PLoS ONE: Brevilin A, en roman naturprodukt, Hæmmer Janus kinase aktivitet og Blocks STAT3 signalering i Cancer Cells

Abstrakt

Signal abnormiteter i humane celler normalt medføre uventede konsekvenser for den enkeltes sundhed. Vi fokuserer på disse former for arrangementer er involveret i JAK-STAT signalveje, især dem, der udløses af afvigende aktiveret STAT3, et onkoprotein der deltager i essentielle processer i celle overlevelse, vækst og proliferation i mange typer af tumorer, samt immunsygdomme. Ved at etablere en STAT3 signal baseret high-throughput drug screening-system i human lunge cancer A549 celler, har vi screenet et bibliotek fra naturlige produkter, som indeholdt oprensede forbindelser fra lægeurter. En forbindelse, opkaldt Brevilin A, udstillet både stærk STAT3 signal hæmning og STAT3 signalere afhængig cellevækst hæmning. Yderligere undersøgelser afslørede, at Brevilin Et ikke kun hæmmer STAT3 signalering, men også STAT1 signalering for cytokiner induceret fosforylering af STAT3 og STAT1 samt udtryk for deres målgener. Desuden fandt vi Brevilin A kunne dæmpe Jaks aktivitet ved at blokere Jaks tyrosinkinasedomæne JH1. Niveauerne af cytokin-induceret fosforylering af statistik og andre substrater blev drastisk reduceret ved behandling af Brevilin A. roller Brevilin A målretning på Jaks aktivitet indikerer, at Brevilin A ikke kun kan anvendes som en STAT3 inhibitor, men også en forbindelse blokerer andre JAK- STAT hyperaktivering. Således disse fund forudsat et stærkt incitament til udvikling af selektive JAK-STAT hæmmere og terapeutiske lægemidler for at forbedre overlevelsen af ​​patienter med hyperaktiveret Jaks og statistikker

Henvisning:. Chen X, Du Y, Nan J, Zhang X, Qin X, Wang Y, et al. (2013) Brevilin A, en roman naturprodukt, Hæmmer Janus kinase aktivitet og Blocks STAT3 signalering i kræftceller. PLoS ONE 8 (5): e63697. doi: 10,1371 /journal.pone.0063697

Redaktør: Mark Jackson, Case Western Reserve University, USA

Modtaget: November 9, 2012; Accepteret: April 5, 2013; Udgivet: 21. maj 2013 |

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud 1104FK CA123 fra The Science and Technology Support Project i Gansu Providence til QW; 2009DFA30990 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Folkerepublikken Kina, 0708WCGA149 fra Gansu Provincial Videnskab og Teknologi og 2009AA01A130 fra National Natural Science Foundation of China til J.Y. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

omridset af JAK-STAT signalvej er blevet færdig næsten 20 år siden [1]. Flere undersøgelser blev derefter fortsat i signaldetaljer herunder protein interaktioner, post-modifikationer, transkriptionelle bestemmelser og fysiologiske effekter. Janus kinase (JAK) familien indeholder fire tyrosin kinase medlemmer, herunder JAK1, JAK2, JAK3 og Tyk2, som transducerer cytokin-induceret signaler via Signal transducere og aktivatorer af transskription (stats). Sædvanligvis blev receptor associeret Jaks aktiveres ved receptordimerisering i nærværelse af cytokiner. I mellemtiden STAT’er i cytoplasmaet blev rekrutteret til receptorerne og phosphoryleret med Jaks. Tyrosinphosphorylerede STAT’er dannet homo- eller heterodimerer via phosphotyrosin-SH2-interaktioner, og translokeres ind i kernen for at indlede transskriptioner af målrettede gener [2]. Unormal aktivitet af JAK-STAT-signaler er blevet anset for at være link til mange sygdomme, herunder kræft og immunsygdomme. Aberreret STAT’er aktivitet sædvanligvis korrelerer med forskellige typer af tumorvækst og progression af forskellige cancer maligniteter, både som svar på cytokiner og ved mutante proteintyrosinkinaser. Af de syv STAT familiemedlemmer (STAT1-STAT6, med to uafhængige gener kodet STAT5A og STAT5B), STAT3, samt Stat5 til en vis grad, er oftest aktiveres i en hel humane solide tumorer og leukæmier [3] – [5 ].

I mange STAT3 konstitutive aktiverede kræftceller, enten dyrkede humane tumorceller eller genereret musemodeller, blokerer STAT3 signalering vil hæmme cellevækst, inducere apoptose og reducere celle metastaser. I gliom eller glioblastomaceller [6], [7], brystcarcinomaceller [8], tyktarmskræft [9], planocellulært afledte tumorer [10], prostatacancerceller [11] – [13] og melanomer [14], [15], målrettet afbrydelse af STAT3 aktivitet ved at gribe RNA, der udtrykker dominante negative STAT3 formularer eller anvende specifikke signalering hæmmere ville bemærkelsesværdigt nedregulere STAT3 inducerede gener, herunder CyclinD1, Bcl-xl, c-myc, Survivin og andre gener der regulerer cellecyklus og celleproliferation, og efterfølgende reducere cellevækst og forbedre celle apoptose [16], [17]. Metastase er den vigtigste årsag til dårlig prognose og caner dødsfald sammenlignet med tumorgenese og neoplasma vækst. STAT3 nu har været betragtet som en af ​​de kritiske oncoproteiner medierer reguleringen af ​​celleinvasion og tumormikromiljøet. I humane kolorektale cancere, blev STAT3 aktiveres i dem, der fik dårlig prognose [18]. Proteiner involveret i migration og invasion af cancerceller, som matrixmetalloproteinaser (. MMP-1, MMP-2, MMP-10,

etc

) og Twist, blev reguleret af STAT3-aktivering [19] – [21] . En IL-6 inducerede JAK /STAT3 signalering var afgørende for infiltration af cirkulerende cancerceller. Tumor-afledt IL-6 hjælper cirkulerende brystcarcinom og melanom at genetablere

in situ

eller fjernmetastaser regioner [22]. For nylig er det blevet rapporteret, at vedvarende aktiveret STAT3 opretholdt NF-KB-aktivitet gennem p300 medierede pathways. NF-KB-aktivitet dramatisk reduceret med STAT3 RNAi i mange STAT3 konstitutive aktiverede cancerceller [23], hvilket tyder på, at STAT3 hæmmere også kan spille potentielle roller i at blokere NF-KB aktivitet og forbedre væksthæmning i disse cancerceller.

udforskning JAK-STAT signal hæmmere især STAT3 inhibitorer ved high throughput drug screening (HTS) er en effektiv måde at opdage potentielle specifikke lægemidler rettet på STAT3 eller opstrøms JAK kinaser.

Min N. Chau

og kolleger udviklet en prostatacancer-cellelinie, som indeholdt et STAT3 reporter konstrukt for high throughput screening af STAT3 aktivatorer og inhibitorer [24]. Her etablerede vi en lignende STAT3 signalering baseret luciferase reporter screeningssystem i en human lungecancer-cellelinie A549, som viser konstitutiv aktiveret STAT3 aktivitet og kunne yderligere induceret af cytokiner som IL-6, EGF, og HGF [25]. Ved screening, Brevilin A, en roman naturprodukt, viste signifikant JAK-STAT signalering hæmning uden øjeblikkelig direkte celle toksicitet fra 1.400 flere forbindelser, der oprindeligt blev isoleret fra planter, hvoraf de fleste var kendt som naturlægemidler. Brevilin A har foretrukket cellevækstinhiberingen af ​​DU145 og MDA-MB-468, disse vækster er afhængige af STAT3 signalering [17], [26]. Yderligere undersøgelser afslørede, at Brevilin Et blokeret aktivitet af Janus kinase Tyrosin kinase JH1 domæne, og derefter reduceret phosphorylering af nedstrømseffektorer. Brevilin A kan virke som et potentielt lægemiddel målretning på sygdomme forårsaget af JAK-STAT abnormiteter.

Materialer og metoder

Antistoffer og reagenser

Antistoffer mod STAT3, JAK2, pTyr705- STAT3, pTyr701-STAT1, pSer473-AKT, pSer9-GSK-3β, c-myc, CyclinD1, PARP, pTyr1007 /1008-JAK2, pTyr1054 /1055-Tyk2, pSer536-p65 og p65 blev opnået fra Cell Signaling Technology; Antistoffer mod c-Src, pTyr (PY99), GAPDH og His-mærke blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology, Inc .; pGL4.20 vektor og luciferasesubstrat Steady Glo blev opnået fra Promega; M-MLV første streng cDNA syntesekit blev opnået fra Invitrogen, Life Technologies Corporation; PD180970, AG490, staurosporin, doxorubicin, ATP og EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity perler blev købt fra Sigma-Aldrich; Interleukin-6 (IL-6), interferon α (IFNa) og interferon γ (IFNy) var fra PeproTech. Ni

+ affinitetskromatografiharpikser perler blev opnået fra GE Healthcare Life Sciences. 10 × PK kinasebuffer blev opnået fra New England Biolabs (NEB).

plasmider og cellelinier

En sekvens indeholdende 16 × SIE plus med en TATA-boks blev indsat i pGL4.20 mellem Kpnl og HindIII. SIE-luc-puro-konstruktionen blev transficeret i A549-cellelinje. Otteogfyrre timer efter transfektion blev cellerne udvalgt med 5 ug /ml puromycin i 2 uger, derefter 2,5 ug /ml i yderligere 2 uger. Kloner blev plukket og analyseres særskilt. Sekvenser, der koder humant JAK1-JH1 domæne, JAK2-JH1 domæne, JAK3-JH1 domæne, Tyk2-JH1 domæne og c-Src blev klonet ind PLV-SV40-puro lentivirus ekspressionsvektor separat. Yderligere sekvenser af Flag-Hans dobbelte tags blev fusioneret ved C-terminalen af ​​hver Jaks-JH1 domæne. c-Src blev fusioneret med enkelt Flag-tag ved C-terminalen. Hver af ovennævnte konstruktioner blev transficeret ind HEK293T kombineret med PMD-2.G og pCMV-dr8.74 hjælper-vektorer for virus emballage. Supernatant medium blev opsamlet efter 48 timer og anvendt til at inficere HEK293T natten over, derefter erstattet med frisk medium i yderligere 24 timer. Stabile celle puljer blev udvalgt i nærvær af puromycin (2,5 ug /ml) i 7 dage.

Cellekultur

Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ( FBS), penicillin (100 U /ml) og streptomycin (100 ug /ml).

Drug screening

Naturprodukter til screening stof var fra National Compound Resource center (The Original bibliotek leverandør til dette institut var BioBioPha Co., Ltd.). Forbindelser fra naturlige produkter (10 mM) blev fortyndet med DMEM (10% FBS) til 100 pM (fortyndet forbindelser). A549R celler til lægemiddelscreening blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 (100 pl /brønd i DMEM med 10% FBS). Tolv timer senere, 25 pi Fortyndede Forbindelser med 75 pi frisk DMEM (10% FBS) tilsat til hver brønd adskilt i yderligere 24 timer for 1

st round screening ved en koncentration på 25 uM. 12,5 pi Fortyndede forbindelser med 87,5 pi frisk DMEM blev tilsat til 2

anden runde screening i en koncentration på 12,5 pM. DMSO blev anvendt som køretøj (0,25% i 1

st runde screening og 0,125% i 2

anden runde screening). IL-6 (250 ng /ml) og PD-180.970 (250 nM) blev anvendt som kendt stimulator og inhibitor til at kontrollere systemets respons for hver runde af screening i en enkelt plade. Systemets responstid ville blive betragtet som normalt, når IL-6 inducerer mere end 2,5 gange fluorescens og PD-180.970 viser 40% -50% fluorescens hæmning i hver runde screening. Vi brugte en kontrascreen ved at antage, at den kendte inhibitor PD-180.970 har signifikant signal hæmning, og potentielle hæmmere vil altid have bedre præstationer end PD-180.970. Da den positive kontrol PD-180.970 (250 nM) altid viste en fluorescensforhold omtrentlige på 50% og kunne hæmme STAT3 fosforylering betydeligt, når bedømt af Western-blot-analyse, valgte vi 50% som en “cut off” værdi, så enhver forbindelse, der udviser en fluorescens forhold af kontrol celler ≤50% (

dvs

fluorescens hæmning ≥50%) blive plukket ud. Detaljerne er opsummeret som følger: Trin 1, 1

st runde screening, En godt-One sammensatte, 25 uM, luciferaseanalyse alene. Forbindelserne blev plukket ud når FR (Fluorescens Ratio) er ≤50%. Efter dette trin, kan de plukkede forbindelser omfatter nogle overdrevent giftige dem. For at udelukke fluorescens hæmning forårsaget af cytotoksicitet, blev Trin 2 anvendt. Trin 2, 2

anden runde screening, 12,5 uM af hver forbindelse fra trin 1, og to gentagelser for luciferaseaktivitet og MTT-assays blev anvendt. Hvis FR% er ≤50% Δ (CV% – FR%) er ≥30%, de forbindelser vil blive plukket ud for yderligere analyser. De alt for giftige forbindelser blev udelukket af dette trin. Afvigelsen “30%” er en empirisk værdi, der var i stand til at skelne overdrevent toksiske forbindelser og specifikke forbindelser. Her FR, Fluorescens Ratio = Fluorescens værdi behandlet godt divideret med Fluorescence værdi af kontrol godt; CV, Cell levedygtighed = Cell overlevelse værdi behandlet godt divideret med Cell overlevelse værdi af kontrol godt; Luciferase assay blev udført for fluorescensværdi; MTT assay blev udført for Cell Survival Value. (Procent af Fluorescence hæmning = 100% – FR%; Procentdel af Cell væksthæmning = 100% – CV%).

For luciferaseanalyse, 50 pi luciferasesubstrat Steady Glo blev tilsat (50 pl /brønd) . Efter 10 minutters inkubation blev fluorescens målt ved Vector3 Multilevel Plate Counter (Perkin Elmer). For MTT celleviabilitetstest, 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) blev tilsat i 4 timer inkubation. De resulterende krystaller blev opløst i 100 pi DMSO og absorbansen intensiteten blev målt ved Vector3 ved 490 nm bølgelængde.

Western-Blot, Immunpræcipitation og cellefarvning Salg

Celler blev vasket med iskold PBS tre gange og lyseret med RIPA-lysepuffer i 30 minutter ved 4 ° C (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA , 1 × proteaseinhibitorcocktail (Roche), 1 × phosphatase inhibitor cocktail (Roche)). Lysaterne blev centrifugeret ved 12.000 x rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Lige mængder af proteiner, bestemt ved BCA-metoden (Pierce, Thermo), blev derefter separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Millipore, Merck). Proteiner blev påvist med viste antistoffer. Salg

HEK293T celler, der udtrykker Flag tagget Src blev forbehandlet med DMSO, PD180970 (500 nM) og Brevilin A (15 uM) i 4 timer separat. Celler blev vasket med iskold PBS i tre gange og lyseret med 500 pi lysisbuffer (50 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, pH 7,4) i nærvær af protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor cocktail. Lysaterne blev centrifugeret ved 12.000 x rpm i 10 minutter ved 4 ° C. Lige mængder af proteiner ved BCA metoder, blev derefter inkuberet med anti-FLAG M2 Affinitetsperler i 8 timer ved 4 ° C. Src proteinprøver blev elueret med 0,1 M Glycin-HCI, pH 3,5 og neutraliseret med Tris-HCI (0,5 M, pH 7,4).

I apoptose assay celler blev udpladet i plader med 24 brønde. Tolv timer senere blev medierne fjernet og erstattet med frisk medium i nærvær af 10 uM Brevilin A i 24 timer. Celler blev derefter udsat for en Annexin-V-PI dobbelt farvning Fremgangsmåde i protokollen af ​​Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beyotime Institute of Biotechnology).

Protein Purification og kinaseassay

C-terminal His-mærket hSTAT3 rekombinant protein blev udtrykt i

E.coli

,

Rosetta

og renses ved Ni

+ affinitetskromatografi.

hSTAT3

CDS blev klonet ind pET28b, og induceret med 0,5 mM isopropylthio-β-galactosid ved 37 ° C i 6 timer. Inklusionslegemer blev centrifugeret ved 12.000 x rpm i 10 minutter ved 4 ° C efter ultralydbehandling behandling på hele

E.coli

celler. Derefter blev inklusionslegemerne lyseret med lysepuffer (0,5 M NaCl, 20 mM natriumphosphat, 20 mM imidazol, 8 M urinstof, pH 7,5). Ni

+ affinitetskromatografi Perlerne blev derefter anvendt til ufoldet His-mærket hSTAT3 binding. On-søjlen blev Refoldning valgt og endelig refoldet STAT3-proteinet blev elueret ved elueringsbuffer (0,5 M NaCl, 20 mM natriumphosphat, 250 mM imidazol, pH 7,5). Efter en ionbytningsfremgangsmåde, blev oprenset hSTAT3 protein i PBS (10% glycerol) frosset til yderligere analyse.

Anslået 5 × 10

8 HEK293T celler, der udtrykker Flag-His-mærkede Tyk2-JH1 blev høstet og lyseret med lysepuffer (0,5 M NaCl, 20 mM natriumphosphat, 20 mM imidazol, pH 7,5). Ni

+ affinitetskromatografi Perlerne blev derefter anvendt til Flag-His-mærket Tyk2-JH1 binding. Protein blev elueret med 250 mM imidazol og fortyndet med anti-FLAG M2 Affinitetsperler bindingsbuffer og inkuberet med M2 Affinitetsperler i 2 timer ved stuetemperatur. Tyk2-JH1-protein blev til sidst elueret med PBS indeholdende 3 × FLAG-peptid (500 ng /ml, 30 minutter ved stuetemperatur) for yderligere kinaseassay.

Omtrentlig 150 ng hSTAT3 protein og 20 ng Tyk2-JH1 kinase var præinkuberet med 1 × kinasepuffer, i nærvær af koncentrationen serie på 10, 20, 40, og 80 uM, i 10 min. ATP blev tilsat til reaktionen i en koncentration på 200 uM til 50 pi endeligt volumen. Kinasereaktionen blev derefter fortsat ved 37 ° C i 2 timer, og den blev stoppet med 5 × proteinprøve loading buffer (95 ° C, 5 min). 20 pi af hver prøve blev påført til SDS-PAGE og Western-blot-analyse.

RT-PCR og kvantitativ real-time PCR

Totalt mRNA blev ekstraheret fra dyrkede celler med TianGen DNA-oprensningskittet . Revers transskription blev udført med M-MLV revers transkription (Invitrogen, Life Technologies Corporation). Kvantitativ real-time PCR blev færdig med Roche Cyber ​​Green PCR mix kit på Biorad C1000 Thermal cycler. Primerparrene for RT-PCR var som følger:

GAPDH

fremadrettet 5′-TGGCAAATTCCATGGCAC-3 ‘, revers 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3’;

SOCS3

frem 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3 ‘, omvendt 5′-CCTGTCCAGCCCAATACCTGA-3’ [27];

IRF-1

forward5′-CGATACAAAGCAGGGGAAAA-3 ‘, omvendt 5′-TAGCTGCTGTGGTCATCAGG-3’ [28].

Dataanalyse og statistiske metoder

Hver analyse blev gentaget som angivet. Relativ cellelevedygtighed blev udtrykt som en procentdel (%) i forhold til ubehandlede kontrolceller. Fejlsøjler repræsenteret standardafvigelse (± SD). Dataene blev analyseret ved ANOVA fremgangsmåde for hver to-gruppe sammenlignende test. Blot og billedsignal intensitet blev kvantificeret under anvendelse ImageJ2X software. P-STAT3 og p-p65 fold ændringer blev normaliseret til den samlede STAT3 og p65 henholdsvis mens p-AKT og p-GSK-3p ændringer var normaliseret til GAPDH.

SOCS3

IRF-1

mRNA niveau ændringer blev normaliseret til alt

GAPDH

mRNA. Kvantificering numre er repræsenteret i bunden af ​​blottene. Fold ændringer af Annexin-V fluorescens blev normaliseret ved celletælling. IC

50 (GI

50) blev beregnet ved SPSS19 software (regression-probit metode). Histogrammer og diagrammer blev tegnet med Origin 8-software.

Resultater

Etablering af STAT3 signalering baserede high-throughput drug screening system.

A549 celler transficeret med luciferase reporter vektor, SIE-luc-puro, som indeholder gentagne STAT3-responselementer (16 × SIE, sis-inducerbar element,5′-TTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAGCTCGCTAGCATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGCTCGAGGATATCAAGATCTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTT-3′) (Fig. S1). Stabil cellelinje A549R fra en enkelt klon blev valgt derefter. Denne klon var i stand til reaktion på både cytokiner og inhibitorer, der er involveret i STAT3 signalering (fig. 1A). IL-6 inducerede ca. 5 × fold fluorescens, og PD-180.970 behandling viste omkring 50% inhibering af luciferaseaktivitet. koncentrationerne af IL-6 og PD-180.970 for behandlinger ikke påvirket cellevækst signifikant (fig. 1B). PD180970, den kendte Src-kinase inhibitor, var i stand til at inhibere STAT3 aktivitet dels i A549-cellelinje som rapporteret [25] (fig. 1C).

Luciferase (A) og MTT (B) assays af A549R celler behandlet med PD-180.970 (250 nM) og IL-6 (250 ng /ml) henholdsvis. A549R celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 (100 pl /brønd i DMEM med 10% FBS). Tolv timer senere blev mediet fjernet og erstattet . med frisk medium i nærvær af IL-6 eller PD-180.970 søjler viser standardafvigelsen (± SD) (tre uafhængige gentagelser, n = 5 i hver gentagelse) *** p. 0,001, ** p 0,01, * p 0,05, signifikant i forhold til kontrol køretøj. NS, ingen statistisk signifikans. (C) PD-180.970 inhiberer STAT3-aktivitet i A549R celler. A549R celler blev udpladet og dyrket i 100 mm skåle ved 70% konfluens. Derefter blev cellerne behandlet med PD-180.970 (250 nM) i 24 timer. DMSO blev anvendt som kontrol.

Identifikation af Brevilin A som et STAT3 Signaling Inhibitor

Forbindelser (1.440 i alt) fra naturlige produkter (tabel S1) blev screenet som beskrevet i

Materialer og metoder

. I 1

st runde screening, også betragtes som en grov screening, blev en forbindelse-én brønd strategi på koncentrationen af ​​25 pM brugt. Ni forbindelser udviste mere end 50% fluorescens inhibering (tabel S2, værdier i rødt). I 2

anden runde screening blev 12,5 uM forbindelser udvalgt til yderligere luciferase assay samt til yderligere MTT cellelevedygtighed assay. Kun én forbindelse, opkaldt Brevilin A (fig. 2A, en pseudoguaiane sesquiterpen fra

Litsea glutinosa

, oplysninger fra den oprindelige leverandør) stadig viste mere end 50% fluorescens hæmning, mens udstillet en afvigelse (mere end 30% ) mellem cellelevedygtighed (CV) og fluorescens ratio (FR). Vi spekulere, at signal specifikke hæmmere bør udvise mere signal hæmning end cellevækst hæmning inden 24 timer, og i 2

anden runde screening, hvis FR% er ≤50% andΔ (CV% – FR%) er ≥30%, de forbindelser vil blive plukket ud for yderligere analyser (tabel S3). Af de 9 forbindelser fra 1

st runde screening, kun Brevilin A mødte disse kriterier (fig. S2). Det syntes, at vi kunne få samme resultater ved at vurdere Z scoringer i en

st runde screening (Tabel S4). Western-Blot viste sig endvidere, at Brevilin Et blokeret STAT3 tyrosin 705 phosphorylering ved koncentrationen omhandlede 12,5 og 25 uM i 24 timer behandling i A549R celler (Fig. 2B). Signal inhibering og cellelevedygtighed blev derefter analyseret ved luciferase og MTT assay ved serielle koncentrationer af Brevilin En behandling efter 24 timer (fig. 2C). Brevilin A udviste bedre STAT3 signalhæmning på en dosisafhængig måde (IC

50 = 10,6 uM) end cellelevedygtighed inhibering inden for 24 timer (GI

50 20 uM), hvilket indikerer, at det er et signal specifik inhibitor mere end en forbindelse, som direkte dræber dyrkede celler baseret på celletoksicitet. Vi valgte derefter koncentrationer omkring 10 pM for yderligere analyser.

(A) Struktur af Brevilin A. (B) Brevilin A hæmmer STAT3 fosforylering i A549R celler. A549R celler blev udpladet og dyrket i 100 mm skåle ved 70% konfluens. Celler blev derefter behandlet med Brevilin A (12,5 uM og 25 uM) i 24 timer. DMSO blev anvendt som kontrol. (C) STAT3 signalering blev inhiberet af Brevilin A på en dosisafhængig måde. A549R celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 x 10

4 (100 pl /brønd i DMEM med 10% FBS). Tolv timer senere blev medierne fjernet og erstattet med frisk medium i nærværelse af Brevilin A ved forskellige koncentrationer i yderligere 24 timer (20 um, 17,5 um, 15 um, 12,5 um, 10 um, 7,5 um, 5 um, 2,5 um og 1 uM). Luciferase og MTT-assays blev udført derefter. Barer viser standardafvigelsen (± SD) (3 uafhængige gentagelser, n = 5 i hver gentagelse).

Brevilin A inhiberer konstitutivt Aktiveret-STAT3 Driven DU145 og MDA-MB-468 celler

Humant prostatisk carcinoma DU145 og brystcancer MDA-MB-468-cellelinjer udviste konstitutiv STAT3 aktivitet. Så spørger vi, om Brevilin A kunne hæmme STAT3 aktivitet i disse to cellelinjer. Figur 3A og B viste, at Brevilin A inhiberer STAT3 signalering i dosis- og tidsafhængig måde i både DU145 (Fig. 3A) og MDA-MB-468 (Fig. 3B). For at teste signal specifik hæmning, blev analyseret niveauer af phosphorylering af p65-Ser536, AKT-Ser473 og GSK-3β-Ser9. Interessant havde Brevilin A ikke udviser tilsvarende virkninger på phosphorylering af disse proteiner (fig. 3A, 3B og 3C), hvilket indikerer, at Brevilin A ikke kan påvirke eller har mindre virkning på andre celletyper signaler. Hæmning af STAT3 aktivitet normalt fører til nedregulering af målgener,

f.eks.

, C-myc og CyclinD1 [17]. Her, efter behandling med Brevilin A i 24 timer og 48 timer, både c-Myc og CyclinD1 ekspression reduceres i DU145 og MDA-MB-468 celler (fig. 3D). Øget spaltet PARP blev også observeret (Fig. 3E), hvilket indikerer, at Brevilin A inducerede DU145 og MDA-MB-468 apoptose efter 24 timers behandling [29]. Det er i overensstemmelse med de rapporter, at blokering STAT3 aktivitet førte til celle væksthæmning i DU145 [30] og MDA-MB-468 celler [31]. cellelevedygtighed blev derefter målt for DU145 og MDA-MB-468 celler, såvel som humane ikke-transformerede telomerase-immortaliserede fibroblaster BJ-celler (hTERT-BJ, en immortaliseret normal cellelinie). hTERT-BJ-celler havde en lavere STAT3-aktivitet (fig. 4A) og således blev anvendt som negative kontrolceller. Efter behandling med Brevilin A i 24 timer, 48 timer og 72 timer, viste Brevilin En mere markant cellevækstinhibering på DU145 og MDA-MB-468 end hTERT-BJ på både 5 uM og 10 uM koncentration (fig. 4B, venstre og midten). Adskillige andre forbindelser, de mekanismer, som var kendt på cellelevedygtighed, blev valgt som kontroller. AG490, en JAK-inhibitor, kunne inhibere JAK-STAT signalering afhængig cellevækst (

fx

, DU145 og MDA-MB-468.); Staurosporin, som er et kendt pan-tyrosinkinasehæmmer [32], inhiberer masser af celleprocesser og sædvanligvis viser ingen celletypespecificitet; Doxorubicin, et vildt, der anvendes forbindelse, er i stand til at inducere celle apoptose og blokere cellevækst [33]. Ved at sammenligne virkningerne på cellelevedygtighed blandt DU145, MDA-MB-468 og hTERT-BJ-celler efter 24 timer lægemiddelbehandling (fig. 4B, højre histogram), AG490 viser lignende virkninger (med Brevilin A) på disse celler, mens Doxorubicin og Staurosporin havde ingen specificitet på cellelevedygtighed eller vækst blandt disse celler. Yderligere undersøgelse af Annexin-V-farvning afslørede, at Brevilin A udviste en stærkere induktion af apoptose for DU145 og MDA-MB-468 (ca. 2,2 og 4,4 gange, respektivt) end hTERT-BJ (~1.3 gange) efter 24 timers behandling (fig. 4C).

STAT3 tyrosin 705 phosphorylering blev inhiberet af Brevilin A i dosis (5 uM, 10 uM og 15 uM i 2 timer) og tid (10 uM i 30 min, 60 min og 120 min) afhængige manerer i både DU145 (A) og MDA-MB-468 (B) celler, medens phosphorylering af p65-Ser536 (A og B), AKT-Ser473 og GSK-3β-Ser9 (C) ikke blev påvirket tilsvarende (10 uM, 2 h). (D) c-myc og CyclinD1 faldt efter 24 timer og 48 h behandling med Brevilin A (10 uM). Celler blev udpladet og dyrket i 100 mm skåle i 12 timer, derefter blev behandlet med Brevilin A som beskrevet. (E) Spaltet PARP steg i DU145 og MDA-MB-468 celler med Brevilin A (10 uM) behandling i 24 timer. DMSO blev anvendt som kontrol.

(A) STAT3 tyrosin 705 phosphorylering blev påvist i hTERT-BJ, DU145 og MDA-MB-468 celler. (B) Venstre og midterste diagrammer, hTERT-BJ, DU145 og MDA-MB-468 celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved en densitet på 8 x 10

3 (100 pl /brønd i DMEM med 10% FBS) . Tolv timer senere blev mediet fjernet og erstattet med frisk medium i nærvær af Brevilin A (5 uM og 10 uM) i 24 timer, 48 timer og 72 timer blev cellelevedygtighed målt ved MTT-assayet. Højre histogram, 12 timer senere blev cellerne udpladet, medier blev fjernet og erstattet med frisk medium i nærvær af Brevilin A (10 uM), AG490 (100 uM), Doxorubicin (1 uM) og Staurosporin (100 nM og 500 nM) til 24 timer. Dox, Doxorubicin. Sta, Staurosporin. Søjlerne viser standardafvigelsen (± SD) (3 uafhængige gentagelser, n = 3 i hver gentagelse). *** P 0,001, ** p 0,01, * p 0,05. NS, ingen statistisk signifikans. (C) Celler blev udpladet i 24-brønds plader. Tolv timer senere blev medierne fjernet og erstattet med frisk medium i nærvær af 10 uM Brevilin A i 24 timer. DMSO blev anvendt som kontrol. Celler blev derefter udsat for en Annexin-V-PI dobbelt farvning proces. eksponering program Samme blev anvendt ved hver bølgelængde.

Brevilin A Blocks Cytokine induceret STAT’er Signaling

Cytokiner, ligesom interleukiner og interferoner, normalt fremkalde STAT3 aktivering via den kanoniske JAK-STAT vej. Det er blevet rapporteret, at STAT3 blev aktiveret i DU145 og MDA-MB-468 gennem IL-6-autokrine løkker [34], [35]. Her, i nærvær af yderligere IL-6 behandling, fandt vi, at Brevilin A kunne inhibere STAT3-aktivering som respons på IL-6 induktion i HEK293T, Hela og HepG2-celler (fig. 5A). For at teste om dette hæmning af Brevilin A blev involveret i andre cytokiner medierede STAT3 aktivering, blev IFNy og IFNa anvendes. Kort fortalt, IL-6-induceret STAT3-aktivering gennem IL6R-gp130-JAK pathway [36], mens IFNy og IFNa inducerede det ved at aktivere Type II og Type I- interferon receptor-JAK-vejen henholdsvis [37]. Efter forbehandling af Hela med Brevilin A blev Tyr705 phosphorylering af STAT3 spænder inhiberet som forventet (fig. 5B). Transkription af

SOCS3

(suppressor af cytokin signalering protein 3) genet reguleres af STAT3-aktivering direkte som svar på cytokiner, såsom IL-6 [38], så mRNA-niveauet af

SOCS3

afspejler sædvanligvis den transkriptionelle aktivitet af STAT3. Vi målte mRNA-niveauet af

SOCS3

som respons på IL-6 med eller uden Brevilin En forbehandling med RT-PCR i HEK293T, Hela og HepG2-celler. Brevilin A hæmmede STAT3 medieret

SOCS3

transskription i alle disse celler dramatisk (fig. 5C). Real-time PCR-resultater viste omtrentlige 70% reduktion af

SOCS3

mRNA efter behandling med Brevilin A i nærvær af IL-6 i HEK293T celler (fig. 5D).

Celler blev udpladet og dyrket i 100 mm skåle i 12 timer og derefter medier blev fjernet og erstattet med frisk medium uden serum i yderligere 12 timer. Brevilin A (10 uM) blev tilsat i 30 min forbehandling, derefter celler blev behandlet med IL-6 (250 ng /ml), IFNa (5000 U /ml) og IFNy (1500 U /ml) i 2 timer. STAT3 phosphorylering blev derefter analyseret ved Western-Blot (A og B). (C) Celler blev udpladet og dyrket i 100 mm skåle i 12 timer, hvorefter mediet blev fjernet og erstattet med frisk medium uden serum i yderligere 12 timer. Brevilin A blev tilsat i 30 min forbehandling (HEK293T, 10 uM; Hela og HepG2, 15 uM), og derefter blev cellerne behandlet med IL-6 (250 ng /ml), IFNa (5000 U /ml) og IFNy (1500 U /ml) i 4 timer.

SOCS3

mRNA blev analyseret ved RT-PCR. (D) Real-time qPCR analyse af

SOCS3

mRNA i HEK293T celler behandlet med Brevilin A i nærvær af IL-6 (250 ng /ml). (E) Brevilin A inhiberer IFNa og IFNy induceret Tyk2 og JAK2 phosphorylering henholdsvis samt STAT1 tyrosinphosphorylering i Hela-celler som behandlet i (B). (F)

IRF

mRNA blev analyseret ved RT-PCR i Hela-celler i nærværelse af IFNa som behandlinger beskrevet ovenfor.

Brevilin A Blocks Janus-kinase aktivitet

Da Brevilin A kunne hæmme JAK2 og Tyk2 fosforylering som reaktion på IFNy og IFNa (fig. 5E), vi derefter testet effekten af ​​Brevilin A på STAT1 signalering. Resultater viste, at STAT1 phosphorylering og dens målgen

IRF1

blev reduceret i nærvær af Brevilin A, efter cytokininduktion (fig. 5E og 5F). Disse funktioner afslører, at de potentielle direkte hæmmende mål for Brevilin A kan lokalisere opstrøms af STAT3 og STAT1 signalering.