige telomer længde i kilobaser og antal samlede telomerer analyseres (n) er angivet for hver prøve. (D) 15Q telomer forlængelse satser udtrykt som gennemsnit telomer længde på forskellige befolkningsgrupper fordoblinger. Bemærk, at for par celler, blev kun tre tidspunkter brugt, fordi ingen statistisk signifikant forskel i den gennemsnitlige telomer længde blev målt mellem dag 5 og dag 9.

Normalt telomer forlængelse i hTERT inficerede DKO celler understøtter ikke forestillingen om, at TERRA fungerer som en telomeraseinhibitor

in vivo

. Stadig, overvejede vi muligheden at Terra transkripter i DKO-celler er ude af stand til at inhibere telomerase enten fordi de ikke ordentligt lokalisere til telomerer eller fordi de er drastisk nedreguleres under S-fasen, når telomerase handler [17], [22] . Vi kombineret indirekte immunofluorescens med RNA fluorescens

in situ

hybridisering (IF /RNA-FISH) til samtidig at detektere telomere faktor TRF2 og Terra-molekyler. DKO celler indeholdt mere og lysere TERRA foci end forældrenes celler og hTERT infektioner ændrede ikke det overordnede mønster af TERRA hybridisering. Ca. 20 og 30% af TRF2 foci co-lokaliseret med TERRA foci i par og DKO celler, (figur S2C og D), sandsynligvis afspejler, at de forhøjede niveauer af TERRA i DKO celler lettet påvisning af TERRA foci. På den anden side, den del af TERRA foci co-lokalisere med telomerer var ens i begge cellulære baggrunde, hvilket indikerer, at den iboende evne TERRA at forblive forbundet til telomere heterochromatin kræver ikke intakte DNMT aktiviteter (figur S2C og D). Vigtigere er, at hTERT-ekspression ikke ændre co-lokalisering satser i enten cellelinie. Derfor den del af TERRA tilknyttet telomerer ligner i par og DKO celler, og telomer forlængelse ikke mærkbart påvirker TERRA lokalisering. Vi derefter blokeret par og DKO celler i G2 /M-fase og frigivet dem synkront i cellecyklussen i et tilstrækkeligt tidsrum til at fremskridt gennem S-fase (Figur S3A). Vi forberedt totalt RNA på forskellige tidspunkter og dot-blot hybridiseret det til Terra og actin-prober. TERRA niveauer forblev stabil gennem hele tidsforløbet i begge cellelinier (figur S3B og C). Tilsammen disse observationer afslører, at telomerase-medieret telomer forlængelse ikke er væsentligt forringet i DKO celler, hvor TERRA transskription satser og steady state-niveauerne er dramatisk forøget [9]. Denne mangel på robuste hæmning ikke stammer fra mislocalization af TERRA eller fra dets nedregulering i S-fasen. Dette er godt i tråd med vores observationer, at telomerase-aktivitet er upåvirket i de samme cellelinjer.

Generation af menneskelige kræftceller bærer transkriptionelt inducerbare telomerer

DNMT1 /3b sletning fører til globale transkriptionelle ændringer i DKO celler [23]. Til opnåelse af et cellulært system, hvor transkription af unikke telomerer kunne ændres, genereres vi stabile cellelinier transporterer transgene telomerer som kan transkriberes i en inducerbar måde ( »transkriptionelt inducerbare telomerer”; Titler). Vi kombinerede den telomer seeding fænomen med den inducerbare genekspression Tet-ON-teknologi [24] – [26] og manipuleret en telomer såning vektor, der omfatter et hygromycinresistens kassette og en doxycyclin (DOX) -inducerbare minimal CMV-promotor placeret opstrøms for et (TTAGGG ) n telomere array (figur 5A). En ~1.6 kb unik sekvens benævnt “transkriptionelt inducerbar subtelomere« (tiSUBTEL) adskiller telomere sekvens fra den inducerbare promotor (figur 5A). Podningen plasmid blev lineariseret ved

Apa

fordøjelse for at blotlægge telomere tarmkanalen ved sin 3′-ende og transficeret ind i en Tet-repressor-udtrykkende cellelinie afledt fra HeLa-celler (T-Rex-HeLa). Uafhængige hygromycin-resistente kloner blev udvalgt og testet for Titel podning ved Southern blot-analyse. Genomisk DNA blev fordøjet med

Xho

I for at frigive Titel TRFs og hybridiseret under anvendelse af radioaktivt mærkede prober svarende til tiSUBTEL sekvenser (SBP i figur 5A). To kloner (CL12 og CL17) viste den typiske udtværing hybridiseringsmønster forventes for nyligt podet Titler (figur 5B) og blev valgt til yderligere karakterisering. I begge kloner blev TITEL TRFs meste omfattet mellem 3 og 6 kb. Fordi

Xho

I snit ca. 2,4 kb opstrøms for den første telomere gentagelse på seeding plasmid (figur 5A), Titler telomer skrifter blev stabiliseret sig på ca. 0,6 til 3,4 kb, en størrelsesorden kan sammenlignes med den ene af bulk telomerer i forældrenes og i klonede celler (Figur S4A). Vi bekræftede yderligere Titel såning i klonerne 12 og 17 ved hjælp af yderligere eksperimentelle tilgange. Vi stabilt inficeret begge klonale cellelinier med hTERT-udtrykkende retrovirus og bekræftede, at begge Titler og naturlige telomerer let blev forlænget ved hTERT infektion (figur 5B og S4A). STELA med oligonukleotider svarende til tiSUBTEL sekvenser produceret amplifikationsprodukter hybridiserer til både SBP og telomere sonder kun, når vi brugte genomisk DNA fra CL12 og CL17 celler, men ikke fra forældrenes celler (Figur s4b). DNA FISH af metafase kromosomer fremstillet af CL12 og CL17 celler ved hjælp fluorescens-mærkede seeding plasmider blottet for telomere gentagelser afsløret, at nyligt seedet Titler blev integreret på en og to kromosom ender i klon 17 og i klon 12 celler, (figur 5C). Endelig dot-blot hybridisering af genomisk DNA fordøjet med BAL31 exonuklease afslørede en gradvis forsvinden af ​​Titel hybridiseringssignaler over tid (figur S4C).

(A) til det titel seeding vektor. iCMV: inducerbar CMV-promotor; SBF og SBR: oligonukleotider anvendt i RT-PCR-forsøg; SBP: probe anvendt i TRF, STELA og nordlige blot eksperimenter. (B) Titel TRF-analyse af genomisk DNA fremstillet fra klon 12 (CL12), klon 17 (CL17) og parentale (PAR) celler inficeret med hTERT-udtrykkende retrovirus eller ev kontrol retrovira. DNA blev hybridiseret under anvendelse af SBP prober. Marker molekylvægte er på venstre i kilobaser. (C) Delvise metafaser fra CL12 og CL17 hybridiseret

in situ

at opdage Titler (pilespidser). (D) Northern blot-analyse af totalt RNA fra CL12 og CL17 behandlet i 24 timer med kombinationer af doxycyclin (DOX) og trichostatin A (TSA) eller ubehandlet. SBP prober blev anvendt til at detektere tiTERRA. De samme membraner blev strippet og re-probes til at detektere beta-actin udskrifter (ACT) til at styre for lastning. (E) QRT-PCR-analyse af tiTERRA steady-niveauer i de angivne cellelinjer behandlet med forskellige kombinationer af DOX og TSA eller venstre ubehandlet. For hver cellelinie, værdier udtrykkes som fold forøgelse i forhold til ubehandlede prøver. Barer og fejllinjer er gennemsnit og standardafvigelser fra 3 til 7 eksperimenter. P-værdier for relevante prøver er angivet med tal eller af stjerner (*: P 0,01; **: P 0,001)

Transskription induktion af Titler

For at teste, om. Titler svarede på transkription induktion, dyrkede vi CL12 og CL17 celler i nærvær eller fravær af doxycyklin (DOX) i 24 timer. Vi indsamlede total RNA og udsat det til Northern blot-analyse under anvendelse SBP prober (figur 5A). DOX behandling førte til udseendet af RNA-arter, benævnt “transkriptionelt inducerbar TERRA« (tiTERRA), omfattet i længde mellem ca. 0,5 og 6 kb (figur 5D). Fordi promotersekvens er placeret ca. 1,6 kb opstrøms for telomere sekvens, konkluderer vi, at titel transkription kan fortsætte gennem det meste af telomere tarmkanalen. Vi derefter udført QRT-PCR analyse ved revers transskription RNA med vilkårlige hexamerer og PCR amplifikation af opnåede cDNA under anvendelse SBF og SBR-oligonukleotider (figur 5A). Som forventet blev ingen tiTERRA påvist i parentale celler, hvilket bekræfter specificiteten af ​​RT-PCR tilgang (figur 5E). Selv ved lave niveauer, blev tiTERRA transkripter allerede påvist i begge inducerede kloner, afslører en basal transkriptionel aktivitet fra den inducerbare CMV-promotoren i fravær af induktion (figur 5E). Absolutte kvantificering af tiTERRA molekyler viste, at, i ikke-inducerede kloner blev tiTERRA opretholdt på et niveau svarende til dem af endogene TERRA molekyler transskriberet fra 10Q kromosom ender (figur S5A og B). Dette indikerer, at tiTERRA holdes ved fysiologiske niveauer i både klonale cellelinier. I overensstemmelse med Northern blot resultater, DOX behandling inducerede en 10-til-20-fold stigning i tiTERRA niveauer i begge kloner (fig 5E og S5B). TiTERRA molekyler blev også påvist i PCR eksperimenter udført med cDNA omvendt transskriberet ved hjælp af C-rige oligonukleotider (Telc) komplementære til telomere strækning inden TERRA molekyler (Figur S5A og C). Således, som med naturlig TERRA, individuelle tiTERRA udskrifter indeholder både telomert og subtelomeric sekvenser.

TERRA udtryk er epigenetisk reguleret og histondeacetylaseinhibitoren Trichostatin A (TSA) fremmer ophobning af TERRA udskrifter i humane cancerceller [27] . Vi behandlede CL12 og CL17 celler med TSA i nærvær eller fravær af DOX og kvantificeres tiTERRA ved QRT-PCR.