PLoS ONE: positionelle Kortlægning og Candidate Gene Analyse af Mouse Ccs3 Locus der regulerer Differential Modtagelighed for kræftfremkaldende-induceret Colorectal Cancer

Abstrakt

Ccs3

locus på mus kromosom 3 regulerer differentieret modtagelighed af A /J (A, modtagelig) og C57BL /6J (B6, resistent) musestammer til kemisk induceret kolorektal cancer (CRC). Her rapporterer vi den høje opløsning positionelle kortlægning af genet ligger til grund for

Ccs3

effekt. Brug af fænotype /genotype korrelation i en serie på 33 ACB /BCA rekombinante kongene musestammer, såvel som i grupper af tilbagekrydsning populationer, der bærer unikke rekombinante kromosomer for intervallet, og i subcongenic stammer, har vi afgrænset den maksimale størrelse på

Ccs3

fysisk interval til en ~2.15 Mb segment. Dette interval indeholder 12 kommenterede udskrifter. Sekventering af positionelle kandidater i A og B6 identificeret mange enten lav prioritet kodning ændringer eller ikke-protein-kodende varianter. Vi fandt en unik kopi nummer variant (CNV) i intron 15 i

Nfkb1

gen. CNV består af to kopier af en 54 bp sekvens umiddelbart ved siden af ​​exon 15-splejsningsstedet, mens kun én kopi findes i CRC-modtagelige A. Nfkb1 protein (p105 /p50) ekspression meget reduceret i A tumorer sammenlignet med normale En tyktarmsepitelet som analyseret ved immunohistokemi. Studier i primære makrofager fra A og B6 mus demonstrerer en markant differentieret aktivering af NFKB vej ved lipopolysaccharid (kinetik stimulering og grænseværdier for phosphoryleret kBa), med en mere robust aktivering blive associeret med resistens over for CRC. NFKB har tidligere været impliceret i reguleringen homeostase og inflammatorisk respons i tarmslimhinden. Intervallet indeholder en anden positionelle kandidat

Slc39a8 Hoteller, som er forskelligt udtrykt i A vs B6 koloner, og der er for nylig blevet associeret i CRC tumor aggressivitet hos mennesker

Henvisning:. Meunier C, Van Der Kraak L, Turbide C, Groulx N, Labouba I, Cingolani P, et al. (2013) positionelle Kortlægning og Candidate Gene Analyse af Mus

Ccs3

Locus der regulerer Differential Modtagelighed for kræftfremkaldende-induceret kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (3): e58733. doi: 10,1371 /journal.pone.0058733

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: December 6, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 14. marts 2013 |

Copyright: © 2013 Meunier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til PG og NB fra den canadiske Cancer Society Research Institute [www.cancer.ca/Research.aspx], Cancer Research Society Inc. [www.src-crs.ca/en-CA] og Canderel initiativ Program [www.deficanderel.com/3/donate.htm] af Goodman Cancer Research Centre [cancercentre.mcgill.ca/research/]. PG er en James McGill professor i biokemi. CM fik studentship støtte og rejse priser fra McGill Integrated Cancer Research Training Program (MICRTP) og Peter Quinlan Foundation [www.mcgill.ca/gcc-research/funding/] gennem McGill University Faculty of Medicine. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

patogenesen af ​​colorektal cancer (CRC) er forbundet med den sekventielle akkumulering af mutationer i specifikke gener, der forårsager trinvis progression fra præneoplastiske læsioner til fuld blæst adenocarcinom [1]. Histopatologiske stadier korrelerer med somatiske omlejringer er velbeskrevet [1], [2]. Men først i de senere år, og med fremkomsten af ​​genom-dækkende associationsstudier har graden af ​​kompleksitet i samspillet mellem genetiske og miljømæssige komponenter, der bidrager til ætiologien af ​​menneskelige kolorektal cancer blevet værdsat [3], [4], [5] [6]

for en lille del af CRC tilfælde ( 10%)., kan der observeres en klar og meget penetrant genetiske determinant i arvelige cancer syndromer, vigtigst familiær adenomatøs polypose (FAP), Lynch syndrom (Arvelige ikke-polypose coloncancer) og skiftevis, inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) -bundet CRCs [7], [8]. På den anden side, de fleste CRC tilfælde ( 90%) er sporadiske uden forudgående familiehistorie. Ætiologien af ​​sporadisk CRC involverer to-vejs interaktioner mellem en kompleks genetisk komponent, og dårligt definerede miljømæssige faktorer [3], [6]. Til dato har så mange som 16-20 almindelige lav penetrans varianter blevet identificeret i genom-dækkende forbindelsesundersøgelser (GWAS) human- sporadisk CRC [9], [10]. Næsten halvdelen af ​​disse loci er tæt forbundet eller allel med komponenter af TGFß signalvejen: SMAD7, GREM1, BMP-2, BMP4, RHPN2 og LAMA5 ([11], [12], revideret i [13]). På den anden side er det blevet foreslået, at så mange som 170 sådanne loci kan bidrage til CRC modtagelighed hos mennesker [13].

Over 25% af alle cancere menes at være forbundet med kronisk infektion, inflammation eller andre typer af inflammatorisk respons [14]. Kronisk betændelse er for nylig blevet værdsat som en stor bidragyder til ætiologien af ​​CRC i mennesker [15], [16], revideret i [13]. Således patienter med inflammatoriske tarmsygdomme (IBD) har en meget højere risiko for at udvikle colitis-associerede (CA) CRC, omfanget af colitis manifestation korrelerer med forekomsten af ​​CA-CRC [17]. Desuden non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) viser en beskyttende virkning mod forskellige typer af cancere [18]. Interessant nok har flere centrale komponenter af TGF-medierede Th17 og Th1 immunrespons veje for nylig blevet identificeret som lav penetrans loci forbundet med IBD debut, som kunne implicere TGFp signalering i både IBD-forbundet samt sporadiske CRC’er ([15], [ ,,,0],16], revideret i [19], [20]).

musen repræsenterer en værdifuld eksperimentel model til at dissekere det komplekse genetiske komponent i human CRC. Mus er tilgængelige som indavlede stammer fastsat for homozygoti for forskellige allelvarianter repræsenterer bred genetisk diversitet på centrale gener og veje er relevante for CRC patogenese. Desuden kan CRC induceres på en reproducerbar og godt kontrolleret måde ved hjælp af kemiske mutagener, såsom azoxymethan (AOM) [21], [22]. De resulterende tumorer ligner deres menneskelige modstykke med hensyn til histopatologi (fra afvigende krypt foci til karcinom

in situ

) og underliggende genetiske ændringer (mutationer i

Apc

,

Kras

og

ß-catenin

) [23], [24]. Indavlede musestammer viser markante forskelle i modtagelighed for kræftfremkaldende-induceret CRC og klassisk kobling analyser i informative kors har lokaliseret flere loci, der regulerer inter-stamme forskelle i modtagelighed [25], for eksempel,

Ccs1

[26],

Ssic1

[27], og

Ccs2

[28]. Parallelle undersøgelser i kongene stammer afledt af BALB /Chea og STS /A foreslog en flerhed af yderligere loci (

Scc1

til

Scc15

) påvirker respons på kræftfremkaldende-induceret CRC [29], [30 ]. Af dem, den positionelle kloning af

Scc1

locus førte til identifikation af

Ptprj

som forårsagende gen, og somatiske omlejringer i det menneskelige homolog

PTPRJ

blev identificeret i humant CRC [31], [32].

i AOM kemisk carcinogenese model, C57BL /6J stamme (B6) er resistent med få CRC tumorer noteret 18 uger efter påbegyndelse af behandling (typisk 0-5 tumorer), mens A /J (A) er meget modtagelige med tumor mangfoldigheden varierer mellem 20-50 [33]. I vores laboratorium har vi anvendt et sæt af ACB /BCA rekombinante kongene muselinjer (RCS) afledt af CRC-resistente B6 og CRC-modtagelige A at identificere de genetiske determinanter, der er ansvarlige for den differentielle modtagelighed af disse stammer til AOM-inducerede CRC. De 13 ACB og 22 BCA stammer blev afledt ved systematisk indavl fra en dobbelt tilbagekrydsning (N3), og hver stamme indeholder en lille mængde (12,5%) af DNA fra en af ​​forældrene fastsættes som et sæt diskrete kongene segmenter (kortlagt ved genotypebestemmelse) på baggrunden (87,5%) af den anden forælder. Individuelle modstand /modtagelighed loci, der bidrager til en kompleks træk kan adskille i individuelle RCS og kan studeres i isolation, fremme gen identifikation undersøgelser. Dette førte til kortlægningen af ​​tre loci (

Ccs3

,

Ccs4

,

Ccs5

) regulerer respons på AOM-induceret CRC i disse stammer [33], [34] , [35].

Ccs3

locus afgør indledende modtagelighed for AOM-induceret CRC (udseende adenomer), mens

Ccs5

locus modulerer tumor mangfoldigheden i dyr, der bærer modtagelighed alleler i

Ccs3

[ ,,,0],34].

Ccs3

locus blev kortlagt til en 14 Mb segment på den centrale del af kromosom 3. Dette interval indeholder 94 kommenterede transkripter, og flere af disse gener viser robust ekspression i colon, selv reguleret i en stamme-specifik mode.

i den aktuelle undersøgelse, har vi foretaget genetiske analyser i ACB /BCA stammer og i kors er afledt af dem til yderligere at indsnævre størrelsen på

Ccs3

genetisk interval til 2,2 Mb. Vi har yderligere kendetegnet generne i intervallet ved ekspression profilering og genomisk DNA-sekventering.

Resultater

Afgrænsning af Ccs3 interval i AcB /BCA rekombinant kongene og AxB /BxA rekombinante indavlede stammer

fænotypning en delmængde af 23 ACB /BCA stammer til modtagelighed for AOM-induceret CRC oprindeligt viste, at forskellen modtagelighed a og B6 musestammer til CRC er reguleret af en enkelt locus udpeget

Ccs3

. I disse undersøgelser

Ccs3

blev kortlagt til en 14 Mb segment på den centrale del af kromosom 3 [33]. For bedre at afgrænse den

Ccs3

genetisk interval, vi fænotypebestemt yderligere ACB /BCA stammer (hvilket bringer det samlede til 33 stammer), samt en delmængde af AxB /BXA stammer (AXB19, AXB24, BXA2, BXA8, BXA12 ), med nogle af disse stammer bærer informative rekombinante haplotyper i

Ccs3

region. Grupper af mus blev behandlet med 1 ugentlige dosis af AOM injektion i 8 uger, og 11 uger senere blev dyrene aflivet, koloner blev opsamlet og tumorer blev scoret. Stammer blev stratificeret i forhold til antallet af tumorer detekteret, som enten lav /mellemliggende (≤ 10 tumorer) eller høje ( 15 tumorer) [33]. Denne bimodale stamme fordeling mønster blev derefter overlejret på den kendte haplotype kombination af A og B6 alleler for distal kromosom 3 (

Ccs3

) i disse stammer. Et resumé af alle tilgængelige data fra AcB /BCA og AXB /BXA stammer er vist i figur 1A. Denne analyse bekræftede kritiske rolle

Ccs3

alleler i CRC modtagelighed træk og yderligere identificerede stammer AcB52 og AcB60 som transporterer informative rekombinante haplotyper yderligere afgrænser grænserne for locus på de proksimale og distale sider hhv. For bedre at afgrænse de rekombinations breakpoints i disse stammer, vi udviklet adskillige yderligere informative markører (mikrosatellit og SNP markører) i denne region af genomisk DNA-sekventering af A og B6 forældre (se materialer og fremgangsmåder). Under anvendelse af disse markører, vi yderligere afgrænset rekombinations breakpoints på den proximale side (AcB52), mellem markører P3-17 (pst. 132,558 Mb) og P3-19 (pst. 132,562 Mb), og på den distale side (AcB60) mellem markører D4-11 (pst. 136,18 Mb) og rs30215915 (pst. 136,20 Mb) (fig. 1B). Disse undersøgelser yderligere reduceret størrelsen af ​​den maksimale fysiske interval af

Ccs3

locus til 3,64 Mb (P3-17 til rs30215915).

A. Kromosom 3 haplotyper af ACB /BCA stammer vises sammen med deres modstand (hvid) eller modtagelighed (sort) status for AOM-inducerede CRC (bundliste). B6-afledte kromosomale segmenter er angivet i grå (2), mens a-haplotyper er kommenteret i hvid (1). Pile (↓) angiver vigtige RCS stammer afgrænser den mindste kromosomale interval for

Ccs3

locus. B. Detaljeret haplotype kort over

Ccs3

locus, herunder afgrænsning af den proksimale og distale grænser af high-density SNP genotypning i vigtige informative kongene stammer (AcB52, AcB60).

høj opløsning positionelle kortlægning af Ccs3 locus ved afkomsprøver af informative tilbagekrydsning mus

i disse undersøgelser, vi producerede (B6xA) F2 dyr, som blev genotypede at identificere informative rekombinanter inden for

Ccs3

interval , der anvender markører rs30055788 på den proximale side og rs30215915 på den distale side. Blandt et sæt af 240 F2 dyr screenet, vi identificeret 3 informative rekombinanter, som blev betegnet RecA, RECB og recc. Hver rekombinant blev derefter tilbagekrydses på både B6 og A baggrund, og multipel afkom fra individuelle krydser blev derefter genotype for markører i intervallet og fænotypebestemt til disponering for CRC (fig. 2A, 2B). I denne analyse, afkom af tilbagekrydsning mellem de enkelte Rec mus (A, B, C) og enten A eller B6 forældre viste en blanding af rekombinante haplotyper i regionen med kombinationer af homozygositet for A eller B6 alleler eller heterozygositet for A /B-alleler (fig. 2B). Vi derefter sammenlignet genotypen af ​​de rekombinante kromosomer med fænotypen af ​​A og B6 backcrosses afledt heraf (fig. 2a, 2b). Forældrekontrol A kontrol udviklet høj tumor numre (X = 45,5;. Figur 2A), mens B6 kontroller var lav (X = 1,0; p 0,0001). Afkom test af RECB og recc tilbagekrydset til B6 viste samlede tumor tal i disse mus ligner B6 kontrol, efter aftale med homozygoti for B6 haplotyper i den distale del af den tidligere definerede

Ccs3

region. Omvendt afkom test af RecA og RECB krydser til A viste tumor tal i disse dyr, der ikke var statistisk forskellige fra dem påvist i forældrenes A kontroller (selvom RECB XA var mere mellemliggende) efter aftale med homozygositet for A-allelen på den distale del af

Ccs3

(Mb134.0-136.2). Endelig observerede vi en tredje gruppe af dyr, som viste mellemliggende tumor mangfoldigheden mellem den af ​​de to forældre ekstremer (X = 8,5;

s

0,001 for begge sammenligning); disse inkluderet RecA x B6 (genotype BB proksimale /AB distalt; genotype AB proksimale /AB distal), RECB X B6 (AB proksimal, AB distal), RECB XA (AA proksimale /AB distal), og recc XA (AB proksimal, AB distal). I denne gruppe af dyr, var der en stærk korrelation mellem mellemliggende tumor mangfoldigheden og heterozygositet for A /B haplotyper på den distale del af

Ccs3

interval, i overensstemmelse med den fælles dominerende mønster af arv af

Ccs3

alleler vi tidligere rapporteret [33]. Den kombinerede virkning af A /A, A /B og B /B-alleler på den distale del af

Ccs3

er vist i figur 2C. Disse eksperimenter yderligere reduceret størrelsen af ​​

Ccs3

interval at ~2.15 Mb som afgrænset på den proximale side af gensidige rekombination begivenheder i RecA og RECB (i rs31197594 og rs52356981 interval) og på den distale side rekombination begivenhed i AcB60 (i rs31197594 til rs30215915 interval) (fig. 1).

A. Efter AOM behandling blev koloner dissekeret, fikseret, og antallet af tumorer blev scoret (individuelle mus er vist som ‘•’). Kontrol og tilbagekrydsning mus, der svarer til de vigtigste rekombinanter (Rec A, Rec B og Rec C), hvor opdrættet til A /J (angivet A) og C57BL6 /J (angivet som B). Musene blev grupperet efter haplotype på

Ccs3

locus og rekombinante dyr bærer et andet haplotype på hver halvdel af

Ccs3

interval. Grupper, der viser tumor numre statistisk forskellig form En forældrenes gruppe identificeres (#). B.

Ccs3

haplotype på distale kromosom 3 i hver gruppe af mus fænotype i panel (A) er vist i sort (B6), hvid (A /J) eller stribede (heterozygoter). Stiplede linjer viser intervallet først identificeret i RCS (pil) samt den nedsatte genetiske interval for

Ccs3

foreslået af en rekombinationsbegivenhed i Rec A og Rec B mellem markører rs31197594 og rs52356981, på den proximale side (kasse ). Den distale grænse blev estimeret fra undersøgelser i rekombinante kongene stammer fra figur 1B. C. Samlet genotype /fænotype korrelation af puljet tilbagekrydsning mus for den reducerede

Ccs3

interval (Mb134.0-136.2).

Placeringskrav kandidater til Ccs3 locus

Den ~2.15 Mb

Ccs3

interval indeholder 12 kodning gener, en mikro-RNA (

Mir1895

), samt flere lange ikke-kodende RNA (lincRNA) og én retroposon (fig. 3A og data ikke vist). Sekvensen for 2,15 Mb segmentet blev sammenlignet mellem A og B6 hjælp henvisning genom-sekvenser tilgængelige fra Wellcome Trust Sanger Institute [36], og en komplet liste over alle exoniske, introniske og intergeniske varianter er vist i tabel S1. Der er ingen SNPs, der adskiller A og B6 i enten

Mir1895

(pst 133.903.469-133.903.547) eller i lincRNAs og retroposon findes på positionerne 134810372-134810477 (105 nt), 135.099.190-135.100.723 (1537 nt), 135158617 -135.158.847 (231 nt), 135.188.928-135.189.496 (569 nt), 135.390.302-135.391.702 (1401 nt), 135.626.423-135.626.782 (360 nt) i Ensembl datasæt. Derfor er det usandsynligt, at disse ikke-kodende RNA er ansvarlige for

Ccs3

effekt, selv om et bidrag på sådanne ikke-kodende RNA kan endnu ikke formelt udelukkes. Blandt de 12 kommenterede kodning gener i intervallet (

Cxxc4

,

Tacr3

,

Cenpe

,

Bdh2

,

Nhedc2

,

Nhedc1

,

Cisd2

,

Ube2d3

,

Manba

,

Nfkb1

,

Slc39a8

,

Bank1

), et antal nukleotidvarianter skelne a og B6 (tabel 1. tabel S1), med enkelt ikke-synonyme aminosyre-varianter fundet i Manba (L844F) og Bank1 (A375M). Manosidase beta a (Manba) er et lysosomale enzym, inaktivering af hvilket forårsager beta-manosidosis, en lysosomal storage disease med et bredt spektrum af neurologiske inddragelse [37]. Således er en patologisk variant i dette gen ikke formodes at fremkalde modtagelighed for CRC. På den anden side, den A375M variant i Bank1 (B-celle stillads protein med ankyrin repeats) er en konservativ substitution, der påvirker en rest ikke-konserveret i Bank1 slægtninge (data ikke vist), og er således usandsynligt, at være patologisk.

A.

Ccs3

locus indeholder 12 kommenterede udskrifter, hvilken position, retning af transskription (pil), og placeringen af ​​reference- SNP markører er vist. B. Placeringen af ​​langtrækkende amplifikationsprodukter anvendes til dyb sekventering af

Nfκb1

er vist at skalere sammen med placeringen af ​​de 25 kodende og ikke-kodende exons af

Nfκb1

. Positionen af ​​54 bp intron sletning identificeret i A /J vises. Den svarer til tabet af en direkte 54 bp repeat som er til stede i to eksemplarer på B6 (gråskraveret), som selv er sammensat af en 3-repeat struktur (identificeret med pile over sekvensen). Positionen af ​​kopiantallet variant i forhold til exon 15 i genet er vist, sammen med et fremspring i exon 15 translaterede sekvens på forudsagte proteinstruktur. Forudsagte p50 og IκBγ dele af proteinet er vist, sammen med Rel homologi domæne (RHD), ankyrin-gentagelser (ANK), dødsdomæne (DEAD) og glycin-rige region (G) adskillelse p50 og p105 (kaldet IκBγ).

Vi har tidligere rapporteret RNA udskrift profilering undersøgelser, sammenligner ekspression af gener i

Ccs3

interval både for A vs B6 normal slimhinde, og for normal slimhinde vs. tumorer fra A mus [33]. Re-sekventering af alle kommenterede kodende exoner og exon /intron-grænserne blev foretaget for gener viser høj ekspression i normal colon mucosa (

Cisd2, Ube2d3

,

Nfκb1

Slc39a8

). På grund af sin tidligere tilknytning til colon epitel homeostase, og inflammatorisk respons

in situ

,

Nfκb1

gen af ​​vores En mus lager blev sekventeret i sin helhed (130 kb). Dette kombineret analyse undladt at identificere nukleotid varianter, der er ramt konsensus splice websted sekvenser (tabel S1), med undtagelse af en kopi nummer variant (CNV) bestående af en 54 bp element placeret 13 nukleotider nedstrøms 3′-splejsningsstedet af exon 15 ( fig. 3B). Dette element er til stede som to eksemplarer B6 genomisk DNA, men en kopi mangler den tilsvarende position i A. duplikeres 54 bp element findes i B6 er i sig selv en del af en repetitiv DNA motiv består af 3 close-til-identiske DNA-gentagelser der omfatter 3′-splejsningssted af

Nfκb1

exon 15 i B6-genomet (fig. 3B). Udeladelsen af ​​en af ​​de to 54 bp elementer i A forstyrrer integriteten af ​​3-repeat motiv findes i B6 DNA. Variabiliteten i antallet af disse close-til-identiske DNA gentagelserne foreslog en mulig ændring i sekundær sekvens kropsbygning på dette kryds af exon 15 /intron 15 i genomisk DNA og /eller forløber RNA. Faktisk foreløbig analyse af sekundær struktur af et DNA fragment over 350 bp der spænder over 3-repeat motiv viser tilstedeværelse af en formodet pseudoknot i B6 mus (Fig. 4A), som er fraværende fra et genomisk DNA (fig. 4B). Endvidere 54 bp-element, en kopi af som er fraværende i A, viser tværs af arterne sekvenslighed mellem mus, human og adskillige andre arter (fig. 5A), hvilket antyder en mulig konserveret rolle af dette element og den dertil knyttede sekundære struktur på tværs flere arter. Interessant nok synes der at være betydelige sekvenskonservering af intron 15 på tværs af arter, mens nukleotidsekvensen og den forudsagte

Nfκb1

exon 15 aminosyresekvens viser dårlig bevaring cross-arter (fig. 5A, 5B). Den særlige rolle, som denne CNV ville regulere Nfkb1 funktion blev undersøgt, men indtil videre er der ikke klar mekanisme blevet identificeret (se Diskussion).

pknotsRG værktøjet [77] blev anvendt til at generere sekundære strukturer til 350 nukleotider segment spænder over 3-repeat struktur B6 (A) og deletionsvarianten karakteristisk for A /J (B). Uparrede baser er angivet i blå, gule baser identificerer nukleotider involveret i pseudoknot strukturer. Denne analyse identificerer en pseudoknot med omfattende intra-molekylær komplementaritet som afbrydes i A /J-variant allel.

A. ClustalW alignment (EBI) af

Nfκb1

intron 15 sekvenser fra forskellige arter (vist til venstre for justeringen). Henvisningen muse sekvens fra B6 fremgår på toppen, herunder enkelt bogstav aminosyre- kode for polypeptidsegmentet kodet af exon 15. Den genomiske sekvens for A er vist nøjagtigt som i fig. 3B, herunder den slettede 54 bp overlapning ( ‘— «) og 3-repeat DNA-motiv overlapper 3’-splejsningssted i exon 15 (pile). Begge mus sekvenser (B6 og A) er blevet tilpasset tilsvarende rotte, hund, hest og humane genomiske sekvenser. Bevarelse af hver mus nukleotid er repræsenteret som skraverede kasser i bunden med høj (sort) til lav (hvid) bevarelse niveau. B.

Nfκb1

cDNA, der kodes af exon 13 til exon 17 (vises som skiftende understreget og regelmæssig format for hver exon) af mus og menneskelige gener er blevet justeret. Den mindste bevarede del af sekvensen er, at der kodes af exon 15, hvilken sekvens er i fed skrift. Bevarede nukleotider tværs sekvensen identificeres (*).

Aktivering af NFKB Pathway

Vi undersøgte også aktivering af NFKB vej i A og B6 stammer, ved hjælp af en standard LPS induktion assay i primære makrofager (BMDM). Induktion af NFKB i makrofager og intestinale epitelceller er meget lig med hensyn til induktion signaler, der er aktive i begge celler (LPS /TLR4; NOD1 /peptidoglycan; TNF /TNF-R) og tid kinetik [38]. BMDM blev udsat for LPS, og på forskellige tidspunkter blev cellerne lyseret og analyseret ved Western-blot for ekspression af P50 og P105 Nfκb1 isoformer, total og phospohorylated (p-) kBa samt den samlede og phosphoryleret IKB kinase, (p -) Iκkβ (fig 6).. Disse eksperimenter viste lignende niveauer af ekspression af Nfκb1 p50 og P105 proteiner, og total Iκkβ. Disse niveauer forblev ens i hele varigheden af ​​behandlingen. , Aktivering af NFKB-vejen med LPS var dog meget stærkere i B6 end i en makrofager, som bestemt ved fremkomsten af ​​aktiverede p-Iκkβ og den samtidige nedgang i kBa langs påvisning af p-kBa, målrettet til nedbrydning. I B6 makrofager, forekom NFKB-aktivering hurtigere og var mere robust end i A BMDM (kinetik udseende og samlede mængde p-kBa og p-Iκkβ). Samlet set har disse resultater identificerer svagere NFKB aktivering for A-celler i forhold til B6 celler i respons på stimulering ved mikrobiel LPS.

Bone marv-afledte makrofager blev fremstillet af A (

Ccs3

S

) og B6 (

Ccs3

R

) mus og stimuleredes i nærvær af lipopolysaccharid (LPS). I de angivne tidsintervaller (minutter, vist øverst) blev celler høstet, lyseret og totale proteinekstrakter blev fremstillet. Prøver blev opløst på 10% SDS-PAGE og analyseret ved immunoblotting med antistoffer mod NFKB (p50, P105), i alt og phospohorylated (p-) kBa samt total og fosforylerede IKB kinaser, (p-) IKKα /β og β- actin som lastning kontrol. Molekylvægten af ​​individuelle proteiner er vist til højre for hver tavle, som hver især repræsenterer 3 uafhængige eksperimenter.

Ekspression af Nfκb1 p105 /p50-proteiner i normal slimhinde og i tumorer fra A /J

Vi undersøgte ekspression af Nfκb1 p105 precursor ved immunhistokemi ved anvendelse af et antistof (se Materialer og metoder), som genkender både p105 og p50 Nfκb1 produkt. I denne analyse, vi indgår på samme sektioner både normal slimhinde, dysplastiske læsioner og mere avancerede adenokarcinomer enten intramucosal eller protubing i tarmlumen, alle opnået ved obduktion fra A mus 18 uger efter behandling. Flere repræsentative billeder er vist i figur 7. I normal slimhinde, er NFKB proteinfarvning set i krypter, overvejende kerner af intestinale epitelceller (IEC), og kan også påvises i sub-population af lamina propria-celler. Denne farvning er stort set fraværende i tilstødende områder af væv hyperplasi /adenomer (fig. 7f /h), samt i sektioner med yderligere udviklet tumorer (adenocarcinomer) set i tarmlumen (fig 7b /d). Disse resultater indikerer et tab af Nfκb1 proteinekspression i kræft med lav og høj kvalitet dysplasi observeret i A /J-mus.

Repræsentant immunhistokemisk farvning (IHC) for p105 /P50 Nfkb1 protein i tumorer og tilstødende tyktarmsepitel fra mus, der bærer homozygote A /J-haplotype på Ccs3. 5 × forstørrelse (a, c, e, g) og tilsvarende 20 × forstørrelse (b, d, f, h) er vist for fem repræsentative tumorer.

Diskussion

I senere år har genom-dækkende forbindelsesundersøgelser (GWAS) pegede på en imponerende antal genetiske faktorer, der bidrager til CRC modtagelighed hos mennesker [4], [5]. Desuden er det i stigende grad erkendt, at miljømæssige faktorer, såsom kost, livsstil og mikrobielle flora yderligere kan bidrage til at modulere penetrans eller ekspressivitet af genetisk prædisposition. Bidraget fra de enkelte gener til CRC modtagelighed kan vurderes i relevante musemodeller, hvor der kan styres både genetiske og miljømæssige faktorer [6]. Ligeledes kan ‘frem genetiske’ dissektion af differentieret modtagelighed indavlede stammer til CRC identificere nye geneffekter, relevansen af ​​som efterfølgende kan testes for human CRC [21].

I den aktuelle undersøgelse, vi har reduceret størrelsen af ​​

Ccs3

at ~2.15 Mb, en størrelse modtagelig for positionel kloning [39]. Dette interval indeholder 12 kommenterede udskrifter, heraf 6 er udtrykt i tarmen (fig. 3A). En af dem koder p105 Nfκb1, en stærk positionel kandidat og central del af NFKB signalering. Selv om mange polymorfe varianter blev identificeret mellem A og B6 for gener i intervallet, blev ikke klart patologiske missense eller nonsens varianter identificeret i deres kodende regioner. Immunohistokemisk farvning (IHC) viste stærk nuklear Nfκb1 ekspression i normale tyktarmsepitelet, mens hosliggende tumorer i det samme væv udtrykte meget lavt niveau Nfkb1 protein (fig. 7). Dette antyder, at kolon tumorigenese er forbundet med nedregulering af P105 Nfκb1 i vores musemodel for AOM-inducerede CRC. Derudover har vi opdaget en sletning nær

Nfκb1

exon 15 i A mus. De 54 bp intron deletion Maps om 3-enhed gentagelse struktur, der overlapper 3′-splejsningssted af

Nfκb1

exon 15. Den tilsvarende sekvens af intron 15 viser bemærkelsesværdig bevaring tværs af arterne, og segmentet påvirket af deletion forudsiges at danne en meget stabil sekundær struktur, der er forstyrret i a-genomet. DNA-elementer er til stede i introner vides at påvirke RNA-bearbejdning som sekvenselementer [40] eller som sekundære strukturer, som kan bindes af dsRNA bindende proteiner [41], [42]. Derudover kan sekundær DNA-struktur, såsom ssDNA hårnåleløkker også påvirke DNA-protein anerkendelse [43], genekspression og DNA-rekombination [44]. Hårnåle dannet i DNA-gentagelser har været forbundet med en række genetiske sygdomme [45], [46], [47]. Vigtigere, protein ekspressionsundersøgelser i LPS-behandlede primære makrofager fra A og B6 mus demonstrerer forskellen aktivering af NFKB-vejen i disse celler. Ved monitorering tidsafhængig aktivering og maksimal akkumulering af aktiverede p-Iκkβ og p-kBa målrettet til nedbrydning vi bemærket, at en mere robust aktivering af NFKB-vejen er forbundet med et markant fald i følsomhed over for CRC. Derfor konvergensen af ​​genetisk kortlægning data placering

Nfκb1

i ~2.15 Mb interval på

Ccs3

, den kendte rolle NFKB vej i homeostase af tarmslimhinden (se nedenfor), detekteret tab af NFKB p105 /p50-protein-ekspression i tumorer sammenlignet med normal slimhinde, den observerede differentiel aktivering af denne vej hos dyr af forskellige

Ccs3

haplotyper, og tilstedeværelsen af ​​et karakteristisk genetisk ændring i genet, sammen pege på

Nfκb1

som en meget stærk kandidat til

Ccs3

effekt.

Nfκb1 er medlem af NFKB familie af transkriptionsfaktorer, der deler en amino-terminal DNA binding og dimerisering Rel homologi domæne. Men det mangler en transkriptionsaktiveringsdomæne (TAD) og er afhængig af heterodimerisering med TAD-holdige NFKB familiemedlemmer (p65 /RelA, RelB, c-Rel) til at aktivere transkription [48]. Nfκb1 syntetiseres som et p105 precursor.