PLoS ONE: Genetisk variation i mTOR Pathway og prostatakræft risiko i den europæiske Prospective Investigation om kræft (EPIC)

Abstrakt

mTOR (pattedyr mål for rapamycin) signaltransduktionsvej integrerer forskellige signaler, der regulerer ribosom biogenese og proteinsyntese som en funktion af tilgængelige energi og aminosyrer, og sikre en passende kobling af celleproliferation med stigninger i cellestørrelse. Desuden har nyere beviser pegede på et samspil mellem mTOR og p53 veje. Vi undersøgte den genetiske variabilitet af 67 nøglegener i mTOR pathway og i gener af p53 pathway, der interagerer med mTOR. Vi testede den sammenslutning af 1.084 tagging SNPs med risiko prostatakræft i en undersøgelse af 815 prostatakræft tilfælde og 1.266 kontroller indlejret i den europæiske Prospective Investigation ind Cancer and Nutrition (EPIC). Vi valgte SNPs (n = 11) med den stærkeste association med risiko (p 0,01) og søgte at replikere deres forening i en ekstra serie af 838 prostatakræft tilfælde og 943 kontroller fra EPIC. I den fælles analyse af første og anden fase to SNPs i

PRKCI

gen viste en forening med risiko for prostatakræft (OR

allel = 0,85, 95% CI 0,78 til 0,94, p = 1,3 × 10

-3 for rs546950 og OR

allel = 0,84, 95% CI 0,76-0,93, p = 5,6 × 10

-4 for rs4955720). Vi bekræftede dette i en meta-analyse ved brug som replikering sæt data fra den anden fase af vores undersøgelse sammen med den første fase af kræft genetiske markører af følsomhed (CGEMS) projekt. Afslutningsvis fandt vi en forening med risiko prostatakræft for to SNPs tilhører

PRKCI

, et gen, der ofte overudtrykt i forskellige neoplasmer, herunder prostatakræft

Henvisning:. Campa D, Hüsing A, Stein A, Dostal L, Boeing H, Pischon T, et al. (2011) Genetisk variation i mTOR Pathway og prostatakræft risiko i den europæiske Prospective Investigation om kræft (EPIC). PLoS ONE 6 (2): e16914. doi: 10,1371 /journal.pone.0016914

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Oktober 6, 2010; Accepteret: 1. januar 2011; Publiceret: 23 feb 2011

Copyright: © 2011 Campa et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Specifikke resultater af denne undersøgelse blev opnået med støtte fra den amerikanske hær Medical Research og Material Kommando (W81XWH-05-1-0156). https://cdmrp.army.mil/pcrp/default.shtml. Den EPIC Undersøgelsen blev finansieret af “Europa mod kræft” Program for Europa-Kommissionen (SANCO); Ligue contre le Cancer (Frankrig); Société 3M (Frankrig); Mutuelle Générale de l’Education Nationale; Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); German Cancer Aid; German Cancer Research Center; Tyske ministerium for uddannelse og forskning; Dansk Kræftens Bekæmpelse; Health Research Fund (FIS) i den spanske sundhedsministerium; de deltagende regionale regeringer og institutioner i Spanien; Cancer Research UK; Medical Research Council, UK; Græske ministerium for sundhed og social samhørighed; Den Stavros Niarchos Foundation og Den Hellenske Health Foundation; Italienske sammenslutning Kræftforskningscenter; Italienske National Research Council; Hollandske ministerium for offentlig sundhed, velfærd og sport (VWS), hollandsk Sundhedsministeriet, Holland Cancerregisteret (NKR), LK forskningsmidler, hollandsk Forebyggelse Funds, hollandsk ZON (Zorg Onderzoek Nederland) World Cancer Research Fund (WCRF) (The Nederlandene); Statistik Holland; Svensk Cancer Society; Svensk Videnskabelige Råd; Regional regering Skåne, Sverige; Norske Kræftens Bekæmpelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Inden prostata væv, er tumorfremmende effekter af endogene hormoner og vækstfaktorer menes at være forbundet med stimuleringen af ​​cellulær vækst og mitose, og inhibering af apoptose. Foruden signalering med IGF-I (men også insulin og andre vækstfaktorer), vækst og proliferation af celler er co-bestemt ved mængder af energi og essentielle aminosyrer tilgængelige for cellen [1], [2],.

Nylige undersøgelser har vist, at mTOR (mammalian target of rapamycin) signaltransduktionsvej integrerer disse forskellige signaler, regulering ribosom biogenese og proteinsyntese som funktion af tilgængelig energi og aminosyrer, og sikrer en passende kobling af cellulære proliferation med stigninger i cellestørrelse [1], [2]. MTOR pathway reguleres gennem en kaskade af enzymatiske Phosphoryleringsreaktionerne gennem phosphatidyl-inositol-triphosphat-kinase (PI3K) /proteinkinase B (PKB-Akt1), atypisk proteinkinase C (aPKC), AMP-aktiveret protein kinase (AMPK), hamartin /tuberin (kodet af henholdsvis knolde sklerose kompleks-1 (

TSC1

) og 2 (

TSC2

) gener), ras-homolog beriget i hjernen (Rheb), regulatorisk protein med mTOR (raptor), og pattedyr mål for rapamycin (mTOR). mTOR aktivering fører igen til fosforylering af downstream elementer, der direkte kontrollerer ribosom biogenese og ribosomale mRNA translation for proteinsyntese [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16]. Supplerende figur S1 viser en forenklet ordning for mTOR pathway

Denne tilgang omfatter flere etablerede proto-onkogener (

PI3K, Akt1

) og tumor suppressor gener (

PTEN

. – hvilket reducerer mTOR aktivitet gennem hæmning af

PI3K /Akt1 – TSC1, TSC2

). Disse gener er ofte muteret eller udtrykkes afvigende i humane maligniteter, herunder prostatatumorer [9], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].

Desuden har nyere beviser pegede på en interessant samspil mellem mTOR og p53 veje (gennemgået af Levine et al., 2006) [24]. Der er to store forbindelser mellem disse veje, der fører til ændret reaktion på stress signaler efter aktivering af p53, gennem aktivering af AMPK, TSC2 og en p53 phosphatase, sammensat af en a-4 underenheden og PP2A katalytiske subunit.

Vi antager, at gener i mTOR pathway og gener af p53 vej, der direkte vedrører mTOR kan være centralt impliceret i prostata carcinogenese, og at polymorfe alleler i disse gener kan ændre deres udtryk eller aktivitet, og dermed giver ændret prostatakræft modtagelighed. SNPs i gener der hører til mTOR pathway er allerede blevet undersøgt i forhold til kræftrisiko, med nogle lovende resultater [25], [26], [27].

I denne rapport undersøgte vi den genetiske variation af 67 nøglegener i ovennævnte veje. Vi testede den sammenslutning af 1.084 tagging SNPs med risiko prostatakræft i en case-kontrol undersøgelse indlejret i den europæiske Prospective Investigation ind Cancer and Nutrition (EPIC). Så vidt vi ved er dette den første rapport om polymorfier af disse gener og prostatakræft risiko.

Resultater

Resumé karakteristika undersøgelsens befolkninger er vist i tabel 1. I den første fase af denne undersøgelse vi analyserede 1.084 SNPs i 67 gener, der er involveret i mTOR pathway (som opsummeret i supplerende tabel S1) i 815 prostatakræft tilfælde og 1.266 matchede kontroller. Vi gentaget de bedste hits i en selvstændig population bestående af 838 prostatakræft tilfælde og 943 matchede kontroller.

Genotypning succesrate og kvalitetskontrol

Vi havde 1.163 SNPs på vores GoldenGate array, hvoraf 30 blev inkluderet som kvalitetskontrol og 1.133 var i kandidat-gen regioner af interesse i dette studie. Tredive-fire SNPs blev droppet, fordi de havde et opkald er lavere end 75%, hvilket er normalt tegn på dårlig genotypning kvalitet. Eleven SNP’er (1% af det samlede beløb) viste stærk afgang fra Hardy-Weinberg ligevægt (p 10

-5) og blev derfor ikke analyseret yderligere. Fire SNPs var monomorf i denne population. Dette efterlod i alt 1.084 SNPs (96% af de udvalgte oprindeligt) i de 67 kandidatgener, der skal analyseres

Den gennemsnitlige takst for de 1.084 SNPs anvendes til statistisk analyse var 99,8% (interval 85,2%. – 100%).

Tredive SNP’er blev medtaget, der tidligere var blevet genotypebestemmes på de samme prøver i forbindelse med en anden undersøgelse. Overensstemmelsen af ​​de nye genotyper med de gamle genotyper var 100%.

Vi inkluderede oprindeligt 2.099 prøver, og efter fjernelse fag prøver med en opfordring lavere end 75% (n = 39), havde vi et datasæt, herunder 815 prostatakræft tilfælde og 1.239 kontroller. prøveudtagning Forekomsten tæthed førte til duplikere udvalg af 27 kontroller, således at 1.266 kontroller blev inkluderet i de betingede analyser.

Tilfældig dublerede prøver (-5%) var også inkluderet og overensstemmelsen mellem deres genotyper var 100,0%.

vigtigste virkninger af genotypede SNP’er

Eleven SNPs var signifikant associeret med risiko prostatakræft, ved en tærskel på p 0,01 (p

trend 0,01 eller p

2dF 0,01) ( rs520820 i

GADD45A

; rs546950 og rs4955720 i

PRKCI

, rs706711, rs13156223 og rs831123 i

PIK3R1

; rs6797860 i

TP63

; rs11763144 i

PRKAG2

; rs388372 i

RPS6KA2

; rs13337626 i

TSC2

; rs3783501 i

GADD45B

). Supplerende tabel S2 viser detaljerede resultater for alle 1.084 SNPs.

Replikering

Vi genotypebestemmes de elleve SNPs fra første fase i et ekstra sæt af 838 prostatakræft tilfælde og 943 matchede kontroller. I den anden fase SNP rs546950 i

PRKCI

gen viste en statistisk signifikant sammenhæng med risiko prostatakræft, ved den konventionelle grænse på p. 0,05 (p

2dF = 0,02)

Når vi analyserede i fællesskab resultaterne fra de to prøvesæt, både

PRKCI

SNPs viste en forening med risiko (OR

allel = 0,84, 95% CI = 0,76-0,93, p

2dF = 0,0028 , p

trend = 0,0007 for rs4955720 ELLER

allel = 0,86, 95% CI = 0,78-0,95, p

2dF = 0,0014, p

trend = 0,0020 for rs546950). Resultater for den første fase, replikation sæt og til fælles analyse er vist i tabel 2.

Vi beregnede M

eff værdier for hver kandidat gen separat og for hele undersøgelsen (ved at tilføje den enkelte gen M

eff værdier detaljer er vist i supplerende tabel S3). Den vej hele M

eff var 849. Vi brugte derfor en undersøgelse for hele signifikans p-tærskel på 0,05 /849 = 5,9 × 10

-5. Ved hjælp af denne tærskel, ingen signifikante associationer (p

trend 5.9.x10

-5 eller p

2dF 5,9 × 10

-5) blev observeret mellem nogen af ​​polymorfier genotypede og overordnet prostatakræft risiko.

de to SNPs i

PRKCI

blev også genotypebestemmes i forbindelse med de Cancer genetiske markører af følsomhed (CGEMS) projekt (https://cgems.cancer.gov/), en af de første genom-dækkende forening undersøgelser af prostatakræft modtagelighed. De foreninger, observeret i den første fase af CGEMS (OR

allel = 0,85 p

trend = 0,0024 for rs4955720, OR

allel = 0,94 p

trend = 0,089 for rs546950) svarede til dem observeret i denne rapport. I en meta-analyse ved hjælp af den ubetingede ELLER-estimat fra oplysningerne i den anden fase af vores undersøgelse sammen med resultater fra CGEMS, viste de to SNPs meget lignende resultater som dem, der opnås med EPIC data alene (eller

allel = 0,91 , 95% CI 0,83-0,99, p = 0,029 for rs546950 og OR

allel = 0,87, 95% CI 0,79 til 0,95, p = 0,002 for rs4955720). En meta-analyse udført overvejer de fælles data for den første og anden fase af vores undersøgelse med resultaterne fra CGEMS viste stort set de samme resultater (eller

allel = 0,91, 95% CI 0,84-0,98, p = 0,019 for rs546950 og OR

allel = 0,85, 95% CI 0,78-0,92, p = 0,00016 for rs4955720).

effekter af genotypede SNP’er i undergrupper af sygdom aggressivitet

Vi analyserede sammenslutninger af SNPs med prostatakræft risiko ved at gruppere sager efter sygdom aggressivitet, men vi havde ikke observere statistisk signifikant (p 0,05) heterogenitet mellem lag. Resultater for de elleve SNPs, der blev genotypede på hele datasæt er vist i supplerende tabel S4

Diskussion

mTOR pathway er impliceret i tumor udvikling, og analoger af rapamycin -. Et naturligt antibiotikum, specifikt interfererer med mTOR handling (via en ekstra receptorprotein) – viser meget lovende som potentielle terapeutiske midler til behandling af visse typer af faste tumorer [28], [29], [30]. Vi antager, at gener, der tilhører mTOR pathway kan være centralt impliceret i udvikling af cancer, herunder prostatacancer, og at polymorfe alleler af disse gener kan påvirke risikoen for prostatacancer.

I denne undersøgelse vi grundigt fanget fælles genetisk variation tværs 67 gener i mTOR pathway og til vores viden, er dette den mest omfattende evaluering af fælles og kodning variation i mTOR pathway gener i forhold til risiko prostatakræft. Vi fandt en sammenslutning af to SNPs i

PRKCI

gen, rs546950 og rs4955720, med en nedsat risiko for prostatakræft. Den første SNP viste en forening ved den første screening, i en replikation sæt og i en meta-analyse af vores anden fase med data fra CGEMS, mens rs4955720 viste en forening kun i screeningen sæt og i meta-analysen. Da de to SNPs blev udvalgt som tagging SNPs de ikke er i stærk LD, men vi kan ikke udelukke, at de kan afspejle det samme signal på grund af en moderat underliggende LD (r

2 mellem de to SNP’er er 0,53).

En rolle af genetisk variation i

PRKCI

gen i prostatakræft ætiologi er plausibel, da atypisk protein kinase C lambda /tøddel (aPKCλ /ι), kodet af

PRKCI

gen , er et protein kinase C isoenzym, som spiller multifunktionelle roller i cellulær vedligeholdelse og vækst af epitelceller [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. En af de fysiologiske funktioner af aPKCλ /ι er at mediere insulin-induceret stigning i glucosetransport. Insulin regulerer glucosetransport gennem phosphatidyl-inositol-triphosphat-kinase (PI3K). Distale effektorer af PI3K omfatter proteinkinase B (PKB /Akt) og aPKC isoformer ζ og λ /ι [38].

PKC isozymer er også involveret i celleproliferation, overlevelse, differentiering og apoptose. Undersøgelser af lunge, ovarie, tyktarm og brystkræft har påvist en sammenhæng mellem aPKCλ /ι udtryk og kræft progression og foreslå, at aPKCλ /ι udtryk kunne forudsige dårlig overlevelse [21], [22], [23], [39], [40], [41], [42], [43]. Der er flere rapporter, der viser forbedret aPKCλ /ι udtryk i humane prostatakræft væv, men forholdet mellem aPKCλ /ι og prostatakræft progression fortsat uklart [44], [45]. Desuden eksperimenter ved hjælp af prostatakræft cellelinje DU145 afslørede, at aPKCλ /ι er involveret i væksten af ​​prostatacancer både

in vivo

in vitro

[46]. Overekspression af aPKCλ /ι kan forklares med en forstærkning af den

PRCKI

gen, som er blevet rapporteret i lunge- og æggestokkræft [22], [23], [39] eller forstærkning af kromosom 3q herunder

PRCKI

gen, som er blevet rapporteret i prostata cancer cellelinjer [47]. En anden mulighed er, at aPKCλ /ι udtryk er opreguleret gennem transkriptionelle aktivering af

PRCKI

promotor [48].

I denne rapport fandt vi, at to allele varianter af

PRKCI

genet var forbundet med en undersøgelse-wise signifikant niveau med en nedsat risiko for prostatakræft. rs546950 og rs4955720 ikke ligger i den kodende region af genet, og det er ikke umiddelbart indlysende, hvordan at relatere genetisk variabilitet til genfunktion. Vi søgte offentlige databaser for eventuelle indberettede funktioner i to SNPs, men vi fandt ikke beviser, der peger på en differentieret genekspression eller mRNA stabilitet. Ingen rapport til dato er blevet offentliggjort på enten SNP i forhold til sygdom suceptibility. Vi løb også i silico analyse af de mulige ændringer på trasciption bindingssteder. Disse analyser forudser en differentiel binding til allelerne af de to SNP’er af forskellige transkriptionsfaktorer. Navnlig MYOD1 forudsiges at binde kun den mindre allel (A) af rs546950 og POU3F3 til den mindre allel (A) rs4955720. Begge transkriptionsfaktorer har pro-differentiering, anti-proliferation virkning [49], [50]. Det faktum, at begge binder til de mindre, beskyttende alleler er spændende, selvom MYOD1 og POU3F3 kun er blevet rapporteret til at udøve deres funktion i muskler og i hjernen, hhv. rs546950 er beliggende i den første intron af

PRKCI

, meget tæt på starten af ​​genet, derfor dette er i overensstemmelse med en mulig involvering i reguleringen af ​​transskription af genet. Da variant allel udøver en beskyttende virkning på risikoen prostatakræft kan vi hypotesen, at det nedsætter eller øger evnen af ​​transkriptionsfaktorer til at binde og på en sådan måde, som resulterer i et fald i genekspression og dermed mindske risikoen for prostatacancer.

det er mere vanskeligt at forstå sammenhængen mellem rs4955720 og nedsat risiko for prostatakræft fra et biologisk synspunkt. Men i den fælles analyse af p-værdi på denne SNP var, desto større af de to. Denne SNP er placeret ved 3’af genet, efter afslutningen af ​​den sidste exon, og en mulig funktion er ikke umiddelbart indlysende. Også den mulige forskellen binding med transkriptionsfaktorer synes at være mindre relevant i dette tilfælde. rs4955720 kunne være i høj koblingsuligevægt (LD) med en anden SNP, der direkte påvirker transskription og /eller funktion af

PRKCI

. Men alle kendte fælles

PRKCI

SNPs i høj LD med rs4955720 er placeret i introns af genet, og ikke synes funktionelt relevant. Afslutningsvis er det vanskeligt at forstå den biologiske mekanisme, der kunne forklare foreningen af ​​de to polymorfi med prostatakræft risiko og yderligere funktionelle studier er berettiget.

SNPs på nogle af de PI3K gener, vi undersøgte her blev også undersøgt i Breast og prostatakræft Kohorte Consortium (BPC3) (Koutros 2010). I den undersøgelse rs7556371, at en SNP af

PIK3C2B

, blev vist være forbundet med øget risiko prostatacancer. I vores undersøgelse genotype vi rs4951384, som tags rs7556371 (r

2 = 1), men vi havde ikke observere nogen beviser for association (supplerende tabel S2). har dog skal bemærkes, at stigningen i risiko findes ved Koutros et al var meget beskeden, og kan derfor kun detekteres af en undersøgelse med en enorm stikprøve, såsom BPC3.

Den intensive SNP tagging tilgang anvendes, forudsat en tæt på udtømmende analyse af mulige mono-allel (hovedvirkning) sammenslutninger af prostatakræft risiko med fælles polymorfe varianter kendt for hver af de undersøgte loci. Vi havde tilstrækkelig effekt (0,80 for co-dominant model i den fælles analyse) til at detektere OR = 1,40 (eller OR = 0,71 for foreninger med en reduceret risiko) på alpha = 5,9 × 10

-5 (studere hele signifikans p-tærskel ) for en SNP med en mindre allel frekvens på 0,30.

Selvom over 97% af de EPIC emner skønnes at være af kaukasisk oprindelse, forskelle i allele frekvenser i hele Europa kunne i teorien årsag confounding ved populationsstratificering. Men vi ikke observere store variationer i allelfrekvenserne tværs af lande for SNP studerede her (data ikke vist).

En mulig ulempe ved dette arbejde er det store antal prøvninger, selv om flere hints tyder på en reel association: 1) vi observerede foreninger (p 0,05) i begge trin af undersøgelsen, 2) efter korrektion for antallet af tests (n = 11) udført i den anden fase associationen mellem rs546950 og prostatakræft risiko er fortsat betydelig, 3 ) foreningen er biologisk plausibelt og 4) metaanalysen CGEMS /EPIC (2.743 sager og 3.088 kontroller) viste meget lignende resultater som dem, der opnås med EPIC data alene (p = 0,002 for rs4955720 og p = 0,029 for rs546950.

som konklusion, fandt vi en forening med risiko prostatakræft for to SNPs tilhører

PRKCI

, et gen, der ofte overudtrykt i forskellige kræftformer, herunder prostatakræft. Denne observation garanterer replikation i en større undersøgelse .

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle deltagere underskrevet en informeret skriftligt samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af de etiske anmeldelse bestyrelser Det Internationale Agentur for Kræftforskning, og af de samarbejdende institutioner ansvarlige for emne rekruttering i hver af EPIC rekruttering centre.

EPIC kohorte

En fuldt detaljeret beskrivelse af EPIC kohorte er offentliggjort andetsteds [51]. Kort fortalt EPIC består af omkring 370.000 kvinder og 150.000 mænd i alderen 35-69, rekrutteret mellem 1992 og 2005 i 10 vesteuropæiske lande

Langt de fleste ( 97%). Af emner rekrutteret i EPIC-kohorten er af europæisk ( ‘kaukasisk’) oprindelse. Alle EPIC forsøgspersoner forudsat antropometriske målinger (højde, vægt og talje og hofte omkredse) og omfattende, standardiseret spørgeskema oplysninger om sygehistorie, kost, fysisk aktivitet, rygning og andre livsstilsfaktorer. Omkring 260.000 kvinder og 140.000 mænd forudsat en blodprøve.

Tilfælde af kræft opstår efter ansættelsen i kohorten og bloddonation er identificeret gennem lokale og nationale kræftregistre i 7 af de 10 lande, og i Frankrig, Tyskland, og Grækenland ved en kombination af kontakter med nationale sundhedsforsikringer og /eller aktiv opfølgning gennem forsøgspersonerne eller deres pårørende. Opfølgning på vital status opnås gennem rekord sammenkædning med dødelighedsregistre.

Udvælgelse af case og kontrolpersoner

Case emner blev udvalgt blandt mænd, der har udviklet prostatakræft efter blodprøvetagning. Kontrolpersoner (1-2 kontroller per case) blev udvalgt tilfældigt af stikprøver forekomst tæthed, der matcher de sager for centrum af rekruttering, alder ved bloddonation og varighed af opfølgning. I alt 815 invasive sager prostatakræft og 1.266 kontroller, for i alt 2.081 personer var medtaget i den første fase af den foreliggende undersøgelse. Hver kontrol burde have været fri for kræft op til varigheden af ​​opfølgningen af ​​indekset sagen.

SNP valg

For hver af de 67 kandidatgener vi valgt en genomisk region mellem 5 kb 5 ‘fra begyndelsen af ​​den første kendte exon og 5 kb 3’ i slutningen af ​​den sidste kendte exon. En liste over SNPs i alle 67 genregioner er udarbejdet ved hjælp af data fra HapMap (frigive 22, baseret på dbSNP-version 126 og NCBI genom bygge 36), og tagging SNPs blev udvalgt ved brug af Tagger algoritme [52], som gennemført i den Haploview software. Parametre, der anvendes til Tagger valg var mindre allel frekvens ≥5% i kaukasiere, minimum r

2 = 0,8 mellem hvert par af mærkede og tagging SNPs, parvis tagging (vi observerede gennemsnit betyde r

2 mellem tagging SNPs og SNP’er de tag på 0,95). SNPs, der blev forudsagt at udføre dårligt med Illumina GoldenGate genotype teknologi blev enten erstattet af SNPs i høj LD (r

2 = 0,8, som beregnet ud fra HapMap data), eller slettes fra listen, hvis der ikke proxy var tilgængelig. Dette gav os en liste over 1.133 SNPs. Endelig for kvalitetskontrol formål, vi tilføjet 30 SNPs, der var blevet genotypede på de samme prøver i en uafhængig projekt.

prøveforberedelse og genotype

DNA blev ekstraheret fra blodprøver på et Autopure instrument (Qiagen, Hilden, Tyskland) med Puregene kemi (Qiagen, Hilden, Tyskland). Rækkefølgen af ​​DNA fra cases og kontroller blev randomiseret på PCR-plader for at sikre, at et tilsvarende antal sager og kontroller kunne analyseres samtidigt.

Genotypning blev udført ved hjælp af Illumina GoldenGate teknologi (San Diego, Californien , USA), i overensstemmelse med protokollen angivet af fabrikanten.

data filtrering og statistisk analyse

Enhver prøve, hvor mere end 25% af SNPs mislykkedes havde alle de SNPs sat til manglende og disse emner blev droppet fra analysen. Vi derefter filtrerede data til at fjerne ineffektive SNPs: alle SNPs, der mislykkedes på 25% af prøverne eller flere blev sat til mangler, som var alle SNPs, der viste statistisk signifikant (p 10

-5) afvigelser fra Hardy-Weinberg ligevægt (HWE) blandt kontroller.

Vi analyserede sammenhængen mellem prostatakræft risiko og genotyper for hver SNP hjælp betinget logistisk regression. Genotyper blev kodet enten som tællinger af mindre alleler (trend test) eller som to indikatorvariabler, en for heterozygoter og en for mindre-allelen homozygoter (to frihedsgrader test).

Vi udførte også analyser i undergrupper af sygdom aggressivitet (aggressiv sygdommen blev defineret som extraprostatic forlængelse (fase C /D) eller høj histologisk bedømmelse (Gleason score ≥8).

Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SAS 9.11.

for at tage hensyn til det store antal tests udført i dette projekt, vi beregnet for hvert gen antallet af effektive uafhængige variable, M

eff, ved anvendelse af SNP Spectral Nedbrydning tilgang [53]. vi opnåede et gen-dækkende M

eff værdi for hvert gen og også en undersøgelse for hele M

eff værdi, ved at tilføje op genet M

EFF s.

replikering

Vi gentaget den SNPs viser de stærkeste foreninger med prostatakræft risiko (p

trend 0,01 eller p

2dF 0,01; n = 11) på et ekstra sæt af 838 tilfælde og 943 kontroller valgt i EPIC kohorte. Alle yderligere genotypebestemmelse blev udført ved anvendelse af Taqman assay. MGB Taqman prober og primere blev indkøbt fra Applied Biosystems (Foster City, CA) som præ-designet assays. Reaktionsblandingen indeholdt 10 ng genomisk DNA, 10 pmol af hver primer, 2 pmol hver probe og 2,5 pi 2x Master Mix (Applied Biosystems) i et slutvolumen på 5 pi. Termocyklingen omfattede 40 cykler med 30 sekunder ved 95 ° C efterfulgt af 60 sekunder ved 60 ° C. PCR-plader blev læst på en ABI PRISM 7900HT instrument (Applied Biosystems).

Alle prøver, der ikke giver et pålideligt resultat i den første runde af genotypning blev genfremsat til op til to ekstra runder af genotype. Datapunkter, der stadig ikke er fyldt efter denne procedure, blev tomt. Gentagen kvalitetskontrol genotyper (5% af det samlede beløb) viste en overensstemmelse mellem 100,0%.

Bioinformatik analyse

Potentielle bindingssteder for transkriptionsfaktorer i sekvensen omfatter de to studie-wise signifikant associeret SNPs blev udført med Matlnspector Professional (https://genomatix.de/cgi-bin/matinspector_prof/mat_fam.pl) [54].

Støtte oplysninger

figur S1.

Cartoon af mTOR pathway

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s001

(PNG)

tabel S1.

Kandidat gener og deres SNPs

Doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s002

(DOC)

tabel S2.

vigtigste virkninger af 1.084 SNP’er genotypede i den første fase. Kolonner i denne tabel viser: gen navn, NCBI dbSNP rs nummer, antal sager og styringer til hver af de tre genotyper, odds ratio for heterozygoter, homozygote for den sjældne allel (henvist til de homozygote for den fælles allel) og pr allel, med 95% konfidensinterval, p-værdi af testen med to indikatorvariabler (2 df test), p-værdi af den tendens test

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s003

(XLS)

tabel S3.

M

eff for hvert gen i undersøgelsen

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s004

(XLS)

Tabel S4. Salg Analyser i undergrupper af sygdom aggressivitet. Kolonner i denne tabel viser: gen navn, NCBI dbSNP rs nummer, mulige genotyper, antal sager og styringer til hver af de tre genotyper, odds ratio for heterozygoter og for homozygote for den sjældne allel (nævnt de homozygote for den fælles allel) , med 95% konfidensinterval, Cochran Q-parameter, jeg

2 statistik, p-værdi af testen for heterogenitet, p-værdi af den tendens test for hvert stratum, navn stratum

doi:. 10,1371 /journal.pone.0016914.s005

(XLS)