PLoS ONE: MIR-34a /c-Dependent PDGFR-α /β Nedregulering Forhindrer tumorigenese og Forbedrer TRAIL-induceret apoptose i Lung Cancer

Abstrakt

Lungekræft er den hyppigste årsag til dødelighed af kræft i verden i dag . Selv om nogle fremskridt i lungekræft behandling er foretaget, patient overlevelse er stadig fattige. MikroRNA’er (miRNA) kan fungere som onkogener eller tumor-suppressor gener i human malignitet. MIR-34 familien består af tumor-undertrykkende miRNA, og dets reducerede ekspression er blevet rapporteret i forskellige cancerformer, herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-34a og MIR-34c target blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa og beta (PDGFR-α og PDGFR-β), celleoverflade tyrosinkinasereceptorer, der inducerer proliferation, migration og invasion i cancer. MIR-34a og MIR-34c blev nedreguleret i lungetumorer i forhold til normale væv. Desuden har vi identificeret en omvendt korrelation mellem PDGFR-α /β og MIR-34a /C ekspression i lunge tumorprøver. Endelig MIR-34a /c overekspression eller nedregulering af PDGFR-α /β af siRNA’er, stærkt forøgede respons på TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) og samtidig reducere vandrende og invasive kapacitet NSCLC-celler.

Henvisning : Garofalo M, Jeon YJ, Nuovo GJ, Middleton J, Secchiero P, Joshi P, et al. (2013) MIR-34a /c-Dependent PDGFR-α /β Nedregulering Forhindrer tumorigenese og Forbedrer TRAIL-induceret apoptose i lungekræft. PLoS ONE 8 (6): e67581. doi: 10,1371 /journal.pone.0067581

Redaktør: Noriko Gotoh, Institut for Medicinsk Videnskab, University of Tokyo, Japan

Modtaget: November 10, 2012; Accepteret: 23. maj 2013; Udgivet den 21. juni, 2013 |

Copyright: © 2013 Garofalo et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health CA152758. Forfatterne er taknemmelige for forskningsstøtte fra The Ohio State University Målrettet investering i Excellence Award. MG er en modtager af Kimmel Scholar Award 2011. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. GJN er ansat af Fylogeni , Inc. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Trods mange års forskning, er prognosen for patienter med lungekræft er stadig dystre. Den hyppigste type, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) (85%), viser en samlet Femårs overlevelsen på 15%. Isoformer af blodpladeafledt vækstfaktorreceptor (PDGFR) og dens ligand, PDGF, udgør en familie af receptorer og ligander er involveret i proliferativ og prosurvival signalering i celler. Den PDGFR /PDGF-systemet omfatter to receptorer (PDGFR-a og PDGFR-p) og fire ligander (PDGFA, PDGFB, PDGFC, og PDGFD). Ligandbinding inducerer receptordimerisering, muliggør autophosphorylering af specifikke tyrosinrester og efterfølgende rekruttering af en række forskellige signaltransduktionsmolekyler. PDGFR regulerer normal cellevækst og differentiering [2] og ekspression af aktiveret PDGFR fremmer oncogen transformation [3]. Talrige

in vitro

in vivo

undersøgelser viste, at hæmning af PDGFR-α signalering forstyrrer kræftcelle overlevelse i den delmængde af gastrointestinale stromale tumorer (loger) med aktivering PDGFR-α mutationer [4, 5]. I en nylig undersøgelse af 150 NSCLC patientprøver, aktiveret PDGFR-α blev påvist i 13% af tilfældene [6], hvilket tyder på, at en undergruppe af disse patienter kan have gavn af terapier rettet mod PDGFR-α. Desuden har PDGFR-α overekspression blevet observeret i metastatisk versus nonnmetastatisk prøver medulloblastom patienten og forstyrre PDGFR-α-funktion inhiberet metastatiske potentiale medulloblastom celler in vitro [7]. I betragtning af dets progrowth rolle i cellesignalering, har PDGFR-α blevet en attraktiv terapeutisk mål i en række humane maligniteter. I ikke-småcellet lungekræft, cytoplasmatisk PDGFR-α ekspression ved tumoren er en negativ prognostisk indikator [8], bekræfter, at PDGF-aksen kan være biologisk relevant. Alle medlemmer af PDGF familien display potent angiogene aktivitet

in vivo

, og fra dette synspunkt, PDGF-B /PDGFRβ akse var den mest omfattende evalueret. I null mus blev det vist, at PDGF-B og PDGFRβ er kritisk involveret i vaskulær udvikling. Rollen af ​​PDGF /PDGFR i vaskulær udvikling støttes af knockout eksperimenter [9,10]. MikroRNA’er (miRNA), en klasse af ~ 22 nt endogene RNA, er vigtige regulatorer af genekspression og har været impliceret i reguleringen af ​​kritiske processer, der allerede er liberaliseret i kræftceller, som spredning [11] differentiering [12] og apoptose [13 ]. Ændringer i miRNA udtryk i kræft er blevet dokumenteret i talrige undersøgelser og foreslå, at miRNA kritisk bidrage til kræft-fænotype [14,15]. Desuden har nogle miRNA gener blevet klassificeret som onkogene eller tumor undertrykkende gener efter deres funktion i cellulær transformation og ændret udtryk i tumorer.

I 2007 rapporter fra flere laboratorier viste, at medlemmer af miR-34 familie er direkte p53 mål, og at deres opregulering induceret apoptose og celle-cyklus anholdelse [16,17]. I pattedyr, den miR-34 familie består af tre forarbejdede miRNA, der er kodet af to forskellige gener: miR-34a er kodet af sin egen udskrift, mens miR-34b og miR-34c deler en fælles primær udskrift. Desuden promoter regionen miR-34a, miR-34b og miR-34c indeholder CpG øer og afvigende CpG methylering reducerer miR-34 familie udtryk i flere typer af kræft [18,19,20].

I denne undersøgelse viser vi, at mIR-34a og mIR-34c, er stærkt nedreguleret i NSCLC-celler og lungetumorer hvorimod de er højt udtrykt i normale lungevæv. Desuden MIR-34a og MIR-34c, ved at målrette PDGFR-α og PDGFR-β, øge TRAIL-induceret apoptose og reducere invasivitet af lungecancerceller. Endvidere tyder vore resultater, for første gang, at kombinatorisk behandling af TRAIL og PDGFR-inhibitorer kunne være effektive for anti-NSCLC terapi.

Resultater

MIR-34a og MIR-34c target PDGFR -α og PDGFR-β 3 ‘UTR’er

Blandt miRNA, miR-34 familiemedlemmer spiller vigtige tumor undertrykkende roller, da de er direkte reguleret af p53 og komponere p53 netværk [16,17]. En tidligere undersøgelse viste, at miR-34 methylering var til stede i NSCLC og var signifikant relateret til en ugunstig klinisk resultat [20]. Først, vi analyseret af Real Time PCR (QRT-PCR) miR-34a, -34b og -34c udtryk i 5 forskellige NSCLC cellelinier med p53 WT, mutant eller nul (figur S1a i File S1). MIR-34a, -34b og -34c havde lav eller fraværende udtryk i alle de fem cellelinier (figur S1B i File S1). For at identificere miR-34a, -34b, og -34c mål, vi udførte en bioinformatik søgning (Targetscan, Pictar) for formodede mRNA-mål. Blandt kandidatlandene mål 3’UTR af human PDGFR-α og PDGFR-β indeholdt regioner (PDGFR-a nukleotider 2670-2676, 2699-2705, PDGFR-p nukleotider 1535-1541), som matcher frø sekvenser af HSA-miR- 34a, -34b og -34c (figur 1a). PDGFR-α og PDGFR-β er blevet rapporteret at være overudtrykt og relateres til dårligt resultat i lungecancer [21]. For at kontrollere, om PDGFR-α og PDGFR-β var direkte mål for miR-34a, -34b og -34c, PDGFR-α 3’UTR, indeholdende to miR-34a, -34b og -34c bindingssteder og PDGFR-β 3 ‘ UTR, indeholdende ét mIR-34a, -34b og -34c bindingssted (figur 1a, b), blev klonet nedstrøms for luciferase åbne læseramme. Interessant, forøget ekspression af MIR-34a og MIR-34c, og ikke MIR-34b, ved transfektion, bekræftet ved QRT-PCR (data ikke vist), signifikant nedsat luciferaseaktivitet, hvilket indikerer en direkte interaktion mellem miRNA og PDGFRα og PDGFRβ 3 ‘UTR’er (figur 1c, d). Målgen repression blev reddet af mutationer i de komplementære frø steder (figur 1b, c, d). Taget sammen indikerer resultaterne, at MIR-34a og MIR-34c og ikke MIR-34b direkte målrette PDGFR-α og PDGFR-β.

(a) PDGFR-a og PDGFR-p 3’UTR’er indeholder henholdsvis , to og en forudsagt miR-34a, -34b og -34c bindingssteder. I figuren er vist justeringen af ​​frø regioner miR-34a /c med PDGFR-α og PDGFR-β 3 ‘UTR’er. De steder, hvor målet mutagenese er angivet med rødt. _deleted nukleotider. (B) pGL3 kontrol-PDGFR-a-konstruktioner, der indeholder to PDGFR-a bindingssteder (i rødt). Deletion af en af ​​de to PDGFR-a sites blev anvendt til at danne de mutante luciferase palsmids. (C-d) PDGFR-α og PDGFR-β 3 ‘UTR’er er direkte mål for miR-34a og miR-34c. pGL3-PDGFR-a og pGL3-PDGFR-β luciferase konstruktioner, der indeholder en vildtype (venstre side af histogrammerne) eller muteret (højre side af histogrammerne) PDGFR-α og PDGFR-β 3’UTR’er, blev transficeret ind i Calu -6 celler. Relativ undertrykkelse af ildflue-luciferase-ekspression blev standardiseret til et transfektion kontrol. Reporter assays blev udført tre gange med i det væsentlige identiske resultater. * P 0,0001, ** P. 0,05 af to halet Students t-test

MIR-34a og miR-34c er omvendt proportional med PDGFR-α /β udtryk

in vitro

og

in vivo

Næste, vi analyserede følgerne af ektopisk udtryk for miR-34a og -34c i Calu-6 og H1703 celler. Vi valgte disse to cellelinjer på grund af de høje ekspressionsniveauer af PDGFR-α (H1703 og Calu-6) og PDGFR-β (Calu-6) (data ikke vist). Forøget ekspression af MIR-34a og MIR-34c ved transfektion blev bekræftet ved QRT-PCR (data ikke vist) og derefter virkningerne på PDGFR-α og PDGFR-β-mRNA og proteinniveauer blev analyseret ved QRT-PCR og western blot. MIR-34a og -34c (og ikke MIR-34b) overekspression signifikant reduceret PDGFR-α og PDGFR-p mRNA’er (figur 2A) og den endogene protein niveauer, sammenlignet med celler transficeret med en kodet pre-miR (figur 2b). Ekspressionsniveauerne for de fire PDGF-ligander (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) efter MIR-34a og MIR-34c tvungne ekspression blev også vurderet i begge Calu-6 og H1703-celler. PDGFD var knap udtrykt i begge cellelinier; Vi fandt ikke nogen variation af ekspressionen af ​​PDGFA, PDGFB og PDGFC (data ikke vist). Sammenfattende disse resultater støttede bioinformatik forudsigelser indikerer PDGFR-α og PDGFR-β 3 ‘UTR’er som mål for miR-34a og -34c.

(a) QRT-PCR viser PDGFR-α og PDGFR-β mRNA’er nedregulering i Calu-6 og H1703 celler efter mIR-34 og mIR-34c men ikke mIR-34b tvungen ekspression (b) mIR-34a og mIR-34c tvungen ekspression formindsker endogene niveauer af PDGFR-a /p proteinniveauer i H1703 og Calu-6 NSCLC. Celler blev transficeret med enten krypteret, MIR-34a eller MIR-34c i 72 timer. PDGFR-α og PDGFR-β-ekspression blev vurderet ved Western blot. Ladningskontrol blev opnået ved anvendelse GAPDH antistof. * P 0,05, ** P. 0,001 ved tosidet Student t-test

For at verificere nedregulering af miR-34a og -34c også

in vivo

, 9 lungetumorer (blandt adenocarcinom og planocellulært karcinom), og de tilstødende histologisk normale lungevæv blev analyseret for miR-34a og -34c udtryk. Som vist i figur 3a og b, MIR-34a og MIR-34c ekspression var lavere i tumoren i forhold til de normale prøver (figur 3a, b).

(a-b) QRT-PCR på 18 lunge tumor og normalt væv. MIR-34a og MIR-34c nedreguleres i tumorerne sammenlignet med de normale lungevæv. (c) Kassegrafer viser miR-34a og miR-34c udtryk i 48 lunge normale og cancer væv. (d) XY scatter plots viser omvendt korrelation mellem miR-34a /c og PDGFR-α /β. To-tailed Students t-test blev anvendt til at verificere betydning. P. 0,05

Desuden har vi analyseret miR-34a, 34c og PDGFR-α /β mRNA-ekspression i 24 primære humane lunge tumor prøver sammenlignet med 24 normale væv. MIR-34a og -34c var næsten upåviselig i tumoren og højt udtrykt i normale lunge testede prøver (figur 3c). Bemærkelsesværdigt, blev en omvendt korrelation mellem MIR-34a /c og PDGFR-α og PDGFR-β observeret (figur 3d). For yderligere at underbygge disse resultater, in situ hybridisering (ISH) analyse blev udført ved anvendelse af 5′-dig-mærkede LNA sonder på lungetumorer og normale væv, efterfulgt af immunhistokemi (IHC) for PDGFR-α og PDGFRβ. De fleste lungecancerceller viste lav ekspression af MIR-34a og høj ekspression af PDGFR-α /β, mens den tilstødende ikke-malign lunge udtrykte PDGFR-α sjældent og rigeligt udtrykt MIR-34a. MIR-34a og PDGFR-α /β-ekspression i de fleste af de 107 forskellige tumorer analyserede var dybest set udelukker hinanden (figur 4a, b og fig S2 i File S1).

(a-b) Immunhistokemi og i situ hybridisering på 107 lungekræft væv prøver. MIR-34a (blå) og PDGFR-α /β (brun /rød, henholdsvis i RGB og hver fluorescerende rød i Nuance konverterede billede) ekspression blev omvendt relateret i lungecancere og de tilstødende normale lungevæv. Disse serielle snit blev analyseret for MIR-34a-ekspression ved in situ-hybridisering efterfulgt af immunhistokemi for PDGFR-α /β. (A) Repræsentant eksempel: Co-ekspression analyse af miR-34a og PDGFR-α. Bemærk manglende udtryk i det flettede billede (panel b) (fluorescerende gul = co-udtryk). (B) Et repræsentativt eksempel: MIR-34a = blå (panel a), PDGFR-β = rød (panel b), co-ekspression = gul (panel c). RGB = almindelig Grøn Blå billede af ISH /LHC reaktion vist i paneler a-c. Scale bar indikerer 50 um. Forstørrelsen er den samme for alle panelerne.

MIR-34a og MIR-34c overvinde TRAIL modstand NSCLC celler gennem PDGFR-α og PDGFR-β nedregulering

TNF-relaterede apoptoseinducerende ligand (TRAIL) er et medlem af tumornekrosefaktor familien, kendt for at inducere apoptose i en række forskellige tumortyper. TRAIL er i stand til specifikt at inducere celledød i cancerceller samtidig skåne normale celler og testes i øjeblikket som et lovende anti-tumormiddel i kliniske forsøg [22]. Men mange tumorer, herunder NSCLC er resistente over for TRAIL hvilket begrænser dets terapeutiske anvendelse. Da PDGFR-α og PDGFR-β regulerer PI3K /Akt og ERK1 /2-pathways [23,24,25], vi næste undersøgt ved immunfarvning, ekspressionen og /eller aktivering af nogle af de involverede i disse veje efter miR proteiner -34a og miR-34c håndhævet udtryk eller PDGFR-α /β silencing af siRNA’er. Som vist i figur 5a, phosphorylering niveauer af ERK’er faldt efter MIR-34a og MIR-34c tvungen ekspression sammenlignet med celler transficeret med kontrol miR. PDGFR-α silencing reduceret aktivering af både Akt og ERK1 /2 (figur 5b). Vi har tidligere vist, at PI3K /AKT pathway spiller en central rolle i TRAIL-induceret apoptose [26], således virkningerne af MIR-34a og MIR-34c overekspression på celleoverlevelse og TRAIL modstand NSCLC blev undersøgt. Først udførte vi en spredning assay på Calu-6 og H1703 TRAIL semi-resistente celler efter håndhæves udtryk for miR-34a og miR-34c. 48h efter transfektion blev celler eksponeret for TRAIL i 24 timer og derefter celleproliferation blev bedømt under anvendelse af et MTT-assay. Calu-6 og H1703 celler, der overudtrykker MIR-34a og -34c viste en signifikant lavere proliferationshastighed sammenlignet med kontrolcellerne (figur S3A i File S1). Endvidere caspase 3/7 assay viste en stigning i TRAIL følsomhed efter MIR-34a og -34c tvungen ekspression eller PDGFR-α /β silencing, sammenlignet med celler transficeret med en kodet miR eller siRNA (figur 5c, d).

(a) Western blot i Calu-6 celler efter miR-34a, -34b og -34c tvunget udtryk. MIR-34a eller MIR-34c og ikke MIR-34b tvungen ekspression falder PDGFRβ ekspressionsniveauer og reducerer aktivering af ERK1 /2. (B) Western blot, der viser inaktivering af Akt og ERK’er veje efter PDGFR-α silencing. (C) Caspase 3/7 assay. MIR-34a og -34c håndhæves udtryk i Calu-6 og H1703 semi-resistente celler, øger reaktion på TRAIL-induceret apoptose. (D) Caspase 3/7 assay viser, at PDGFR-α eller PDGFR-β silencing øger respons på TRAIL-induceret apoptose. (E) PDGFR-α eller PDGFR-β overekspression i H460 TRAIL-sensitive celler formindsker respons på lægemidlet. (F) Kombineret behandling af PDGFR-inhibitor (20 uM) og forskellige TRAIL koncentrationer (0-100-150 ng /ml) i 24 timer sensibiliserer NSCLC celler til TRAIL-induceret apoptose. * P 0,001, ** P. 0,05

Desuden overekspression af PDGFR-α og PDGFR-β i H460 TRAIL-sensitive celler, forøgede resistens mod lægemidlet (figur 5e og figur S3C i File S1). Omvendt behandling af Calu-6 celler med en PDGFR hæmmer signifikant øget følsomhed over for TRAIL-induceret apoptose (figur 5f og figur S3D i File S1). Interessant, overekspression af PDGFR-α eller PDGFR-β (af to plasmider, der kun indeholder de kodende sekvenser og ikke de 3’UTR’er af PDGFR-α /β) sammen med MIR-34a eller MIR-34c, nedsat følsomhed til TRAIL-induceret apoptose, som vurderet af både MTT og caspase 3/7 assay (figur S4 i File S1). Resultaterne antyder, at PDGFR-α og PDGFR-β spiller en vigtig rolle i TRAIL-induceret apoptose og at PDGFR-inhibitoren kan sensibilisere NSCLC celler til trail med vigtige terapeutiske konsekvenser.

PDGFR-α /β nedregulering af miR- 34a og miR-34c hæmmer migration og invasionsevne af NSCLC celler

Fordi PDGFR-α /β regulere PI3K /AKT-vejen, især involveret i migration og invasion af forskellige tumorer [27,28], vi undersøgte, hvis miR -34a /c kunne påvirke NSCLC migration og invasion gennem PDGFR-α og PDGFR-β nedregulering. Til direkte teste funktionelle rolle af MIR-34a /ci tumorigenese, vi overudtrykt disse to miRNA eller tavshed PDGFR-α /β i Calu-6 eller H1703 celler. Interessant nok har vi observeret et signifikant fald af de vandrende og invasive kapacitet Calu-6 og H1703 celler efter MIR-34a eller MIR-34c overekspression (figur 6a) såvel efter PDGFR-α og PDGFR-β nedregulering (figur 6b), bekræftede også af scratch-viklet assay (figur 6c). For yderligere at bekræfte, at PDGFR-α og PDGFR-β var involveret i tumorigenese af NSCLC-celler, MIR-34a og -34c blev transficeret i Calu-6-celler alene eller i kombination med et plasmid der overudtrykker kun den kodende sekvens og ikke 3’UTR af PDGFR-α og PDGFR-β. MIR-34a /c tvungen ekspression reduceret migration og invasion af Calu-6 celler, men overekspression af PDGFR-α eller PDGFR-β, sammen med de to microRNA’er, delvist gendannet migrationen og invasion kapaciteter, hvilket antyder, at MIR-34a /C regulere NSCLC tumorigenese, i det mindste delvis gennem PDGFR-α /β (figur 6 d, e).

(a) MIR-34a og -34c tvungen ekspression reducerer migrerende og invasive kapaciteter af H1703-celler. (B) PDGFR-α og PDGFR-β nedregulering reducerer vandrende og invasive kapaciteter Calu-6 celler. RFU = relative fluorescens Units. (C) Repræsentative fotografier af ridsede områder af sammenflydende monolag af Calu-6 celler transficeret med MIR-34a /c eller kontrol miRNA (MIR-Ctr) ved 0h, 12H og 24 timer efter sårdannelse med en pipettespids. Scale bar, 100 pm. Forstørrelsen er den samme for alle panelerne. (D-e) PDGFR-α og PDGFR-β overekspression delvist redder vandrende og invasive kapaciteter Calu-6 celler. * P. 0,05

Diskussion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død hos både mænd og kvinder over hele verden

1. American Cancer Society anslår 156,940 dødsfald som følge af lungekræft i USA for 2011 alene [29]. Ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for størstedelen af ​​alle tilfælde lungekræft og er en førende årsag til kræft dødelighed [30].

Den høje dødelighed forbundet med lungekræft har bedt en række udtømmende bestræbelser på at identificere nye terapeutiske mål og behandlingsmetoder for denne dødelige sygdom. Blodpladeafledte vækstfaktorreceptorer (PDGFRs) og deres ligander, blodpladeafledte vækstfaktorer (PDGF’er) spiller en kritisk rolle i mesenchymal cellemigration og proliferation. Abnormiteter af PDGFR /PDGF menes at bidrage til en række humane sygdomme og især malignitet [31].

MikroRNA’er er små ikke-kodende RNA, der viser deregulering i de fleste kræftformer. Der er stigende tegn på, at de spiller væsentlige roller i patogenesen og prognose af menneskelige maligniteter og i modstanden mod kemoterapeutiske medikamenter [32,33]. Tumornekrosefaktor-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) udløser apoptose i tumorceller, men når det anvendes alene, det er ineffektivt til at behandle TRAIL-resistente tumorer. Denne modstand er en udfordring for TRAIL-baserede anti-behandlinger mod kræft. I denne undersøgelse fandt vi, at MIR-34a og MIR-34c er stærkt downmodulated i både NSCLC celler og lungetumorer sammenlignet med normale væv. Tvungen ekspression af MIR-34a og MIR-34c nedreguleret PDGFR-α og PDGFR-β-mRNA og protein niveauer. Luciferase og Western blot eksperimenter viste, at PDGFR-α og PDGFR-β er direkte mål for miR-34a og miR-34c, men ikke af miR-34b. Modstanden i mange typer af kræft til konventionelle kemoterapi er en vigtig faktor underminerer vellykket kræftbehandling. AKT aktivering bidrager også til tumorigenese og tumormetastase, og som senest vist, resistens over for kemoterapi [26,34]. Som følge heraf har både

in vitro

in vivo

studier kombinerer småmolekylære inhibitorer af PI3K /Akt pathway med standard kemoterapi har vist sig gode dæmpning kemoterapeutisk modstand. Specifikt inhiberende AKT aktivitet kan være en anvendelig metode til behandling af kræft og øge effektiviteten af ​​kemoterapi.

Proteinkinaser er vigtige regulatorer af de fleste cellulære signalveje. Blandt dem, receptor (RTK’er), såsom PDGFR, spiller afgørende roller i at fremme cellevækst og proliferation ved at transducere ekstracellulære stimuli til intracellulære signalsystemer kredsløb [35]. En fremtrædende del af intracellulær signalering maskiner er PI3K /Akt (PKB) /pattedyr mål for rapamycin (PI3K /Akt [PKB] /mTOR) vej [36,37]. Aberrant aktivering af denne pathway ved mutation af enhver af multiple gener vides at forekomme i de fleste humane cancere gennem forskellige mekanismer [38,39]. I et tidligere arbejde [26], viste vi, at MET, gennem aktivering af PI3K /AKT-vejen, induceret tumorigenese og TRAIL resistens i NSCLC. Derfor fremsatte vi den hypotese, at PDGFR-α /β, gennem aktivering af AKT pathway bør inddrages i TRAIL-induceret apoptose. Faktisk overekspression af miR-34a og miR-34c eller nedregulering af PDGFR-α /β af siRNA’er, stærkt forøget respons semi-resistente NSCLC celler til Trail-induceret apoptose. Vigtigere, kombineret behandling af et PDGFR inhibitor med TRAIL, øget apoptose og nedsat celleproliferation, som vurderet ved caspase 3/7 assay og MTT-assays. Taget sammen antyder resultaterne, at kombineret behandling af TRAIL med PDGFR-inhibitorer kunne sensibilisere en delmængde af lungetumorer, udtrykker PDGF-receptorer, til lægemidlet. Endvidere er det velkendt, at PI3K /AKT, samt de ERK1 /2 veje regulerer cellulær migration og invasion af forskellige cancere [40,41]. Her, rapporterede vi, at MIR-34a og MIR-34c overekspression eller PDGFR-α /β silencing inhiberede migration og invasion kapacitet Calu-6 og H1703 celler, sammenlignet med celler transficeret med en kodet miR eller siRNA kontrol. Tvungen ekspression af PDGFR-α eller PDGFR-β delvist restaureret NSCLC migration og invasion støtte, at reguleringen af ​​ekspressionen af ​​disse receptorer ved miR-34a /c spiller en vigtig rolle i NSCLC tumorigenese. anerkender dog, at andre miR-34a /c-mål, herunder c-Met [16] og AXL [42] kunne også være involveret. Mens dette manuskript var under forberedelse Silber et al. rapporterede, at miR-34a udtryk var lavere i proneural gliomer i forhold til andre tumor undertyper og identificeret PDGFR-α som et direkte mål for miR-34a [43]. Her rapporterer vi, at ikke kun miR-34a, men miR-34c nedregulerer også PDGFR-α i NSCLC celler. Desuden har vi vise, at PDGFR-β er en miR-34a /c direkte mål, mens vi ikke se nogen væsentlig indvirkning på ekspressionen af ​​PDGFR-α og PDGFR-β efter miR-34b håndhævet udtryk. Bemærkelsesværdigt, vores undersøgelse viser, at inhibering eller nedregulering af PDGFR-α og PDGFR-β ved MIR-34a /c antagoniserer tumorigenicitet og øger følsomheden over for TRAIL-induceret celledød med vigtig terapeutisk anvendelse til fremtidig antitumorterapi for lungekræft.

Materialer og metoder

lungekræft cellelinjer og vævsprøver

Menneskelig H460, A549, H1299, H1703 cellelinjer blev dyrket i RPMI medium indeholdende 10% varme-inaktiveret føtalt bovint serum (FBS) og med 2 mM L-glutamin og 100Uml-1 penicillin-streptomycin. Calu-6 celler blev dyrket i MEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin og 100Uml-1 penicillin-streptomycin. 9 lungetumorer (herunder adenocarcinom og pladecellekræft) og deres normale modstykker blev venligst stillet til rådighed af Dr. S.P. Nana-Sinkam, pulmonal, Allergi, Critical Care og Sleep Medicine, The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Columbus, OH. 48 lunge normale og tumor vævsprøver blev leveret fra Patologisk Institut, Ohio State University. Alle humane væv blev opnået ifølge en protokol godkendt af Ohio State Institutional Review Board.

Luciferase assay

3’UTR’er af de humane PDGFRA og PDGFRB gener, blev PCR-amplificeret under anvendelse af følgende primere:

PDGFR-α FW 5 ‘TCTAGACCG GCCTGAGAAACACTATTTGTG 3’

PDGFR-α RW 5’TCTAGAACATGAACAGGGGCATTCGTAATACA 3 “

PDGFR-β FW 5’TCTAGAAAAGAGGGCAAATGAGATCACCTCCTGCA 3 ‘

PDGFR-β RW 5’TCTAGATATTGAGAACCCACTCTCCCTCCTTGGA 3′

og klonet nedstrøms for Renilla luciferase stopkodonen i pGL3-kontrol vektor (Promega). Disse konstruktioner blev anvendt til at generere, ved omvendt PCR, de p3′-UTRs- mutant-plasmider under anvendelse af følgende primere:

PDGFR-α mut1 FW 5’ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATCGCCTCG 3′

PDGFR-α mut1 RW 5’CGAGGCGATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT

PDGFR-αmut2 FW: 5 ‘ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATGGTCGTTTATATTT 3’

PDGFR-αmut2 RW: 5 ‘AAATATAAACGACCATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT 3’

PDGFR-β Mut FW 5 ‘ -ATGGGGGTATGGTTTTGTCAGACCTAGCAGTGAC-3 ‘

PDGFR-β Mut RW 5′-GTCACTGCTAGGTCTGACAAAACCATACCCCCAT-3′

Calu-6 celler blev cotransficeret med 1 pg af p3’UTR-PDGFR-α, p3 ‘UTR-PDGFR-β eller med p3’UTRmut-PDGFR-α og p3’UTRmut-PDGFR-β, 1 ug af et Renilla luciferase ekspressionskonstruktion pRL-TK (Promega) under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Celler blev høstet 24 timer efter transfektion og analyseret med Dual Luciferase Assay (Promega) ifølge producentens instruktioner. Tre uafhængige forsøg blev udført tredobbelt.

Western blot-analyse

Total proteiner fra NSCLC blev ekstraheret med radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) buffer (0,15 mM NaCl, 0,05mM Tris-HCI, pH 7,5, 1% Triton, 0,1% SDS, 0,1% natriumdeoxycholat og 1% Nonidet P40). Prøveekstrakt (50 ug) blev opløst på 7,5-12% SDS-polyacrylamidgeler (PAGE) under anvendelse af en mini-gel apparat (Bio-Rad Laboratories) og overført til Hybond-C extra nitrocellulose. Membraner blev blokeret i 1 time med 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand indeholdende 0,05% Tween 20, inkuberet natten over med primært antistof, vasket og inkuberet med sekundært antistof, og visualiseret ved kemiluminescens. De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-PDGFR-α, anti-PDGFR-β, anti-ERK1 /2, anti-p-ERK’er, anti-Pakt, anti-total AKT, anti-GAPDH antistoffer (Cell Signaling). Et sekundært anti-kanin eller anti-muse-immunglobulin G (IgG) antistof-peroxidasekonjugat (Chemicon) anvendt.

Real-time PCR

Real-time PCR blev udført under anvendelse af en standard TaqMan PCR Kit-protokol på et Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). Den 10 pi PCR-reaktion indeholdt 0,67 pi RT produkt, 1 pi TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,2 mM TaqMan probe, 1,5 mM fremadrettet primer og 0,7 mM revers primer. Reaktionerne blev inkuberet i en 96-brønds plade ved 95

° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler af 95

° C i 15 s og 60

° C i 1 min. Alle reaktioner blev kørt tredobbelt. Tærskelcyklen (CT) er defineret som den fraktionerede cyklusnummer hvor fluorescensen passerer fast tærskelværdi. Den sammenlignende CT fremgangsmåde til relativ kvantisering af genekspression (Applied Biosystems) blev anvendt til bestemmelse miRNA ekspressionsniveauer. Y-aksen repræsenterer den 2 (-ΔCT), eller den relative ekspression af de forskellige Mirs. Mirs ekspression blev beregnet i forhold til U44 og U48 rRNA. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer for hvert datapunkt, og blev udført dataanalyse ved hjælp af software (Bio Rad).

celledød og celleproliferation kvantificering

Til påvisning af caspase 3/7 aktivitet blev celler dyrket i plader med 96 brønde i tre eksemplarer, behandlet med TRAIL (100-150ng /ml) og analyseret ved anvendelse af Caspase-Glo 3/7 Assay kit (Promega) ifølge producentens instruktioner. Kontinuerlige variabler er udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse (s.d.). Cellelevedygtighed blev undersøgt med 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-dipheniltetrazolium (MTT)-Cell Titer 96 vandigt One Solution celleproliferationsassay (Promega) ifølge fabrikantens protokol. Metabolisk aktive celler blev detekteret ved tilsætning af 20 pi MTT til hver brønd. Efter 1 h inkubation blev pladerne analyseret i en Multilabel Counter (Bio-Rad Laboratories).

Anti-PDGFR-a- og anti-PDGFR-β siRNA’er transfektions Salg

Celler blev dyrket til 50% konfluens og forbigående transficeret i 72 timer under anvendelse af lipofectamin 2000 100 nM anti-PDGFR-α og /eller med 100 nM anti-PDGFR-β SMARTpool siRNAs eller kontrol siRNA’er (Dharmacon), en pulje af fire målspecifik 20-25 nt siRNAs designet at vælte genekspression.

miRNA låst nukleinsyre in situ hybridisering af formalin-fikserede, paraffinindlejret vævssektion

In situ-hybridisering (ISH) blev udført på deparaffinerede humane lungevæv under anvendelse af tidligere offentliggjort protokol [44], som omfatter en fordøjelse i pepsin (1,3 mg /ml) i 30 minutter. Sekvensen af ​​proben indeholdende den dispergerede låst nukleinsyre (LNA) modificerede baser med digoxigenin konjugeret til 5′-enden var: 5’ACAACCAGCTAAGACACTGCCA 3 ‘. Probe-cocktail og væv miRNA blev co-denatureret ved 60

° C i 5 minutter, efterfulgt af hybridisering ved 37

° C natten over og en stringens vask i 0,2 X SSC og 2% bovint serumalbumin ved 4

° C i 10 minutter. 0,05.