PLoS ONE: En artemisinin-Afledt Dimer Har yderst potent anti-Cytomegalovirus (CMV) og Anti-Cancer Aktiviteter

abstrakt

Vi rapporteret for nylig, at to artemisinin-afledte dimerer (dimer primær alkohol 606 og dimer sulfon 4-carbamat 832-4) er signifikant mere potent til at inhibere human cytomegalovirus (CMV) replikation end artemisinin-afledte monomerer. I vores fortsatte evaluering af aktiviteterne i artemisininerne i CMV hæmning blev tolv artemisinin-afledte dimerer og fem artemisinin-afledte monomerer anvendt. Dimerer som gruppe viste sig at være potente inhibitorer af CMV-replikation. Sammenligning af CMV-inhibering og hældningen af ​​dimerer og monomerer tyder på, at dimerer er forskellige i deres anti-CMV aktiviteter. En deoxy dimer (574), mangler endoperoxid broen, havde ikke nogen effekt på CMV replikation, hvilket tyder på en rolle for endoperoxid bro i CMV-hæmning. Forskelle i anti-CMV-aktivitet observeredes hos tre strukturelle analoger af dimer sulfon 4-carbamat 832-4 indikerer, at den nøjagtige placering og oxidationstrin svovlatomet kan bidrage til den anti-CMV-aktivitet. Af alle testede dimerer, artemisinin-afledte diphenylphosphat dimer 838 viste sig at være den mest kraftigt virkende inhibitor af CMV-replikation, med en selektivitet indeks på ca. 1500, i forhold til vores tidligere rapporteret dimer sulfon 4-carbamat 832-4 med en selektivitet indeks på ca. 900. diphenylphosphat dimer 838 var meget aktiv mod en Ganciclovir-resistente CMV-stammen og var også den mest aktive dimer i inhibering af cancercellevækst. Således kan diphenyl fosfat dimer 838 udgør en føring udvikling af en meget potent og sikker anti-CMV sammensatte

Henvisning:. Han R, Mott BT, Rosenthal AS, Genna DT, Posner GH, Arav-Boger R (2011) En artemisinin-afledt Dimer Har yderst potent anti-Cytomegalovirus (CMV) og Anti-Cancer Aktiviteter. PLoS ONE 6 (8): e24334. doi: 10,1371 /journal.pone.0024334

Redaktør: Kim D. Janda, The Scripps Research Institute, USA

Modtaget: Juni 1, 2011; Accepteret: August 6, 2011; Udgivet: 31 August, 2011

Copyright: © 2011 Han et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af NIH AI 34.885 (GHP), NIH KO8 AI074907, NIH 1R01AI093701 og March of Dimes 6 FY11 268 (RAB). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Infektion med CMV, et medlem af herpesvirusfamilien, er almindelig hos mennesker. Seroprævalensdata stiger med alderen, og nåede 90% hos personer ældre end 80 år [1]. Den virus påviser livslang vedvarende infektion, som sædvanligvis forbliver asymptomatisk. Hos immunkompromitterede værter, såsom transplanterede patienter og patienter med AIDS, er CMV-infektion forbundet med betydelig morbiditet og mortalitet [2], [3]. CMV er også den mest almindelige medfødt-erhvervet infektion forårsager mental retardering og døvhed i medfødt inficerede børn [4]. For nylig er påvisning af CMV i immunkompetente individer blevet forbundet med resultaterne af flere syndromer, herunder sepsis, pulmonale komplikationer hos patienter på intensivafdelinger-enheder, og i en hjernetumor, glioblastoma multiforme [5] – [7]. Selv om den direkte rolle af CMV i disse syndromer er uklar, kan virusreplikation bidrage til deres naturhistorie, og den rolle, anti-CMV-terapi i disse betingelser er i øjeblikket ved at blive undersøgt.

Den tilgængelige systemisk anti-CMV narkotika handling ved at målrette den virale DNA-polymerase. Disse forbindelser effektivt undertrykker CMV replikation, men deres anvendelse er forbundet med betydelige toksiciteter til knoglemarven (Ganciclovir-GCV) og nyrer (foscarnet og Cidofovir) [8], [9] og fremkomsten af ​​resistente mutanter under langvarige kurser af terapi [9], [10]. Således nye forbindelser med lav toksicitet og ideelt med en tydelig mekanisme af CMV hæmning er brug for CMV terapi.

artemisinin-afledte monomer artesunat blev oprindeligt rapporteret til at hæmme CMV replikation

in vitro

in vivo

[11], [12]. Vi har for nylig rapporteret om to artemisinin-afledte dimerer med signifikant mere potent aktivitet mod CMV replikation

in vitro

sammenlignet med artemisinin-afledte monomerer [13]. Artemisinin monomerer er i øjeblikket narkotika af valg til malaria terapi [14]. Derudover blev både artemisinin monomerer og dimerer vist at have anti-cancer aktiviteter [15] – [17]. Den potente anti-CMV-aktivitet af to artemisinin-afledte dimerer [13] fik os til at evaluere en række nyligt syntetiserede artemisinin-afledte dimerer. Vi rapporterer om de anti-CMV og anti-cancer aktiviteterne i de mest potente forbindelser i denne undersøgelse.

Resultater

En sammenligning af anti-CMV-aktivitet på 17 artemisinin derivater

Vi har tidligere rapporteret på den anti-CMV-aktivitet af fire artemisinin monomerer (artemisinin, artesunat, artemether, og artefanlide) og to artemisinin-afledte dimerer (dimer primær alkohol 606 og dimer sulfon 4-carbamat 832-4) [13]. Vi har nu testet en ny artemisinin-afledte monomer og 10 ekstra nye artemisinin-afledte dimerer og sammenlignet deres anti-CMV aktiviteter til de tidligere testede forbindelser. De forkortede navne 17 forbindelser og deres molekylvægte er anført i tabel 1. I denne rapport, er hver forbindelse nævnt af dens molekylvægt. For eksempel, forbindelse 606 refererer til den dimer primære alkohol, og 832-4 refererer til dimer sulfon 4-carbamat (tabel 1). Sulfon carbamat 551 er den monomere version af dimer sulfon carbamat 832-4. Den kemiske struktur af dimer sulfon 4-carbamat 832-4 forhindrer det i at blive kataboliseres i monomer sulfon 4-carbamat 551. Forbindelse 574, hvilket er den deoxy version af 606, blev valgt til testning, fordi anti-malaria og anti-cancer aktiviteterne af artemisininerne i det mindste delvist endoperoxid bro-afhængig [18], [19].

De to tidligere er testet artemisinin-afledte dimerer havde kraftig anti-CMV-aktivitet ved koncentrationer på 1 uM eller lavere, mens artemisinin-afledte monomerer opnået en lignende grad af CMV inhibering ved koncentrationer højere end 10 uM [13]. Baseret på disse data blev alle nye forbindelser indledningsvist screenet for anti-CMV-aktiviteter. De mest aktive forbindelser blev derefter testet i detaljer for deres anti-CMV aktiviteter. Alle dimerer blev indledningsvis evalueret ved koncentrationer på 1 uM, 0,3 pM og 0,1 pM. Deoxy dimer 574 og monomer sulfon carbamat 551 blev screenet ved 1 uM og 10 uM. Ved 1 uM, dimererne viste kraftig inhibering af sen pp28-genekspression (som stærkt korrelerer med plaque-reduktion) [20] målt ved luciferaseaktivitet, men deoxy dimer 574 og monomer sulfon carbamat 551 gjorde ikke (fig. 1A). Adskillige dimerer var også effektive ved 0,3 uM, men kun to dimerer, sulfon 4-carbamat 832-4 og diphenylphosphat 838, var stærkt inhiberende på 0,1 uM. Tre strukturelle analoger af sulfon 832-4 blev syntetiseret (832-3, 800-3 og 800-4) variation oxidationstrinnet og positionen af ​​svovlatomet på den aromatiske ring (fig. 1B). Selvom meta-sulfid (800-3), meta-sulfon (832-3), og para-sulfid (800-4) var aktive mod CMV replikation på 0,3 uM, i modsætning til para-sulfon 832-4 de ikke var aktive på 0,1 pM (fig. 1A). Derfor er den nøjagtige placering og oxidationstrin svovlatomet bidrager til dets anti-CMV-aktivitet

A:. Relativ luciferaseaktivitet af artemsinin-afledte dimerer (venstre), deoxy dimer 574 og artemisinin monomerer (højre) . Inficerede og behandlede HFFS blev opsamlet 72 hpi og vasket en gang med PBS. Lysaterne blev analyseret for luciferaseaktivitet under anvendelse af Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI). B. Kemisk struktur af analoger af dimer sulfon 4-carbamat 832-4. Afbildet er to sulfid carbamat analoger (800-3 og 800-4) og en sulfon 3-carbamat analog (832-3) af sulfon 4-carbamat 832-4. C: Cytotoksicitet af ti artemisinin-dimerer og fem artemisinin-monomerer i HFF. HFFS behandlet med dimerer /monomerer i de angivne koncentrationer blev opsamlet ved 72 og vasket en gang med PBS. Lysaterne blev analyseret for celleviabilitet hjælp CellTiter-Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay Kit på GloMax®-Multi + Detection System (Promega) ifølge producentens instruktioner.

Vi næste screenet for cellulær toksicitet af dimererne og monomerer under anvendelse CellTiter-Glo Luminescent Cell levedygtighed ved koncentrationer på 10 uM, 50 uM og 100 uM. For de fleste dimerer (undtagen 644 og 760), 50% cellulær cytotoksicitet (CC

50) varierede fra 50 til 100 pM (Fig. 1C). Monomerer samlet viste lignende cytotoksicitet mønster, men var signifikant mere toksiske end dimerer ved 100 uM (P = 0,03 ved to-halet t-test). Dimerer 832-4 og 838 havde den bedste selektivitet (SI), som er forholdet mellem CC

50 til EF

50, og blev derfor udvalgt til yderligere detaljeret analyse af anti-CMV-aktivitet.

struktur-aktivitet relationer og celle toksicitet dimerer 832-4 og 838 og deres forældre dimerer 760 og 606

En detaljeret sammenligning af anti-CMV-aktivitet og toksicitet i ikke-cancer primære HFF celler næste udført med de mest potente dimerer, 832-4 og 838 (fig. 2A). En dosis-afhængig stigning i anti-CMV-aktivitet blev observeret fra 0,01 pM til 1 uM for både dimerer 832-4 og 838 (fig. 2B, Tabel 2). Cellular toksiciteter, målt ved 1 uM til 100 uM (tabel 2), blev ikke observeret ved koncentrationer på fuldstændig CMV inhibering. EF

50, CC

50 og SI er vist i fig. 2B og tabel 2. Dimerer 832-4 og 838 havde en høj SI, men 838 var den bedste forbindelse. De forældre alkoholer, hvorfra 832-4 og 838 blev syntetiseret, 760 og 606, henholdsvis var mindre effektive end deres derivater i CMV hæmning. For 606-838 par forskellen i SI var 5-fold, og for 760-832-4 pair, 30-fold (Fig. 2A, 2B). Selvom dimer sulfon 4-carbamat 832-4 og monomeren sulfon 4-carbamat 551 har identisk sulfon 4-carbamatfunktionelle grupper (fig. 2A), dimer 832-4 var mindst 150 gange mere effektive i CMV-inhibering end monomer 551.

A: Kemiske strukturer af de to mest potente artemisinin-afledte dimerer 838 og 832-4 og deres tilsvarende forælder alkoholer 606 og 760 Monomer 551 er afbildet på venstre side af dimer 832-4. Sulfonen benzyliske dimethylcarbamat enhed er den samme i monomer 551 som i dimer 832-4. Derfor er den forøget anti-CMV-aktivitet af dimeren 832-4 løbet monomer 551 ikke skyldes nogen forskel i sulfonen carbamat del af molekylet. B: Detaljeret anti-CMV-aktivitet af dimerer 832-4 og 838, og deres respektive moderforbindelser 760 og 606. CMV-inficerede HFF blev behandlet med dimerer 832-4 og 838 i de angivne koncentrationer. 72 hpi luciferaseaktiviteten blev bestemt i lysaterne af inficerede celler. Luciferase værdier repræsenterer middelværdien og SD af data fra mindst fire uafhængige forsøg udført in triplo. Kurven montering værktøjskasse, Matlab software (v7.5), Mathworks (Natick, MA) blev anvendt til at bestemme EF

50 værdier ved hjælp af en fire-parameter logistisk regression.

Hæmning af en GCV-resistent CMV stammen af ​​dimerer 832-4 og 838

Vi evaluerede hæmning af en GCV-resistent stamme (EF

50 af GCV = 7,6 uM) af dimerer 832-4 og 838 ved hjælp af en plakreduktionsanalyse. Dimerer 832-4 og 838 blev påført på inficerede celler ved en koncentration på 0,1 uM; GCV blev påført ved 5 uM og 30 uM. Enogtyve dage efter infektion blev celler farvet med krystalviolet og plak blev talt i hver betingelse (fig. 3). Dimerer 832-4 og 838 fuldt inhiberet plakdannelse ved 0,1 uM, mens denne stamme udviste en indlysende modstand mod GCV ved 5 uM.

En plakreduktionsanalyse blev anvendt til at kvantificere inhibering af GCV-resistente CMV. CMV-inficerede HFF blev behandlet med 832-4, 838 og GCV i de angivne koncentrationer. Plaques blev talt 21 dage efter infektion.

skråninger af anti-CMV dosisresponskurver af de testede anti-CMV-forbindelser

En klassisk beskrivelse af dosis-respons-forhold er medianen effekt model baseret på masseaktion angiver, at [21]: i denne funktion, er den andel af den hæmmede brøkdel af virus, eller hæmning procentdel,

D

er lægemiddelkoncentrationen,

EF

50

er lægemiddelkoncentration, der opnår 50% af den maksimale inhiberende virkning og

m

er en hældningen af ​​kurven matematisk. Virkningen af ​​hældningen på anti-HIV-aktivitet blev for nylig evalueret, og viste sig at være en egenskab af lægemiddel klasse og en afgørende parameter dimension i analysen af ​​antiviral aktivitet [21].

Vi anvendte denne model til at vores derivater og beregnes hældningen af ​​de mest potente dimerer (832-4 og 838), GCV og artemisinin-afledte monomer artesunat (tabel 2). Sammenlignet med GCV og artesunat, som havde en anti-CMV

m Drømmeholdet værdi på ca. 1,

m

værdier på 832-4, 838, 760 og 606 var omkring 4, en indikation af, at disse forbindelser er en højpotent klasse af anti-CMV-forbindelser.

Inhibering af cancercellevækst ved dimerer 832-4 og 838

artemisinin-afledte monomerer og flere dimerer er blevet rapporteret at inhibere vækst af cancer cellelinier [16], [17]. Fire dimerer (832-4, 838, 760 og 606), to monomerer (artesunate og artefanilide) og GCV blev anvendt på tre kræft cellelinjer: HeLa (cervikal adenokarcinom), HCT116 (kolorektal karcinom) og 1205Lu (melanom) i koncentrationer fra 0,01 uM til 1 uM. MTT assayet blev udført 72 timer efter behandling og CC

50 af hver forbindelse i hver cancercellelinie blev beregnet (tabel 3). CC

50 af hver forbindelse i cancerceller blev sammenlignet med CC

50 i ikke-cancer primære HFF celler. Alle dimerer var signifikant mere aktive end monomerer i inhibering af væksten af ​​cancercellelinier. For eksempel dimeren 838 var mindst 200 gange mere potent til inhibering væksten af ​​HCT116 og 1205Lu celler og 37 gange mere potent til inhibering væksten af ​​HeLa-celler, i sammenligning med artesunat, den mest potente monomer i dette assay. Der blev observeret en kvalitativ korrelation mellem anti-CMV-aktivitet og anti-cancer aktivitet blandt de fire dimerer (838, 832-4, 606 og 760); dimer 838, den mest potente af alle testede dimerer mod CMV replikation, havde også den stærkeste effekt på vækstinhibering af cancerceller.

Discussion

Vi rapporterer her på den anti-CMV aktivitet af ti nye artemisinin-afledte dimerer, en deoxy dimer og en ny artemisinin monomer, og identifikation af de mest potente anti-CMV-dimer. Den forbedrede anti-CMV-aktivitet af dimerer sammenlignet med monomerer ikke var et resultat af øget cytotoxcity men snarere en specifik anti-CMV-aktivitet. De to mest højpotente dimerer var effektive til inhibering af laboratoriet tilpassede Towne-stammen og en GCV-resistent stamme. De blev også vist sig at have den stærkeste hæmmende virkning på væksten af ​​kræftceller.

Alle dimerer udstillet potent CMV hæmning ved 1 uM. Imidlertid kunne kun to forbindelser (832-4 og 838) vælges som højpotente anti-CMV agenter baseret på deres høje CMV hæmning 0.1 uM og deres lav cytotoksicitet. Ved denne koncentration de andre dimerer havde enten ingen hæmning eller højst 40% inhibering af luciferaseekspression, medens GCV havde ingen hæmning overhovedet.

artemisinin derivater blev oprindeligt udviklet som malariamedicin, men senere blev også fundet at have yderligere farmakologiske aktiviteter, såsom vækstinhibering af cancerceller og inhibering af CMV replikation [12], [13], [22] – [25]. Hvorvidt disse nye aktiviteter er relateret til hinanden og angive en delt mekanisme, vises endoperoxid broen at være kritisk i alle farmakologiske aktiviteter af artemisinin-derivater.

Som en generel observation, dimererne var signifikant mere potent end monomererne i CMV-inhibering. Brug af EF

50 værdier

, dimer 838 var 165 gange mere potent end artesunat i anti-CMV-aktivitet og dens SI var 134 gange højere sammenlignet med artesunat. Til støtte for denne konklusion, den model af dosis-respons hældning parameter, som for nylig blev anvendt til at karakterisere aktiviteter anti-HIV-forbindelser [21] viste, at dimerer havde en meget højere hældning end monomerer. Generelt vil en højere hældning korrelerer med en mere kraftig antiviral aktivitet. Dette kan resultere enten fra meget høj affinitet af lægemiddel binding til en enkelt ligand eller fra kooperativ virkning af multiple ligander med lignende affinitet.

Adskillige anti-cancer midler (såsom kinaseinhibitorer) er blevet vist at inhibere CMV-replikation , men generelt var koncentrationerne kræves for at opnå CMV-inhibering var toksiske for celler og forbudt deres anvendelse som anti-virale kandidater [26]. Interessant, Sorafenib, en multi-kinaseinhibitor, synes at inhibere CMV-replikation uden tilknyttet cellulær toksicitet [27]. Dimererne rapporteres her forhindrede vækst af cancer cellelinier og var potente inhibitorer af CMV replikation uden tilsyneladende cellulære toksiciteter. Derfor kan de give en ny klasse af anti-CMV agenter, med en tydelig virkningsmekanisme. Svarende til den anti-CMV-aktivitet, dimerer var også mere effektive end monomerer i inhibering af cancerceller. Fremtidige studier kan afsløre, om de dobbelte anti-CMV og anti-cancer aktiviteter af dimerer skyldes en delt virkningsmekanisme. Vi og andre har vist, at inhibering af CMV replikation med artemisinin derivater forekommer tidligt under replikation cyklus og involverer en mekanisme, som er forskellig fra DNA-polymerasen inhibitorer [28], [29]. De anti-cancer aktiviteter artemisininerne er blevet postuleret at inddrage cellecyklusstop, apoptose, og /eller angiogenese [30], processer, der også med særlige CMV gener, for det meste umiddelbare tidlige gener. . Fremtidige undersøgelser vil behandle den mekanisme af CMV hæmning af artemisinin-afledte dimerer og deres potentielle overlapning med onkogene signalsystemer begivenheder

Som konklusion, vi har vist, at: 1). Dimerer er yderst aktive mod CMV replikation, og dimer diphenylphosphat 838 er den mest potente i CMV-inhibering. 2). Dosis respons hældningen af ​​dimerer er betydeligt højere end den for artemisinin monomerer og GCV, en mulig indikation at dimerer er en særskilt klasse af anti-CMV-forbindelser. 3) Dimerer er mere potente inhibitorer end monomerer i begge kræft cellelinjer og i CMV.

Materialer og metoder

Forbindelser

Ganciclovir (GCV) blev opnået fra Roche, USA . Alle artemisinin derivater anvendt i denne undersøgelse blev syntetiseret på Johns Hopkins University [17], [31] – [33]. Nysyntetiserede dimer sulfid 3-carbamat (800-3) og dimer sulfid 4-carbamat (800-4) samt dimer sulfon 3-carbamat (832-3) blev syntetiseret som beskrevet i Materialer S1. Artemisinin-afledte monomerer og dimerer blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) og lagre af 10 mM blev opbevaret i -80 ° C. Syntetiske forbindelser var mindst 98% rent baseret på proton-NMR-spektroskopi. Den DMSO selv blev testet i CMV-inficerede celler, og det havde ikke nogen anti-viral aktivitet [13].

Vira

pp28-luciferase Towne stammen blev konstrueret som tidligere beskrevet [ ,,,0],20]. Kort fortalt blev rekombinante virus, som udtrykker luciferase under kontrol af UL99 (pp28) sen promotor genereret ved insertion af reportergenet mellem US9 og US10 åbne læserammer (ORF’er) i Towne-genomet. Ekspressionen af ​​pp28 -luciferase er stærkt aktiveret 48-72 timer efter infektion (HPI) og er næsten fuldstændigt inhiberet i nærvær af DNA-polymerase inhibitorer, såsom GCV og foscarnet [20]. Vi har for nylig rapporteret, at pp28-luciferase reporter system er følsomt, reproducerbart og stærkt korrelerer med plaque reduktion [20]. Den ganciclovir (GCV) resistent stamme blev opnået fra en patient med CMV-sygdom. Det har en UL97 mutation (H520Q) og en EF

50 på 7,6 uM for GCV. Denne kliniske isolat blev leveret af den kliniske virologi laboratoriet uden identifikatorer, der kan linke til et bestemt emne. Den Johns Hopkins Office of Human Emne Research Institutional Review Board fastslået, at denne forskning kvalificeret til en undtagelse.

Cell Culture, Virus Infektion og Anti-virale analyser

humane forhudsfibroblaster (HFF) passage 12 -16 (ATCC, CRL-2088 ™) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco, Carlsbad, CA) i en CO 5%

2 inkubator ved 37 ° C og anvendt til infektioner med pp28-luciferase Towne CMV eller GCV-resistent stamme. En dag før infektion med pp28-luciferase, 4 × 10

4 HFF celler blev podet på hver brønd af 24-brønds vævskulturplader. Infektion blev udført ved infektionsmultiplicitet på 1 PFU /celle (MOI = 1). Efter 90 minutter adsorption, blev medier indeholdende virus fjernet og erstattet af DMEM med 4% kalvefosterserum (Gibco, Carlsbad, CA) indeholdende anti-virale forbindelser. Koncentrationen af ​​hver forbindelse blev beregnet og justeret i volumen, således at det var konstant under hele forsøget.

Inficerede og behandlet HFF celler blev opsamlet 72 hpi og vasket en gang med PBS. Lysaterne blev analyseret for luciferaseaktivitet og cellelevedygtighed under anvendelse af et Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) og CellTiter-Glo Luminescent Cell Levedygtighed Assay Kit henholdsvis den GloMax®-Multi + Detection System (Promega) ifølge producentens instruktioner.

Humane lungefibroblaster (HEL) passage 8-12 (ATCC, CCL-137 ™) blev dyrket i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum. En dag før infektion, 3 × 10

5-celler blev podet på hver brønd af 12-brønds vævskulturplader. GCV-resistente CMV blev fortyndet i DMEM til en ønsket koncentration, der gav omkring 100 plaques pr brønd og sat til hver brønd i dubletter. Pladerne blev inkuberet i 90 minutter med omrystning hver 10 min; derefter lægemidler blev tilsat, og en methylcellulose overlay indført i hvert hul. Efter inkubation i 21 dage, blev cellerne farvet med krystalviolet og plaques blev talt under mikroskop ved 40 × forstørrelse.

Anti-Cancer Cells Assay

HeLa (Human Livmoderhalskræft adenocarcinom), HCT116 (Human colorectalt carcinom) og 1205Lu (humant melanom) celler (alle fra ATCC) blev opretholdt i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum. 12-16 timer før lægemiddelbehandling, 3 × 10

3 og 5 × 10

3-celler blev podet på hver brønd af 96-brønds vævskulturplader. Lægemidler blev fortyndet i DMEM indeholdende 10% føtalt bovint serum og anvendt til cellerne. 72 timer efter lægemiddelbehandling, 20 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS) blev tilsat til hver brønd, efterfulgt af omrystning af pladerne ved 150 rpm i 5 minutter og en inkubation på 4 timer (37 ° C, 5% CO

2). Medier blev fjernet, pladerne tørret og hver brønd blev resuspenderet i 100 pi MTT formazan /DMSO. Absorbansen af ​​hver brønd blev optaget ved 560 nm på GloMax®-Multi + Detection System (Promega).

Støtte oplysninger

Materialer S1.

1) Syntese af Dimer sulfid 3-Carbamat 800-3. 2) Syntese af dimer sulfon 3-Carbamat 832-3. 3) Syntese af dimer Sulfid 4-Carbamat 800-4. 4) Syntese af deoxy-artemisinin alkohol 574. 5) Syntese af monomer sulfon Benzylisk dimethylcarbamat 551.

doi: 10.1371 /journal.pone.0024334.s001

(DOC)

Tak

Vi takker Michael Forman fra Institut for Patologi, Johns Hopkins Medical institutioner, Baltimore, Maryland, for at give GCV-resistente CMV.