PLoS ONE: forbedrende virkninger af Dimetylthiourea og N-acetylcystein på Nanopartikler induceret Cyto-Genotoksicitet i Human Lung Cancer Cells-A549

Abstrakt

Vi studerer den forbedrende potentiale dimetylthiourea (DMTU), en OH

• radikal pelsjæger og N-acetylcystein (NAC), en glutathion forløber /H

2O

2 ådselsæder mod titandioxid nanopartikler (TiO

2-NPS) og multi-walled carbon nanorør (MWCNTs) induceret cyto-genotoksicitet i dyrkede humane lungecancer celler-A549. Cytogenotoxicity blev induceret ved udsættelse af cellerne til udvalgte koncentrationer (10 og 50 ug /ml) af enten TiO

2-NPs eller MWCNTs i 24 timer. Anti-cytogenotoxicity virkninger af DMTU og NAC blev undersøgt i to grupper, dvs. behandling af 30 minutter før toksisk insult (kortvarig eksponering), mens den anden gruppe modtog DMTU og NAC behandling under nanopartikler eksponering, dvs. 24 timer (langsigtet udsættelse). Der blev foretaget undersøgelser for celle levedygtighed, generering af reaktive ilt arter (ROS), mikrokerner (MN), og ekspressionen af ​​markører for oxidativt stress (Hsp27, CYP2E1), genotoksicitet (P

53) og CYP2E1 afhængig n- nitrosodimethylamine- demetylase (NDMA-d) aktivitet. Generelt blev behandlingen af ​​både DMTU og NAC sig at være effektivt betydeligt mod TiO

2-NPs og MWCNTs induceret cytogenotoxicity i A549 celler. Langtidsbehandling af DMTU og NAC under giftige fornærmelser har vist bedre forebyggelse end kortsigtet forbehandling. Selv celler reagerede betydeligt til både DMTU og NAC, men svarene var kemisk specifikt. Dels blev TiO

2-NPS inducerede toksiske reaktioner medieret gennem OH

• radikaler generation og reduktion i antioxidant forsvarssystem. Mens der i tilfælde af MWCNTs, bivirkninger var primært på grund af ændring /hæmmer den enzymatiske antioxidant system. Data indikerer anvendeligheden af ​​menneskelig lungekræft celler-A549 som en pre-screening værktøj til at identificere målet specifikke profylaktiske og terapeutiske potentiale af narkotika kandidat molekyler mod nanopartikler inducerede cellulære skader

Henvisning:. Srivastava RK, Rahman Q, Kashyap MP, Lohani M, Pant AB (2011) forbedrende virkninger af Dimetylthiourea og N-acetylcystein på Nanopartikler induceret Cyto-Genotoksicitet i human Lung Cancer Cells-A549. PLoS ONE 6 (9): e25767. doi: 10,1371 /journal.pone.0025767

Redaktør: Neeraj Vij, Johns Hopkins School of Medicine, USA

Modtaget: May 10, 2011; Accepteret: 12. september 2011; Udgivet: 29 september, 2011

Copyright: © 2011 Srivastava, et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Økonomisk støtte blev modtaget fra Rådet for Videnskabelig Industrial Research, New Delhi, (SIP-08). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Intracellulære biologiske vekselvirkninger metal oxide nanopartikler og carbon-nanorør er blevet vist i litteraturen og markeret alarmerende for sikkerheden [1], [2]. Titanium dioxid nanopartikler (TiO

2 -NPs) og multiwalled kulstofnanorør (MWCNTs) er kendt for at fremkalde cytotoksisk og genotoksiske reaktioner i både

in vitro

[3], [4], [5], og jeg

n vivo

modeller [6], [7]. Generelt ROS-generering medieret oxidativ stress og nedsat antioxidant status er blevet foreslået som hovedårsag til cytotoksicitet og genotoksicitet nanopartikler [8], [9], [10]. Desuden har antallet af faktorer, herunder partikelstørrelse, kemiske sammensætning og overflade afgifter mv også spille rolle at bestemme omfanget af nanopartikler toksicitet [11], [12], [13], [14]. Nanopartikler inducerer ROS-generering ved aktivering af enzymer af cytochrom P450’er familie [15], [16] og /eller ved at forstyrre mitochondrial elektrontransportkæden funktion [9]. Associeringen af ​​ROS-generering med inducerede niveauer af varmechokprotein 27 (HSP27), cytochrom P450 2E1 (CYP2E1) og P

53 er blevet etableret som markører for kemisk induceret oxidativt stress, apoptose og genotoksicitet [10], [17] , [18].

En af de effektive måder at forhindre ROS medierede cellulære skade er kosten eller farmaceutiske forøgelse af frie radikaler. Derfor er der gjort forsøg på at forhindre /gendannelse nanopartiklerne inducerer cytogenotoxicity hjælp radikalrensemidler, såsom desferoxamine [8], antioxidanter – resveratrol [19] og N-acetlylcysteine ​​(NAC) [4], [20], [21], i forskellige celle systemer af menneskers og dyrs oprindelse. Imidlertid har ændringer i niveauerne af ekspression (mRNA og protein) af markører, der er involveret i oxidativ stress og genotoksicitet i dyrkede celler udsat for nanopartikler ikke undersøgt hidtil. Således blev de aktuelle undersøgelser havde til formål at undersøge de mekanistiske indsigt TiO

2-nationale parlamenter og MWCNTs induceret oxidativ stress og cyto-genotoksicitet i human lungekræft celler A549 og forbedrende effekt af frie radikaler pelsjæger og antioxidanter DMTU og NAC hhv. DMTU, blev udvalgt i undersøgelsen, eftersom denne thiogroup indeholdende forbindelse har stor reaktivitet over OH

• radikaler på grund af de ekstremt favorable elektrondonerende karakteristika sulfhydrylgruppen; således, kendt som potentiel hydroxylradikal scavenger [22]. Den anden forbindelse, der anvendes, dvs., NAC er en precursor for glutathion (GSH), er et vigtigt cellulært antioxidant og vides at spille en central rolle i beskyttelsen af ​​celler mod oxidativt stress ved at hæmme dannelsen af ​​H

2O

2 under in vitro-betingelser [23]. NAC er også kendt at forbedre cellulær GSH niveau ved at dirigere cystin i GSH syntesevejen, fordi cystin er en almindelig precursor for både NAC og GSH [24].

Resultater

Karakterisering af nanopartikler

de gennemsnitlige hydrodynamiske diametre af TiO

2-NPs og MWCNTs suspension i komplet medium var 417,7 nm og 401,3 nm, og zeta (f-) potentialer blev beregnet som (-) 7,83 mV og (-) 14.4 mV (figur 1 a (I, II) b (I, II)). TEM undersøgelser viser partikelstørrelsesområdet 5-20 nm i diameter og 300-2000 nm i længde for MWCNTs (data er allerede blevet offentliggjort af os) [15]. TiO

2-NP’er (anatase) anvendt i undersøgelsen var på 99,7% renhed og partikelstørrelsen ligger i området mellem 5-25 nm i TEM undersøgelser. Partiklerne blev klæbet på celleoverfladen mellem mikrovilli og pseudopodes, når de inkuberes i 24 timer, derefter internaliseres i små vakuoler på kortikale cytoplasmaet (figur 2 a b). Vi har ikke observere nogen betydelig ændring i hydrodynamisk partikel (TiO

2-NPs og MWCNTs) størrelse i overværelse af DMTU og NAC under DLS måling. Efter sterilisering blev endotoksin ikke påvist i både nanopartiklerne ved LAL-test. Detektionsgrænsen var 0,03 EU /ml

Størrelse distribution og zeta potentiale TiO

2-nationale parlamenter (a, I II). og MWCNTs (B, I ​​ II) blev bestemt ved hjælp af dynamisk lysspredning og fase analyse lysspredning (PALS) i et Zetasizer Nano-ZS, Model ZEN3600.

TEM mikrofotografier viser internalisering af TiO

2-nationale parlamenter (a, b) i human lungecancer celler-A549. Pile angiver nanopartiklerne blev overholdt på celleoverfladen mellem mikrovilli og pseudopodes inden for få minutter af tid (a) og efterfølgende internaliseret i små vakuoler dybt i cytoplasmaet, når observeret ved 24 timer (b).

genoprettelse af virksomhedens rentabilitet celle

tendensen til restaurering i celle levedygtighed var ens for alle tre analyser, der anvendes i undersøgelsen. Imidlertid blev MTT-assay fundet at være mest følsomme sammenlignet med de andre assays nemlig., NRU og frigivet LDH. Resultaterne af DMTU eller NAC induceret restaurering i procent levedygtighed A549-celler udsat for nanopartikler er opsummeret i figur 3 a b. Den kortsigtede forbehandling (30 minutter) af DMTU viser signifikant beskyttelse i levedygtighed A-549 celler udsat for TiO

2-nationale parlamenter (10, 50 ug /ml), mens svaret fra NAC forbehandling var ikke-signifikant mod TiO

2-NP-induceret tab af cellelevedygtighed. Celler, der modtager lang sigt (24 h) eksponering af DMTU (10 mM) eller NAC (2 mM) sammen med TiO

2-nationale parlamenter (10, 50 ug /ml) eksponering har vist mere eller mindre samme størrelsesorden og tendenser observeret på kort sigt eksponering (figur 3 a). Contemporary til dette, blev kortvarig eksponering af NAC fundet at være signifikant effektiv mod MWCNTs eksponering, hvorimod, DMTU ikke var effektiv. Langvarig eksponering af både NAC og DMTU har vist lignende tendens og effekt mod MWCNTs eksponering, som var i tilfælde af kortvarig eksponering (Figur 3 b). Generelt langtidseksponering af DMTU og NAC har vist lidt bedre restaurering i cellelevedygtighed end kort sigt.

(a) kort sigt gruppe blev celler forbehandlet med enten DMTU eller NAC i 30 minutter efterfulgt af udsættelse af TiO

2-NP’er (10 50 pg /ml) i 24 timer. På lang sigt gruppe blev celler modtager et co-eksponering (24 h), i DMTU /NAC og TiO

2-nationale parlamenter (10 50 ug /ml). Celler blev derefter analyseret for DMTU /NAC medieret genopretning i cellelevedygtigheden reduceret på grund af TiO

eksponering 2-NP’er. Alle værdier er gennemsnit ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs TiO

2-nationale parlamenter eksponering). ## P 0,01 (TiO

2-nationale parlamenter eksponering Vs DMTU /NAC behandling). (B) På kort sigt gruppe blev celler forbehandlet med enten DMTU eller NAC i 30 minutter efterfulgt af eksponering af MWCNTs (10 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sigt gruppe blev celler modtager et co-eksponering (24 h), DMTU /NAC og MWCNTs (10 50 ug /ml). Celler blev derefter analyseret for DMTU /NAC medieret genopretning i cellelevedygtigheden reduceret på grund MWCNTs eksponering. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs MWCNTs eksponering). ## P. 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling)

ROS generation

statistisk signifikant (p 0,01) blev observeret ROS generation i A549 celler, der modtager TiO

2-NPs og MWCNTs (10 50 pg /ml) i 24 timer. Både på kort sigt (30 min) og lang sigt (24 h) behandling af DMTU og NAC viste sig at være effektiv signifikant (p 0,01) i faldende ROS-niveauer. Men størrelsen af ​​reduktionen af ​​ROS-niveauer var større i langtidsbehandling. Langtidsbehandling af NAC var mere effektivt end DMTU (Figur 4 a b). Vi observerede ikke nogen stigning i fluorescensintensitet som følge af suspenderede nanopartikler i dyrkningsmediet (uden celler). Ligeledes blev der ikke fluorescens stigning observeret med DCFH-DA farvestof alene i dyrkningsmediet (uden celler). Observationerne viser, at ændringerne i fluorescensintensiteten var på grund af intracellulær ROS genereret i kun A549 celler.

ROS generation blev påvist bruger ‘2, 7-dichlorofluorescin diacetat (DCFH-DA) farvestof. (A) I kortsigtet gruppe blev celler forbehandlet med enten DMTU eller NAC i 30 minutter efterfulgt af eksponering af TiO

2-NP’er (10 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sigt gruppe blev celler modtager et co-eksponering (24 h), i DMTU /NAC og TiO

2-nationale parlamenter (10 50 ug /ml). Celler blev derefter analyseret for DMTU /NAC medieret genopretning i niveauerne af intracellulær ROS, som blev induceret ved eksponering af TiO

2-NP’er. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs TiO

2-nationale parlamenter eksponering). ## P 0,01 (TiO

2-nationale parlamenter eksponering Vs DMTU /NAC behandling). Den positive kontrolgruppe blev bestående af A549-celler forbehandlet (1h) med 500 pM af H

2O

2. (B) På kort sigt gruppe blev celler forbehandlet med enten DMTU eller NAC i 30 minutter efterfulgt af eksponering af MWCNTs (10 50 ug /ml) i 24 timer. På lang sigt gruppe blev celler modtager et co-eksponering (24 h), DMTU /NAC og MWCNTs (10 50 ug /ml). Celler blev derefter analyseret for DMTU /NAC medieret genopretning i niveauerne af intracellulær ROS, som blev induceret ved eksponering af MWCNTs. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs MWCNTs eksponering). ## P 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). Den positive kontrolgruppe blev bestående af A549 celler forbehandlet (1h) med 500 uM H

2O

2.

Cytokinese blokeret mikronukleusanalysen (CBMN-assay)

Resultater af MN-dannelse i A549 celler er vist i figur 5 a b. Eksponering af både TiO

2 og MWCNTs inducerer betydeligt antal MN i A549 celler i 24 timer af eksponering. I tilfælde af TiO

2-NP, svar var dosisafhængig dvs. (12,66 ± 0,66 17,33 ± 0,33) ved 10 50 ug /ml, hvorimod den lavere dosis på MWCNTs (10 ug /ml) inducerede mere MN (16.00 ± 0.57) end højere dosis (50 ug /ml) dvs. (13,66 ± 0,33). Både DMTU og NAC viste sig at være effektive til at reducere MN signifikant (p 0,01). Svaret fra DMTU var større mod TiO

2-nationale parlamenter end MWCNTs, mens NAC har vist bedre resultater mod MWCNTs. Selvom virkningen af ​​både DMTU og NAC var statistisk signifikante (p 0,01) men værdierne var stadig større end de ikke-eksponerede kontrolceller hele koncentrationerne eksponering (figur 5 A b). Forskellen i MN induktion var ubetydelig mellem scavenger behandlet Vs ikke-scavenger behandlede grupper

(a) Cellerne blev eksponeret for TiO

2-NP’er (10 50 pg /ml). Med eller uden DMTU (10 mM) og NAC (2 mM) i 24 timer. Ethylmethansulfonat (6 mM) blev anvendt som en positiv kontrol. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien af ​​tre dias. En alt 1000 bi-nukleeret (BN) celler med veldefineret cytoplasma blev scoret. Parallelle sæt blev også kørt under identiske betingelser ved at eksponere cellerne kun med et af DMTU eller NAC. Denne gruppe blev anvendt til at sammenligne data mellem scavenger behandlet Vs ikke-scavenger behandlede celler. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs TiO

2-nationale parlamenter eksponering). ## P 0,01 (TiO

2-nationale parlamenter eksponering Vs DMTU /NAC behandling). (B) celler blev udsat for MWCNTs (10 50 ug /ml) med eller uden DMTU (10 mM) og NAC (2 mM) i 24 timer. Ethylmethansulfonat (6 mM) blev anvendt som en positiv kontrol. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien af ​​tre dias. En alt 1000 bi-nukleeret (BN) celler med veldefineret cytoplasma blev scoret. Parallelle sæt blev også kørt under identiske betingelser ved at eksponere cellerne kun med et af DMTU eller NAC. Denne gruppe blev anvendt til at sammenligne data mellem scavenger behandlet Vs ikke-scavenger behandlede celler. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter

** P. 0,01 (ueksponerede kontrol Vs MWCNTs eksponering). ## P. 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling)

Western blot-analyse

Generelt eksponering af både (TiO

2-NPs MWCNTs ) ved 50 ug /ml inducere signifikant opregulering af genotoksiske og oxidativ stress markørproteiner, nemlig, P

53 (3,61 ± 0,40 . 3,24 ± 0,26 gange), CYP2E1 (2,62 ± 0,30 2,02 ± 0,39 gange) , HSP27 (1,69 ± 0,47 2,56 ± 0,34 gange) hhv. Expression niveauer af P

53 protein viste sig at blive reduceret signifikant (p 0,01) efter behandlingen af ​​både DMTU og NAC. Men svaret var, mere intens i A549 celler, der modtager eksponeringen af ​​TiO

2-NP’er. I tilfælde af CYP2E1, celler udsat for MWCNTs vist bedre reaktionsevne til DMTU og NAC med mere intense effekter af NAC. I modsætning til dette er virkningen af ​​DMTU var ikke-signifikant i de celler udsat for TiO

2-NP’er. Imidlertid kunne både DMTU og NAC ikke genoprette ekspressionen af ​​HSP27-protein signifikant i celler udsat for TiO

2-NP’er /MWCNTs (figur 6 a b).

a (i) vurdering af ændret udtryk for proteiner involveret i induktionen af ​​oxidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksicitet (P

53) i A549-celler udsat for TiO

2-NP’er (50 ug /ml) i 24 timer. GAPDH blev anvendt som intern kontrol for at normalisere dataene. Lane (1) ueksponerede kontrol (2) 50,0 ug /ml TiO

2-NP’er (3) 50,0 ug /ml TiO

2-NP’er + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml TiO

2-NP’er + NAC (2 mM). (II) Relativ kvantificering (fold ændring) af proteiner involveret i induktionen af ​​oxidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksicitet (P

53) i A549-celler udsat for TiO

2-NP’er i 24 timer. GAPDH blev anvendt som intern kontrol for at normalisere dataene. Kvantificering blev udført i Gel Documentation System (Alpha Innotech, USA) ved hjælp af AlphaEase

TM FC Standalone v.4.0 software. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs TiO

2-nationale parlamenter eksponering). ## P 0,01 (TiO

2-nationale parlamenter eksponering Vs DMTU /NAC behandling). b (I) Vurdering af ændrede udtryk for proteiner involveret i induktionen af ​​oxidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksicitet (P

53) i A549-celler udsat for MWCNTs (50 ug /ml) i 24 timer. GAPDH blev anvendt som intern kontrol for at normalisere dataene. Lane (1) ueksponerede kontrol (2) 50,0 ug /ml MWCNTs (3) 50,0 ug /ml MWCNTs + DMTU (10 mM) (4) 50.0μg /ml MWCNTs + NAC (2 mM). (III) Relativ kvantificering (fold ændring) af proteiner involveret i induktionen af ​​oxidativt stress (HSP27 og CYP2E1) og genotoksicitet (P

53) i A549-celler udsat for MWCNTs i 24 timer. GAPDH blev anvendt som intern kontrol for at normalisere dataene. Kvantificering blev udført i Gel Documentation System (Alpha Innotech, USA) ved hjælp af AlphaEase

TM FC Standalone v.4.0 software. Alle værdier er middelværdier ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs MWCNTs eksponering). ## P 0,01 (MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling)

CYP2E1 afhængig n- nitrosodimethylamin-demethylase (NDMA-d) aktivitet

De data CYP2E1 afhængig katalytisk aktivitet. er præsenteret i figur 7. Den katalytiske aktivitet viser lignende tendenser som observeret i western blot analyse for proteinekspression for CYP2E1 i celler udsat for TiO

2-NPs og MWCNTs (50 ug /ml). Disse ændringer var signifikant (p 0,001) sammenlignet med ueksponerede kontrolgruppe samt til celler behandlet med DMTU /NAC kun dvs. 7,54 + 0,86 og 10,96 + 1,20 nmol /mg protein henholdsvis. Selvom begge de skraldemanden viser betydelig restaurering i den enzymatiske aktivitet i celler udsat for TiO2-NPs og MWCNTs, men størrelsen o virkningen var mere i tilfælde af NAC-behandling. Behandling af DMTU eller NAC alene viste ikke nogen effekt på den enzymatiske aktivitet sammenlignet med ueksponerede kontrolgruppe. Ethanol (10 mM), en kendt inducer af CYP2E1 viser stærkt signifikant (p 0,001). Øge NDMA-d-aktivitet (figur 7)

Alle værdier er gennemsnit ± S.E. af 3 eksperimenter.

** P 0,01 (ueksponerede kontrol Vs TiO

2 -NPs /MWCNTs eksponering). ## P 0,01 (TiO

2-nationale parlamenter /MWCNTs eksponering Vs DMTU /NAC behandling). Specifik aktivitet udtrykkes i nmol HCHO /min /mg protein. Ethanol (100 mM), en kendt inducer af CYP2E1, blev anvendt som positiv kontrol.

Diskussion

Reaktive oxygenarter (ROS) medieret oxidativ stress er blevet foreslået en blandt nøglen begivenheder udløser nanopartikler inducerede cyto-genotoksicitet [25]. Vi har også observeret en dosisafhængig ROS produktion i A549 celler enten udsat for TiO

2-NPs eller MWCNTs ved 10 50 ug /ml i 24 timer. Det vigtigste ROS i redox signalering menes at være H

2O

2 /OH

• radikal. Således at bekræfte ROS redox signalering blev cellerne udsat for H

2O

2 (500 uM) i 1 time under identiske betingelser, der blev serveret som positiv kontrol også. H

2O

2 inducerede lignende svar til ROS produktion som i tilfælde af nanopartikler, hvilket tyder på konsekvenserne af lignende signaltransduktionsveje. Reduktionen af ​​ROS med pre /co-behandling af DMTU og NAC i A549 celler, bekræfter yderligere inddragelse af ROS i processen med toksicitet og er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [4], [8]. NAC, en forløber for glutathion (GSH), er en vigtig cellulær antioxidant og spiller en stor rolle i at beskytte cellerne mod oxidativt stress og hæmmer dannelsen af ​​H

2O

2

in vitro

[ ,,,0],23], [26]. NAC behandling forårsager forbedring af cellulær GSH-niveau ved at dirigere cystin i til GSH syntesevejen, fordi cystin er en almindelig precursor for både NAC og GSH [24]. Mens den store reaktivitet af DMTU molekylet mod OH

• skyldes de ekstremt favorable elektrondonerende karakteristika sulfhydrylgruppen [22].

I den foreliggende undersøgelse, cytotoksicitet TiO

2-NPs og MWCNTs fandtes at være dosis og tidsafhængig. I tilfælde af TiO

2-NP, behandling med DMTU og NAC reducerer den cytotoksiske virkning, hvilket antyder, at både OH

• radikaler (ROS) generation og reduktion i antioxidantforsvarssystem er ansvarlige for den nedsatte levedygtighed. Mens der i tilfælde af MWCNTs cytotoksiciteten var signifikant reduceret med NAC behandling. Det er bemærkelsesværdigt, at DMTU, en mere specifik hydroxyl radikaler, ikke var effektive til opfangning hydroxylradikaler i vores målinger. Dette forenkler at MWCNTs forårsager toksicitet ved at ændre /hampaering den enzymatiske antioxidant-systemet og ikke ved direkte at inducere OH

• radikaler i A549-celler. Resultaterne antyder, at den del af ROS, der inhiberes af NAC, men ikke af DMTU, kunne være en anden art af frie radikaler og også forskellen i opførsel af både (TiO

2 og MWCNTs) kunne være på grund af deres forskel i overfladestruktur [27], længde [28], og tilstedeværelsen af ​​metalkatalysator [29] etc. Vi har også rapporteret tidligere, at MWCNTs signifikant reduceret glutathion i dosis og tidsafhængig måde [15]. Det er blevet postuleret, at tabet af GSH kan kompromittere cellulære antioxidantforsvar og føre til induktion af ROS [30].

Endvidere NAC behandling billede tilstrækkelig stærk antioxidant forsvarssystem, resulterer den forøgede cellelevedygtighed af celler eksponeret for TiO

2 og MWCNTs. Lignende slags effekt blev observeret med human lunge epitel og luftvejs epitelial (HEP-2) cellelinie, ved samtidig behandling med antioxidant NAC og Resverartrol mod ZnO og CuO nanopartikler henholdsvis [19], [21].

Begge typer af nanopartikler (TiO

2 og MWCNTs) er kendt for at inducere Mikrokerner (MN) på dosisafhængig måde, som er veldefineret biomarkør for genotoksicitet assay [31]. Vores fund af MN-induktion er godt overens med tidligere undersøgelser med nano-TiO

2 i lymfoblastoide celler [32], og i rotte lungeepitelceller udsat for MWCNTs [33]. Den beskyttende virkning af DMTU (10 mM) og NAC (2 mM) på MN-induktion kunne observeres tydeligt i de foreliggende undersøgelser (figur 5 A b). Vores MN undersøgelser yderligere styrke den rolle, oxidativt stress i genotoksicitet fremkaldt af TiO

2-NPs og MWCNTs i A549 celler. I den tidligere undersøgelse crocidoloite og chrysotil asbestfibre også er blevet rapporteret at inducere MN, som i væsentlig grad falde efter behandling med NAL, en syntetiseret salt af N-acetylcystein (0,2 mM) og DMTU (20 mM) i humane mesotelceller [34].

i de foreliggende undersøgelser blev western blot analyse udført for at vurdere den ændrede udtryk for proteiner såsom HSP27 og CYP2E1, indikatorer for oxidativ stress, og P

53 som en biomarkør for genotoksicitet. Varmechokproteiner (HSP’er) omfatter flere forskellige familier af proteiner, der induceres som respons på mange forskellige fysiologiske og miljømæssige fornærmelser. Et sådant protein er HSP27, som induceres stærkt under stressbetingelser. HSP27 er kendt for at interferere med ROS inducerede nøglekomponenter i apoptotisk signalvej, og er korreleret med øget overlevelse som reaktion på cytotoksiske stimuli [18]. Vores undersøgelse afslører, at ved 50 ug /ml koncentration, både nanopartiklerne (TiO

2-NPS og MWCNTs) inducerede signifikant ekspression af HSP27, hvilket antyder, at cellerne var under stress. Behandlingen af ​​DMTU og NAC viste ikke signifikante ændringer i nanopartiklerne inducerede udtryk for HSP27. Den angiver, at enten celler er stadig under stressbetingelser eller DMTU og NAC reducere oxidativt stress ved en anden rute under vore eksperimentelle betingelser. Yderligere eksperimenter med forskellige udvalg af tidspunkter, eksponeringskoncentrationer mv bliver udført for at udforske betydningen af ​​forhøjede niveauer af HSP27 i tilstedeværelse af DMTU og NAC i celler udsat for disse nanopartikler.

opregulering i protein ekspression af CYP2E1 er blevet korreleret med induceret dannelse af ROS, forhøjelse af lipidperoxidation og cytotoksisk skade i alkohol induceret hepatotoxcity [35], [36]. Vi rapporterer TiO

2-NPs og MWCNTs induceret induktion i CYP2E1 specifikke NDMA-d katalytisk aktivitet og betydelig restaurering af to bekæmper-DMTU og NAC i human lungecancer celler-A549. Til den viden, der er nanopartikler inducerede protein udtryk og aktivitet af CYP2E1 og efterfølgende inducerede niveauer af ROS bliver præsenteret for første gang i menneskets lungekræft celler A549. Inducerede niveauer af CYP2E1 protein-ekspression og NDMA-d aktivitet i de nuværende undersøgelser understøtter også vores tidligere fund i de samme celler, der MWCNTs inducerer ROS generation af blandet funktion oxidase aktivitet snarere end mitokondrie forstyrrelser [15]. Efter eksponering af TiO

2-NPs og MWCNTs, blev induceret ekspression og aktivitet af CYP2E1 observeret, som kan korreleres med ROS induktion og oxidativ stress. Som vores data for ROS-generering målt ved DCFH-DA er godt bestyrkende med CYP2E1 induktion. Den lignende form for korrelation mellem ROS produktion og CYP2E1 efter eksponering af monocrotophos, et organophosphat pesticid, i PC12-celler er også blevet rapporteret for nylig [37]. Vi fik en betydelig reduktion i niveauet af MWCNTs induceret oxidativt stress og CYP2E1 (udtryk og aktivitet) i overværelse af DMTU og NAC, hvilket bekræfter rolle CYP2E1 i MWCNTs inducerede toksiske reaktioner. Mens der i tilfælde af TiO

2-NP, kun NAC blev fundet effektive til at reducere ekspressionen og aktiviteten af ​​CYP2E1. Det indikerer, at TiO

2-nationale parlamenter udøvede den oxidative stress overvejende af H

2O

2 produktionsanlæg snarere OH radikaler. Som DMTU vides at opfange OH

• radikaler dannet ved omdannelse af O

2

– i nærværelse af jern ved en modificeret Haber-Weiss reaktion [38]. Lignende virkninger blev også rapporteret i tilstedeværelse af diallyl-sulfid (en anden thiolgruppe indeholdende forbindelse) i ethanol medieret udtryk for CYP2E1 i polariserede hepatiske celler WIF-B [39].

I de foreliggende undersøgelser, de niveauer af protein udtryk for P

53 var godt korrelative med data opnået for mikrokerner (MN) induktion. P

53 er en af ​​de vigtige udløsende molekylære markører til vurdering genotoksicitet i tilfælde af oxidativ stress induceret DNA-beskadigelse [10]. Cellulær skade ved ROS er positivt forbundet med P

53 aktivering, og induceret ekspression af P

53 protein er blevet foreslået som et værktøj til at detektere oxidativ stress induceret cyto-genotoksicitet [10]. , De forhøjede niveauer af P

53 protein er således en indikation af TiO

2-NPs og MWCNTs induceret oxidativ stress medieret genotoksicitet. Behandling af DMTU og NAC viste sig at være effektiv væsentligt at nedbringe de forhøjede niveauer af p

53-protein i TiO

2 og MWCNTs eksponerede celler. Denne virkning kan korreleres med den stærke antioxidant og anti-ROS aktivitet af DMTU og NAC observeret i de aktuelle undersøgelser samt i andre studier [34]. I en lignende konklusion af Mroz et al. [40] har også vist, at NAC blokerede partikler drevet p-ser15-p

53 respons i A549 celler.

Det kan konkluderes, aktuelle undersøgelser afslører, at TiO

2-NPS (10, 50 pg /ml) og MWCNTs (10, 50 ug /ml) eksponering i 24 timer inducerer markørerne for oxidativ stress og cyto-genotoksicitet i A549-celler. TiO

2-NPS inducerede toksiske reaktioner blev medieret primært gennem H

2O

2 generation, og reduktion i antioxidant forsvarssystem. Mens i tilfælde af MWCNTs, bivirkninger var primært på grund af ændring /hæmmer den enzymatiske antioxidant system. DMTU og NAC viste sig at være effektive signifikant at reducere niveauerne af oxidativ stress og genotoksiske markører undersøgt undtagen HSP27.

Materialer og metoder

Alle de angivne kemikalier og reagenser blev indkøbt fra Sigma-Aldrich Chemical Company Pvt. Ltd St. Louis, MO, USA, medmindre andet er angivet. Alle kemikalier og reagenser var af højeste renhed rådighed

nanopartikler forberedelse

TiO

2-nationale parlamenter (d. 25 nm, specifikt overfladeareal 200-220 m

2 /g, 99,7% ren spormetaller grundlag, tetragonal i krystallografisk system sfærisk form) uden nogen belægning blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, USA, (Kat nr. 637.254), medens de MWCNTs anvendt i denne undersøgelse var generøst Givet af Dieter g . Weiss, professor, Biologisk Institut, Institut for Cellebiologi og Biosystems Technology, Rostock Universitet, Tyskland. Sterilisation af nanopartikler blev udført ved opvarmning til 120 ° C i 2 timer og derefter suspenderet i komplet DMEM-F12-medium. Stamopløsninger (1 mg /ml) af nanopartikler blev sonikeret for at sikre en ensartet suspension, før den blev fortyndet med dyrkningsmedium anvendes til eksponering af celler [15], [41]. Forud hjælp i forsøgene, både nanopartiklerne blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​bakterielt endotoxin ved hjælp Limulus amebocytlysat (LAL) -testen.

Karakterisering af nanopartikler

Transmissionselektronmikroskopi.

Den ultra-strukturel karakterisering herunder tekstur, størrelse og internalisering blev gjort ved Ludwig Jonas, professor ved Institut for Patologi, Electron Mikroskopisk center, medicinske Fakultet, universitetet i Rostock, Tyskland. Kort fortalt blev TiO

2-NPs og MWCNTs suspenderet i destilleret vand og slippes på carbon belagt kobbergitre for Transmission Electron Microscopy. Diameteren af ​​TiO

2-NPs og længde /diameter MWCNTs blev målt ved hjælp af TEM Libra 120 (Carl Zeiss Oberkochen, Tyskland) udstyret med morfometrisk analyse software (konto OSIS Münster Tyskland). Parallelle sæt af cellerne blev eksponeret for TiO

2-NPs og MWCNTs i 24 timer ved 37 ° C, fikseret i glutaraldehyd (4% i PBS) og forarbejdet til at studere fagocytose og pinocytose hjælp transmissionselektronmikroskopi (TEM). Billeder blev taget ved forskellige forstørrelser af 2K Proscan kamera ved hjælp af softwaren punkt (OSIS Münster, Tyskland).

Dynamisk lysspredning.

Størrelse distribution og zeta potentiale TiO

2-nationale parlamenters og MWCNTs, såvel alene som i nærvær af DMTU og NAC, blev bestemt under anvendelse dynamisk lysspredning og fase analyse lysspredning (PALS) i en Zetasizer Nano-ZS, Model ZEN3600 udstyret med 4.0mW, 633 nm laser (Malvern Instruments Ltd. , UK) som beskrevet tidligere af os [15]

Cell kultur

Humane lunge kræftceller -. A549 (ATCC No. CCL-185TM), der anvendes i undersøgelsen, blev oprindeligt indkøbt fra Nationalt Center