PLoS ONE: Emblica officinalis ekstrakt Fremkalde Autophagy og hæmmer human kræft i æggestokkene Cell Proliferation, angiogenese, Vækst af Mouse xenotransplantat Tumors

Abstrakt

Patienter med kræft i æggestokkene (OC) kan behandles med kirurgi, kemoterapi og /eller strålebehandling, selvom ingen af ​​disse strategier er meget effektive. Adskillige plante-baserede naturlige produkter /kosttilskud, herunder uddrag af

emblica

officinalis

(amla), har vist potente antineoplastiske egenskaber. I denne undersøgelse vi besluttet, at Amla ekstrakt (AE) har anti-proliferative virkninger på OC celler under både

in vitro

og

in vivo

betingelser. Vi har også bestemt anti-proliferative effekter en af ​​komponenterne i AE, quercetin, på OC celler under

in vitro

betingelser. AE inducerede ikke apoptotisk celledød, men en betydelig forøgelse af ekspressionen af ​​de autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II under

in vitro

betingelser. Quercetin også øget ekspression af de autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II under

in vitro

betingelser. AE reducerede også signifikant ekspressionen af ​​flere angiogene gener, herunder hypoxi-inducerbare faktor 1α (HIF-1α) i OVCAR3 celler. AE handlet synergistisk med cisplatin for at reducere celledeling og øge ekspressionen af ​​de autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II under

in vitro

betingelser. AE havde også anti-proliferative effekter og induceret ekspression af de autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II i mus xenotransplantattumorer. Derudover AE reduceret endotelcelle antigen – CD31 positive blodkar og HIF-1α ekspression i muse xenotransplantattumorer. Tilsammen udgør disse undersøgelser viser, at AE hæmmer OC cellevækst både

in vitro

in vivo

eventuelt via hæmning af angiogenese og aktivering af autophagy i OC. Således kan AE vise sig nyttige som et alternativ eller supplement terapeutisk tilgang bidrage til at bekæmpe OC

Henvisning:. De A, De A, Papasian C, Hentges S, Banerjee S, Haque I, et al. (2013)

emblica

officinalis

Uddrag inducerer Autophagy og hæmmer human kræft i æggestokkene Cell Proliferation, angiogenese, Vækst af Mouse xenotransplantattumorer. PLoS ONE 8 (8): e72748. doi: 10,1371 /journal.pone.0072748

Redaktør: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 13, 2013; Accepteret: 12 Juli 2013; Udgivet: 15 august, 2013 |

Copyright: © 2013 De et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en UMKC murene fond og en VA Merit Award Grant (SKB, SB). Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller deltagelse af manuskriptet.

Konkurrerende interesser: Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kræft i æggestokkene (OC) er den anden mest almindelige gynækologiske kræft og er den hyppigste årsag til. kræft død hos kvinder i USA [1]. Hvert år omkring 22.000 kvinder i USA er diagnosticeret med OC, og 15.000 dødsfald skyldtes OC i 2011 alene [1]. OC er vanskelig at diagnosticere på sin vorden (I /II), og er ofte ikke klinisk mistanke, før det spreder sig, og videre til de senere faser (III /IV). Derfor OC har en dårlig prognose, med en fem års overlevelse for alle faser af ~ 47% [2]. I øjeblikket kan OC behandles med kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, med suboptimale resultater som angivet med de fem års overlevelse ovenfor citerede. Udviklingen af ​​nye anticancer narkotika eller kombinationer af lægemidler til OC har ikke givet væsentlig grund til at være optimistisk. Eftersom konventionelle anticancerlægemidler kan være meget giftige, er plante-afledte bioaktive stoffer, der undersøges mere intensivt som alternative eller adjungerede terapier for forskellige former for kræft [3]. Seneste tyder på, at planteekstrakter har anti-tumor /anti-cancer /anti-proliferative virkninger på dyrkede humane tumorcellelinier [4-7] og har også en antiangiogen effekt på kræftceller [8].

amla (

emblica

officinalis

) er en frugter plante, der er blevet anerkendt for sin medicinske værdi, og har været brugt siden oldtiden i den indiske traditionelle system af medicin ‘Ayurveda’ til behandling af flere sygdomme, herunder kræft [9-11]. Frugten af ​​amla planten indeholder 11 kendte medicinsk relevante bestanddele såsom gallussyre, ellagsyre, 1-O-galloyl-beta-D-glucose, 3,6-di-O-galloyl-D-glucose, chebulinic syre, quercetin , chebulagic syre, corilagin, 1,6-di-O-gallolyl beta D glucose, 3-ethylgallic syre, isostrictiniin og ascorbinsyre [9]. Filialer af denne plante indeholder syv bioaktive stoffer – geraniin, phyllanemblinins C og E, prodelphinidin B1, (2) -epigallocatechin 3-O-gallate, (S) -eriodictyol 7- [6-O- (E) -p-coumaroyl ] -bD-glucosid [12]. Blandt denne samling af forbindelser, gallussyre, ellagsyre, 1-O-galloyl-beta-D-glucose, chebulinic syre, quercetin, chebulagic syre, corilagin, ascorbinsyre og geraniin har vist stærke anti-kræftfremkaldende egenskaber individuelt, og disse kan hjælpe med at forklare de anti-cancer egenskaber af hele amla ekstrakt (AE) [9,13]. AE har vist sig at inhibere proliferation af en række forskellige cancerceller

in vitro

, herunder OC celler og har også vist anti-proliferative virkninger

in vivo

[9-11]. For nylig triphala, en urtemedicin, der indeholder AE, har også demonstreret anti-angiogenese egenskaber [8].

På grund af den potentielle værdi af AE som en anti-cancer terapi, især til OC, vi har undersøgt anti proliferative og anti-tumorigene effekter af AE i æggestokkene cellelinjer

in vitro

i en mus xenograft model. Vi har også undersøgt virkningen af ​​AE på tumorangiogenese i dyrkede celler og en mus xenograft model. Vi har observeret, at AE ikke inducerer apoptotisk celledød, men øge ekspressionen af ​​autophagic protein i vævskultur og mus xenograft model. Vi har også observeret, at AE handlet synergistisk med cisplatin for at reducere celledeling og øge ekspressionen af ​​beclin1 og LC3B-II under

in vitro

betingelser.

Materialer og metoder

Etik Erklæring

Alle dyrene blev vedligeholdt i henhold til standard retningslinjer for American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional

Animal Care og brug Udvalg for Kansas City VA Medical Center (Kansas City, MO).

Cell kultur og reagenser

OVCAR3, SW626 og normale humane placentale celler (HS 799 pl) blev opnået fra American Type Culture Collection. Dulbeccos modificerede Eagles-medium (DMEM) og trypsin blev indkøbt fra Sigma, St. Louis, MO. OVCAR3 og SW626-celler blev opretholdt i DMEM med 10% føtalt bovint serum (Hyclone Laboratories, Logan, UT) og antibiotika ved 37

OC i en CO 5%

2 miljø. Alle celler, der anvendes i denne undersøgelse, var inden for 10 passager efter modtagelse eller nyttiggørelse (~ 2 og 1/2 måneder dyrkning). AE for behandling blev fremstillet ud fra kommercielt tilgængelige tabletter (Himalaya, USA, Houston, TX, indeholdende 250 mg amla frugter og 350 mg amla stamceller pulver). En stamopløsning af AE blev fremstillet ved afvejning Amla tabletter, formaling dem og opløse pulveret i endotoksinfrit sterilt vand ved 10 mg /ml. Opløsningen blev filtreret gennem et 0,02 um celluloseacetatmembran og anvendes til at behandle kulturen ved forskellige koncentrationer.

Behandling

10.000 OVCAR3 eller SW626-celler blev udpladet i individuelle brønde i 24-brønds plader i 1 ml medium indeholdende 10% føtalt bovint serum og inkuberet ved 37

OC i 24 timer før starten af ​​forsøgene. Efter den indledende udpladning blev mediet erstattet med 1 ml DMEM indeholdende serum (10%) og AE (0-400 ug /ml; i tre eksemplarer) for forskellige tidspunkter (6-96 timer) ved 37

OC.

in vitro

kontrol (0 gg /ml AE) modtog køretøj (vand) ved en mængde svarende til den højeste koncentration af AE brugt. Vi har også behandlet OVCAR3 celler med forskellige doser af quercetin (5-100 ug /ml; i fire eksemplarer) for forskellige tidspunkter (6-96 timer) ved 37

OC.

in vitro

kontrol (0 ug /ml quercetin) modtog køretøj (DMSO, 4 pi, hvilket svarer til den mængde for 100 pg /ml quercetin)

Cell spredning

Celleproliferation blev vurderet ved anvendelse [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid)] (MTT) assays som tidligere beskrevet [14] med modifikationer [15]. OVCAR3 og SW626-celler blev dyrket i 24-brønds plader indeholdende DMEM og 10% FBS. Efter behandling blev MTT (0,1 mg /brønd) tilsat til cellerne efterfulgt af inkubation i 4 timer ved 37

OC. Formazankrystallerne dannede blev solubiliseret ved inkubation af cellerne med 1 ml isopropylalkohol som opløste det blå formazon produkt, der opstod under inkubering med MTT. Den optiske densitet blev målt ved 560 nm i et spektrofotometer. Antallet af funktionelt aktive celler (dvs. optisk densitet-værdier) blev beregnet for sammenligninger mellem kontrol- og behandlede grupper.

DNA fragmentation

DNA blev fremstillet fra behandlede og ubehandlede kulturer som tidligere beskrevet [16 ]. Kort fortalt, efter behandling blev cellerne lyseret i 100 pi lysisbuffer (100 mM Tris, pH 8,0, 20 mM EDTA, 0,5% SDS) blev behandlet med 50 ug /ml DNase-fri RNase ved 37

OC i 30 minutter og 100 ug /ml proteinase K i 2 timer ved 50

OC. DNA’et blev derefter ekstraheret med phenol-chloroform og chloroform og udfældes i 3 volumener ethanol. DNA’et (1 ug /bane) blev elektroforesebehandlet på 1% agarosegeler. Molekylvægtstandarder blev kørt sideløbende. Gelerne blev farvet med ethidiumbromid og fotograferet under anvendelse af et Chemidox (BioRad, Hercules, CA).

RNA Extraction

Totalt RNA blev ekstraheret fra OVCAR3 celler under anvendelse af Trizol ekstraktionsmetode. mRNA mængde og kvalitet blev bestemt ved at måle dets absorbans i Genesys 6 Scanning UV /VIS Scanning spektrofotometer og også ved hjælp af RNA Experion chip (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Gene Array

differentiel ekspression af angiogenese regulatoriske gener blev analyseret ved anvendelse Oligo GEArray tilvejebragt af producenten (SA Bioscience Corporation, Frederick, MD, USA). Kort beskrevet blev 3 ug totalt RNA revers transkriberet til biotin-16-dUTP-mærkede cDNA-prober med TrueLabeling-AMP metoden under anvendelse af 16 pi 2,5X RNA-polymerase, 2 pi 10 mM biotinyleret UTP, RNA Polymerase 2 pi. De SuperArray membraner (OHS-026) blev præ-hybridiseret ved 60

OC i 2 timer. Hybridisering af biotin-mærkede cDNA-prober til membranerne blev udført ved 60

OC natten over med langsom omrøring. De hybridiserede membraner blev vasket i saltvand natriumcitratpuffer (én gang i 2 x SSC, 1% SCS og en gang i 0,1 x SSC, 0,5% SDS). Membranerne blev inkuberet med alkalisk phosphatase-konjugeret streptavidin, og derefter med den kemiluminescerende substrat CDP-Star. Billeder af membranerne blev erhvervet ved hjælp af Chemidoc XRS-systemet (BioRad) og datasæt blev eksporteret til GEArray Analyzer, den software, der er udviklet af SA Bioscience og analyseret. Den relative ekspression niveauet af hvert gen blev bestemt ved sammenligning af signalet intensiteten af ​​hvert gen i arrayet efter korrektion for baggrund og normalisering.

In vivo tumor undersøgelser

Otte uger gamle nøgne mus (nu /nu genotype, Harlan Laboratories (Madison, WI) blev holdt med vand og mad

ad libitum

i et patogen frit miljø med en 12 timers lys og 12 h mørke-cyklus i et dyr pleje facilitet på Kansas City VA Medical center. Animal pleje og eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer for Animal Care og brug Udvalg for Kansas City VA Medical center. OVCAR3 celler (5×10

4) med Matrigel blev injiceret subkutant i den højre bagerste flanke hver mus (4-5 mus pr gruppe). Tumorvækst blev overvåget efter 2

nd dag injektion og fortsatte op til 24 dage. tumor længde og bredde blev målt ved anvendelse af en skydelære, og tumorvolumen blev beregnet efter formlen :. tumorvolumen = længde x bredde x 0,5 bredde

Seks dage efter injektion, blev musene fodret oralt med 10% saccharose (kontrol) eller 10% sucrose med AE dagligt (100 mg /kg legemsvægt.). Dosis 100 mg /kg legemsvægt blev valgt på grundlag af en foreløbig undersøgelse, hvor denne dosis viste optimal effekt på hæmning af tumorvækst. Efter 18 dages AE behandling blev mus aflivet, og tumorerne blev fjernet og fikseret i 4% bufret formaldehyd til yderligere undersøgelse.

Immunhistokemi

Immunhistokemi blev udført på 4% formalin fast paraffin-embedded vævssnit ifølge vores tidligere metoder [17,18]. Kort fortalt blev vævssnit fikseret i 4% bufret formaldehyd og afparaffiniseret i xylen, rehydreret i faldende koncentrationer af alkohol, vasket med PBS og blokeret med blokerende serum (Immpress-Vector Laboratories, Burlingame, CA) i 20 minutter. Snittene blev inkuberet med beclin1, LC3B-II (Cell Signaling, Boston, MA), CD31, Ki67 (Abcam, Cambridge, MA) eller HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton CO) antistof (1: 500 for alle antistoffer) natten over i et fugtigt kammer ved 4

OC. Immunoreaktiviteten blev påvist under anvendelse sekundære antistoffer konjugeret til streptavidin (Immpress-Vector Laboratories) og blev snittene modfarvet med hematoxylin. Snittene blev afbildet med en Leica digital fotomikroskop. Til kvantificering af mikrokar blev vævssnit analyseret ved 50X forstørrelse og CD31-positive kar blev talt. Fire områder fra hver af 3 sektioner pr tumor blev analyseret.

OVCAR3 celler blev fikseret i 4% buffered formaldehyd og vaskes i PBS. Efter blokering med blokerende serum, blev cellerne inkuberet med beclin1, LC3B-II eller HIF-1α (1: 200) antistof natten over ved 4

OC. Cellerne blev vasket og immunreaktivitet blev detekteret som beskrevet ovenfor. Antallet af immunofarvede celler og totale celler blev talt, og procentdelen af ​​celler med immunmærkning blev beregnet.

Western blot-

Western blots blev udført som tidligere beskrevet [19]. Kort beskrevet blev proteinet ekstraheret enten fra OVCAR3, SW626 celler eller fra tumorer og koncentrationen af ​​protein blev målt ved BCA-proteinassay-metoden (Pierce, Rockford, IL). Hver prøve (50 ug) blev kørt på en SDS-natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel. Proteinet blev overført til en nitrocellulosemembran. Membranen blev inkuberet med blokerende serum (Thermoscientific, Pittsburgh, PA) i 1 time ved stuetemperatur efterfulgt af inkubation natten over ved 4

OC med antistof mod Bax, Bcl2, caspase 3, spaltet caspase 3, caspase 7, beclin1 eller LC3B -II (1: 1000, Cell Signaling) eller HIF-1α (1: 1000, Abcam). Efter vask med Tris-NaCl-Tween 20 buffer blev membranen inkuberet med sekundære antistoffer (1: 10000, Abcam) ved stuetemperatur i 1 time. Immunreaktivitet blev påvist under anvendelse forøget kemiluminescens (Thermoscientic).

Statistisk analyse

Analyser udførtes tre gange, og hvert eksperiment blev gentaget to gange. Alle grafiske data vises som middelværdi + S.E.M. Betydning blev testet ved hjælp af uparret, to-tailed Students t-test med ulige varians (Microsoft Excel, Redmond, WA).

s

0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

AE hæmmer OVCAR3 og SW626 celler spredning

For at afgøre, om AE kan påvirke celleproliferation, vi testede dens virkning på tre forskellige cellelinier : 1) en ovariecancercelle (OVCAR3), 2) et primært adenocarcinom i colon metastaseret på ovarie (SW626), 3) en normale humane placentale celler (HS 799). Normale placentale celler blev anvendt til at bestemme, om AE har nogen virkning på ikke neoplastiske celler. Derudover har vi brugt SW626 celler til at afgøre, om AE er i stand til at hæmme tumorer, der havde metastaseret fra andre websteder til æggestokkene, og at afgøre, om virkningerne af AE på OVCAR3 ville blive gentaget med andre kræftceller. OVCAR3 celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af AE (0-1000 pg /ml) i 24 time og det relative antal af celler blev udledt under anvendelse af MTT-assays. Lave koncentrationer (10-200 pg /ml) af AE ikke påvirkede celleproliferation; blev imidlertid celleproliferation inhiberes betydeligt ved AE koncentrationer i området fra 300-1000 pg /ml (figur 1A). Vi behandlede normale placentale celler (HS 799 pl) med forskellige doser (100-500 pg /ml) af AE i 48 time at bestemme, om AE var generelt cytotoksisk, og konstateret, at AE væsentlige ikke havde nogen indvirkning på celleoverlevelse ved nogen af ​​de koncentrationer afprøvet (figur 1B). Vi behandlede både OVCAR3 og SW626-celler i kultur med stigende koncentrationer af AE i forskellige tidsrum før udførelse MTT-assays. Hurtige tab af celleproliferation forekom med stigende koncentrationer af AE i både OVCAR3 og SW626-celler (figur 1A, 1C, 1D). I begge cellelinier, inhibering af celleproliferation induceret af AE var afhængig af både koncentration og inkubationstid (figur 1C, 1D). Den laveste koncentration af AE testes (100 ug /ml) forårsagede signifikant hæmning (p = 0,001) af OVCAR3 celler ved 72 timer, og den højeste dosis (400 mg /ml) potent hæmmede (p = 0,007) vækst OVCAR3 celler med 12 time (figur 1C). I SW626-celler, AE ved 100 ug /ml forårsagede signifikant inhibering med 48 time (p = 0,001), og ved den højeste vækst dosis blev inhiberet (p = 0,001) med 6 time (figur 1D)

A. Dosisafhængig effekt af AE på proliferation af OVCAR3 celler. B. dosisafhængig effekt af AE på celledød i normale placenta celler (HS-799 pl). C-D. Tid og Dose afhængige effekter af AE på proliferation OVCAR3 (C) og SW626 (D) celler. E. dosisafhængig effekt af quercetin på proliferation af OVCAR3 celler. OVCAR3 og SW626-celler blev dyrket og dyrket i 2 dage i DMEM i nærvær af 10% serum som beskrevet under materialer og metoder. Efter denne periode blev kulturerne tilført medium indeholdende 10% serum og forskellige doser af AE i 24 timer, undtagen tidsafhængig undersøgelse. Dataene er middelværdien + S.E.M. fra 6 uafhængige observationer. *, P. 0,05, signifikant forskellig fra bærerbehandlede kontrolgruppe

Quercetin hæmmer celledeling i OVCAR3 celler

Efter at have fastslået, at AE dosis- og tidsafhængigt reduceret celleproliferation i OVCAR3 celler, testede vi, om behandling af OC celler med forskellige doser (0-100 pg /ml) af quercetin – en af ​​komponenterne i AE– kunne reducere celleproliferation i OVCAR3 celler. Den laveste koncentration af quercetin testes (5 ug /ml) forårsagede signifikant inhibering (p = 0,01) af OVCAR3 celler ved 48 timer, og den højeste dosis (100 ug /ml) inhiberede (p = 0,005) vækst OVCAR3 celler ved 24 timer (figur 1E).

AE ændrer morfologi OVCAR3 og SW626 celler

Hæmning af proliferation kan ændre størrelse og morfologi af de enkelte celler [20]. Derfor vi nøje observeret morfologi OVCAR3 og SW626 celler efter behandling med 0-300 pg /ml AE. Morfologien af ​​OVCAR3 celler behandlet med 100 og 200 ug /ml AE kunne skelnes fra ubehandlede celler efter 24 time (figur 2 A-C), hvorimod behandling med 300 ug /ml til 24 t forårsagede størstedelen af ​​cellerne til at blive runde ( Figur 2D). AE inducerede også dosisafhængige ændringer i morfologien af ​​SW626-celler efter 24 time (Figur 2E-H). En nærmere undersøgelse viste, at behandling med 300 ug /ml AE i 24 timer inducerede cytoplasmatiske vakuoler i både OVCAR3 og SW626-celler (figur 2J, 2N, 2L, 2P). Disse morfologiske forandringer tyder på, at celledød kan være opstået siden celledød undertiden ledsages af vacuole-dannelse [21]. Yderligere forsøg blev udført under anvendelse 300 pg /ml koncentration af AE.

A-D. Dosisafhængig effekt af AE på morfologi og celledensitet på OVCAR3: A = Kontrol, B = 100 pg /ml AE, C = 200 ug /ml AE, D = 300 ug /ml AE. E-H. Dosisafhængig effekt af AE på morfologi og celle tæthed af SW626 celler. E = Kontrol, F = 100 pg /ml AE, G = 200 ug /ml AE, H = 300 ug /ml AE. I-J, M-N. AE øgede cytoplasmatiske vakuoler i OVCAR3. I og M = Kontrol, J og N = 300 ug /ml AE. K-L og O-P. AE øgede cytoplasmatiske vakuoler i SW626. K og O = Kontrol, L og P = 300 ug /m AE. OVCAR3 og SW626-celler blev dyrket og dyrket i 2 dage i DMEM i nærvær af 10% serum som beskrevet under materialer og metoder. Efter denne periode blev kulturerne tilført medium 10% serum og forskellige doser af AE i 24 timer. Nogle af celleblærerne er angivet med pile (N og P). Bar = 50 um.

AE forårsagede ikke apoptotisk celledød i OVCAR3 og SW626 celler Salg

I lyset af de morfologiske ændringer der er beskrevet ovenfor, hvilket antyder, at behandling af OC cellelinier med 300 ug /ml AE induceret celledød, ønskede vi at bestemme, om AE behandling induceret apoptose af disse cellelinier. Vi brugte to forskellige tilgange til at undersøge denne mulighed: 1) Undersøgelse af DNA for internukleosomal fragmentering, et adelsmærke for apoptotisk celledød, og; 2) Western blotting for specifikke proteiner (f.eks Bax, bcl

2, caspase 3, spaltet caspase 3 og caspase 7) er involveret i den apoptotiske vej. For at bestemme om AE forårsagede DNA internukleosomal fragmentering, DNA fremstillet fra kontrol og AE-behandlede kulturer blev fraktioneret på 1% agarosegeler 24 og 96 timer efter tilsætningen af ​​AE (300 ug /ml). Selv om der blev observeret DNA nedbrydning i disse præparater, var der ingen tilsyneladende DNA-fragmentering, selv efter 96 timers behandling (figur 3A-B), hvilket antyder, at celledød forekom ikke ved apoptose. For yderligere at udforske den potentielle rolle af apoptotiske veje i død AE behandlede celler, Western blots for bax, bcl

2, caspase 3, kløvet caspase 3 og caspase 7 blev udført. I OVCAR3 celler, AE behandling reducerede udtryk for bax, bcl

2 og kløvet caspase 3 (figur 3C, 3E og 3I), og ændrede ikke udtryk for caspase 3 eller caspase 7 proteiner (figur 3G og 3K). I SW626 celler, har AE behandling ikke ændre udtryk for bax, bcl

2, caspase3 eller caspase7 (figur 3D, 3F, 3H og 3L) og reducerede udtryk for kløvet caspase 3 (figur 3J). Kollektivt, resultaterne støtter den konklusion, at apopotic veje ikke aktiveres i AE behandlet OC cellelinjer.

A-B. Repræsentative fotografier af DNA fragmentation i OVCAR3 celler (A) og SW626-celler (B). OVCAR3 og SW626-celler blev behandlet med 300 ug /ml AE som beskrevet i Materialer og Metoder. Efter behandling blev DNA ekstraheret og underkastet elektroforese på 1% agarosegel. Størrelsen i basepar af molekylvægtmarkører (bane) er angivet ved siden af ​​gelen. Tallet til højre angiver længden i nukleotider for flere af de bands. C24 = Kontrol 24 timer, C96 = Kontrol 96 timer, T24 = AE 24 timer behandling, T96 = AE 96 timer behandling, + C = Positiv kontrol, S = DNA størrelse standard. C-L. Udtryk for apoptotiske proteiner efter AE behandling (300 mg /ml) i OVCAR3 og SW626 celler. Repræsentative fotografier af Western blot af Bax (C, D), Bcl

2 (E, F), Caspase 3 (G, H), kløvet Caspase 3 (I, J), Caspase 7 (K, L) i OVCAR3 (C, E, G, i, K) og SW626 (D, F, H, J, L) celler efter AE behandling er vist øverst. β-actin blev detekteret som en kontrol for hver blot. Histogrammet svarende til hvert fotografi repræsenterer forholdet af densitometrisk analyse af hvert bånd til den respektive β-actin band. Kulturen blev behandlet med 0 eller 300 ug /ml AE i 24 time. Efter behandling blev protein fra OVCAR3 og SW626 celler ekstraheret og 30 ug proteiner blev elektroforeret på SDS-PAGE. Proteinet blev derefter overført til nitrocellulosemembran og immunoblottet mod apoptose relaterede antistoffer – Bax, Bcl

2, caspase 3, spaltet caspase 3 eller caspase 7. Værdierne er middelværdier + S.E.M. af 4 uafhængige forsøg. *, P 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen

AE inducerer autophagy i OVCAR3 og SW626 celler

Seneste

in vivo

in vitro.

tyder på, at en række lægemidler mod cancer udøver deres virkninger, i det mindste delvist, gennem deres virkninger på autofagi [22,23]. Undersøgelserne ovenfor antydet, at apopotic veje ikke blev aktiveret af AE behandling, så vi har valgt at undersøge, om autofagi blev aktiveret i AE behandlede OC celler. Konkret har vi behandlet OVCAR3 og SW626 celler med AE for at bestemme virkningerne på ekspressionen af ​​autophagic proteins- beclin1 og LC3B-II ved hjælp af immunocytokemi og immunoblotting teknikker. Immunreaktivitet for både beclin1 og LC3B-II var til stede i ubehandlet OVCAR3 og SW626-celler (Figur 4 A, B, E, F). Intensiteten af ​​immunfarvning og antal immunpositive celler imidlertid forøget med AE behandling [Figur 4 A-H]. Western blot-analyse stemte overens med resultaterne af immunfarvning, hvilket viser, at AE behandling øgede ekspressionen af ​​beclin1 og LC3B-II i både OVCAR3 og SW626-celler (figur 4 I-P). Disse data antyder, at autofagi aktiveres i AE behandlede celler. Vi undersøgte også ekspression af de autophagic proteiner beclin1 og LC3B-II efter quercetin behandling (5 ug /ml i 48 time) i OVCAR3 celler under anvendelse immunblotting. Ekspression af beclin1 og LC3B-II var signifikant højere i quercetin behandlede celler end kontrol (figur 4 Q-T).

immunfarvning af beclin1 og LC3B-II i OVCAR3 og SW626 kontrolceller og efter at være behandlet med 300 ug /ml AE (A, B, E og F). Histogrammerne viser procentdelen af ​​beclin1 (C og D) og LC3B-II (G og H) immunpositive celler som en procentdel af det totale antal celler. OVCAR3 og SW626-celler blev dyrket og dyrket i 2 dage i DMEM i nærværelse af 10% serum som beskrevet under materialer og metoder. Efter denne periode blev kulturerne tilført medium indeholdende 10% serum og AE i 24 timer. Celler blev fotograferet ved 400 x forstørrelse. Ekspression af beclin1 totalt protein ifølge OVCAR3 (I) og SW626 (J) celler og ekspression af LC3B-II i total protein, OVCAR3 (M) og SW626 (N) celler efter behandling med AE (300 ug /ml) i 24 hrs. Repræsentant fotografi af western blot for beclin1 og LC3B-II vises øverst. β-actin blev detekteret som kontrol for hver blot. Mean + S.E.M. værdier af densitometrisk forhold mellem beclin1 (K og L) og LC3B-II (O og P) med β-actin er vist i bunden af ​​hver respektiv gel. Q-T: Quercetin behandling (5 ug /ml i 48 time) inducerer ekspression af beclin1 (Q, R) og LC3B-II (S, T) i OVCAR3 celler. Efter behandling blev protein fra OVCAR3 og SW626 celler ekstraheret og 50 ug proteiner blev elektroforeret på SDS-PAGE. Proteinet blev derefter overført til en nitrocellulosemembran og immunoblottet mod beclin1 og LC3B-II-antistoffer. Efter immunpåvisning, beclin1 og LC3B-II-positive bånd blev målt densitometrisk og normaliseret med p-actin værdier. Værdierne er middel + ± S.E.M. af 6 uafhængige forsøg. *, P 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen. Bar = 50 um.

AE hæmmer angiogenese-relaterede gener i OVCAR3 celler

I betragtning af, at en voksende tumor masse skal etablere en vaskulær forsyning, og de seneste rapporter, at angiogenese kunne hæmmes af naturlægemidler, der omfattede AE ​​[8], ønskede vi at afgøre, om AE kunne hæmme angiogenese

in vitro

. Konkret har vi undersøgt effekterne af AE behandling på ekspressionen af ​​angiogene gener i AE-behandlede (300 ug /ml) og ubehandlede OVCAR3 celler under anvendelse af humant angiogen OligoGE Array, som detekterer 112 gener specifikt involveret i angiogenese (SA Bioscience Corporation). Eksperimenterne blev udført i tre uafhængige undersøgelser, og resultaterne er vist i figur 5 A-D. Mange gener (grøn

*) blev udtrykt ved reducerede niveauer i AE-behandlede celler sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 5B). En clustergram afbilder resultaterne opnået i kontrol- og AE-behandlede kulturer er vist i figur 5C. Udtrykket af COL4A3, CXCL6, ECGF1, EFNB2, FGF2, IL1β, PDGFB, TNFRSF12A og HIF-1α blev reduceret til mindre end 40% af kontrol niveauer (Figur 5D), med HIF-1α bliver hæmmet i størst omfang.

A. De repræsentative fotografier af mikro-array fra kontrol og AE-behandlet kultur. Kulturen blev behandlet med 0 eller 300 ug /ml AE i 24 timer. Efter behandling blev RNA isoleret ved anvendelse af Trizol ekstraktionsmetode. De superarray membraner blev hybridiseret med biotin mærket cDNA, inkuberet med alkalisk phosphatase-konjugeret streptavidin blev genekspression detekteres med den kemiluminescerende substrat CDP-Star. B. repræsentant scatterplot af AE-behandlet vs kontrol cellekulturer. Mange gener (grøn

*) er under udtrykt i AE-behandlede gruppe. C. Venstre panel: Heat map (clustergram) af kontrol og AE-behandlede kulturer. Ni gener, som reduceres med mere end 70% er angivet med pilespidser på højre side af varmen kort. Midterste panel: En forstørret varme kort, der viser reduceret ekspression af HIF-1α i AE-behandlede gruppe. Højre panel: Omfanget af genekspression. D. Grafisk repræsentation af den relative genekspression ved anvendelse global baggrund og GAPDH som reference gen og omdannes til fold-change-værdier (AE versus kontrol).

AE inhiberer ekspression af HIF-1α in vitro

i de ovenstående eksperimenter, vi demonstreret, at AE behandling undertrykt ekspression af talrige gener associeret med angiogenese. For at afgøre, om nedsat genekspression svarede til nedsat protein niveauer, vi specifikt undersøgt effekten af ​​AE behandling på produktion af HIF-1α protein i OVCAR3 celler ved hjælp af immuncytokemi og Western blotting. Både immunocytokemi og Western blot Resultaterne viste signifikant reduceret ekspression af HIF-1α i OVCAR3 cellekulturer (figur 6 A-B), hvilket yderligere støtter konceptet, at AE behandling undertrykker angiogenese.

A. Mikrofotografi, der viser reduceret ekspression af HIF-1α immunostatining i OVCAR3 celler efter AE behandling. Histogrammet viser procentdelen af ​​HIF-1α immunpositive celler sammenlignet med det totale antal celler. OVCAR3 celler blev dyrket og dyrket og behandlet med 0 eller 300 ug /ml AE i 24 timer. Celler blev immunfarvet med HIF-1α antistof og fotograferet ved 400X forstørrelse. Bar = 50 um. Værdierne er middel + ± S.E.M. af 4 uafhængige forsøg. *, P 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen. B. Et repræsentativt fotografi af Western blot for HIF-1α vises øverst. β-actin blev detekteret som en kontrol for hver blot. Mean + S.E.M. værdier af densitometrisk forhold af HIF-1α og β-actin er vist i bunden af ​​gelen. Efter immunodetektion blev volumenet af HIF-1α positive bands målt densitometrisk og normaliseret med p-actin værdier. Værdierne er middel + ± S.E.M. af 4 uafhængige forsøg. *, P 0,05, sammenlignet med kontrolgruppen.